Embriyonik Gün 12.5 ve 8 Haftalık Farelerin Dil Epitel ve Mezenkim/Bağ Dokusundan Hücre Ayrışması

Özet

Embriyonik ve yetişkin fare dillerinin epitel ve mezenkim/bağ dokusundan çok miktarda yüksek kaliteli tek hücreyi ayrıştırmak için genelleştirilmiş bir protokol geliştirdik.

Özet

Hücre ayrışması, birey-hücre düzeyinde ve/veya hücre popülasyonu düzeyinde (örneğin, tek hücreli RNA dizilimi ve birincil hücre kültürü) çalışmalar için önemli bir prosedür olmuştur. Büyük miktarlarda uygulanabilir, sağlıklı hücreler elde etmek kritik öneme sahiptir ve bunu yapmak için en uygun koşullar dokuya bağlıdır. Dil epitel ve alttaki mezenkim/bağ dokusundaki hücre popülasyonları heterojendir ve doku yapıları farklı bölgelerde ve farklı gelişim evrelerinde farklılık gösterir. Erken gelişimsel [embriyonik gün 12.5 (E12.5)] ve genç yetişkin (8 haftalık) evrelerde fare dili epitel ve mezenkim/bağ dokusundan hücreleri izole etmek için protokolleri test ettik. Epitel ve alttaki mezenkim/bağ dokusu arasında temiz bir ayrım yapmak kolaydı. Bununla birlikte, hücreleri daha fazla işlemek ve izole etmek, büyük miktarlarda uygulanabilir sağlıklı hücreler elde etmek ve enzimatik sindirim tamponunun dikkatli seçimi, kuluçka süresi ve santrifüj hızı ve zamanı kritiktir. 37 °C'de 30 dakika boyunca %0,25 Trypsin-EDTA'da ayrılmış epitel veya alttaki mezenkime/bağ dokusunun inkübasyonu, ardından 8 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleme yüksek canlılık oranında (%>90) yüksek hücre verimi ile sonuçlandı. fare aşamaları ve dil bölgeleri ne olursa olsun. Ayrıca, embriyonik ve yetişkin dillerinden hem ayrışmış epitel hem de mezenkimal/bağ dokusu hücrelerinin hücre kültürüne dayalı ortamda hücre canlılığında önemli bir azalma olmadan en az 3 saat hayatta kalabileceğini bulduk. Protokoller, erken gelişimsel (E12.5) ve farklı doku bölmelerinden hücre ayrışması gerektiren genç yetişkin (8 haftalık) aşamalarda fare dillerinden izole hücrelerin hazırlanmasını gerektiren çalışmalar için yararlı olacaktır.

Giriş

Memeli dili tat, konuşma ve gıda işleme için kritik olan karmaşık bir organdır. Mezenkime/bağ dokusu ile bölümlere ayrılmış ve tat papilla ve tat tomurcukları içeren tabakalı bir epitel levha ile kaplanmış çok sayıda yüksek organize doku türünden oluşur. Hem dil epitel hem de mezenkim/bağ dokusundaki hücre popülasyonları heterojendir. Dildeki belirli bir hücre türünün işlevlerini ve dağılımını daha iyi anlamak için, ayrışmış hücrelerin kullanılarak yapılan çalışmalar gereklidir. Örneğin, tek hücreli RNA dizilimi, tek hücreli çözünürlükte karmaşık dokunun transkriptom'u anlamak için tasarlanmış, tek tek hücreli hücrelerde transkriptomik profil oluşturma için güçlü ve yüksek aktarım hızına sahip bir^yöntemdir. Birincil hücre kültürünün, tat tomurcukları için kök/ progenitör hücrelerin işlevini ve farklılaşmasını incelemek için yararlı bir araç olduğu kanıtlanmıştır^5,6. Bu çalışmalar çok miktarda yüksek kaliteli izole hücre popülasyonu gerektirir (örneğin, uygun konsantrasyon ve yüksek canlılık ile yeterli toplam hücre sayısı).

Bu nedenle, lingual dokuların farklı bölgelerinden ve farklı gelişim aşamalarında hücreleri izole etmeye ihtiyaç vardır. Şu anda, dil epitelinden ve alttaki mezenkim/ bağ dokusundan hücre ayrışması için ayrıntılı bir protokol bulunmamaktadır. Burada, hücreleri tek hücreli RNA dizilimi ve birincil kök hücre kültürleri gibi yüksek kalitede canlı hücreler gerektiren deneylere hazırlamak için optimize edilmiş bir hücre ayrıştırma yöntemi rapor ediyoruz. Enzimatik sindirim tamponu seçimi, nazik pipetleme, resüspenzyon ortamının seçimi ve bu büyük miktarlarda yüksek kaliteli hücre üretmek için optimum santrifüj süresi ve hızının çok önemli olduğunu gördük.

Protokol

Hayvan kullanımı (çalışma boyunca C57BL/6 fareler) Georgia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve hayvanların bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Yönergeleri Enstitüleri'ne uygundu.

1. Hayvan kullanımı

NOT: Fareler, Gürcistan Üniversitesi Hayvan ve Süt Bilimi bölümünün hayvan tesisinde 12-h gündüz/gece döngüleri altında 22 °C'de yetiştirildi ve bakımı yapıldı.

1. Farelerde vajinal tıkaç tespiti gününün öğlenini embriyonik (E) gün 0.5 olarak belirleyin. Aşağıdaki deneyler için E12.5'te embriyoları ve 8 haftalık doğum sonrası fareleri kullanın.

2. Deneyden önce hazırlık

NOT: Bu protokol için gerekli olan araçlar Malzeme Tablosundalistelenmiştir.

1. Deneyden önce otoklav aletleri. Deney sırasında bir boncuk sterilizatörü kullanarak aletleri sterilize edin.
2. %70 etanol mendil kullanarak cerrahi bölgeyi, diseksiyon mikroskobu ve biyogüvenlik kabinini temizleyin. Biyogüvenlik kabininin UV ışığını açın ve deneysel prosedürden önce 20 dakika boyunca açık tutun.
3. Sırasıyla 2,5 ve 1,0 mg/mL'lik son konsantrasyona 1:1 dispaz (5,0 mg/mL) ve kollajenaz (2,0 mg/mL) enzim karışımı hazırlayın ve çözeltiyi 0,22 μm şırıng filtresi⁷kullanarak filtreleyin.
   1. Yetişkin bir dil için 1 mL enzim karışımı veya belirli bir dil bölgesi (ör. posterior veya ön dil) için 0,5 mL hazırlayın.
   2. Embriyonik diller için 2 mL enzim karışımı hazırlayın.
4. 0,1 M PBS'de %2,5 BSA'nın 10 mL'sini yapın ve çözeltiyi 1 mL şırınna ve 0,22 μm şırınna filtresi kullanarak filtreleyin.
5. DMEM/F12'de %5 FBS'nin 500 μL'sini yapın.
6. %10 FBS ve %1 BSA içeren 3 mL DMEM/F12 yapın ve çözeltiyi 1 mL şırınna ve 0,22 μm şırınna filtresi kullanarak filtreleyin.

3. Dil epitelinin mezenkim/alttaki bağ dokusundan ayrılması

1. Epitelinin bir E12.5 fare dilinin mezenkiminden ayrılması
   1. Ötenazi, E12.5 embriyosu taşıyan hamile dişi fareleri bir CO₂ odasına ve ardından servikal çıkıklara yerleştirerek zamanlanmıştır.
      NOT: E12.5'teki fare embriyoları, hamile dişi farelerde vajinal tıkaç tespit edildikten sonra 12.
   2. Fareleri cerrahi bölgeye aktarın. Kürkün çalışma alanına girmesini önlemek için% 70 etanol kullanarak fare karnını ıslatın.
   3. Embriyo taşıyan rahim boynuzlarını ortaya çıkarmak için diseksiyon makası kullanarak karnı açın. Rahim boynuzlarını diseksiyon makası kullanarak parçalara aktarın ve 100 mm'lik bir kültür çanağına 15 mL taze Tyrode çözeltisine aktarın.
   4. Embriyoları ( Şekil1A 1) rahim boynuzlarından mini makas ve ince etops kullanarak bir diseksiyon mikroskobu altında parçalara ayrıştırın.
   5. İnce önseziler kullanarak ağız boşluğunu dikkatlice açın ve mini makas kullanarak dili mandibuladan sökün (Şekil 1A₂).
   6. Dilleri 15 mL taze steril Tyrode çözeltisini 100 mm'lik bir kültür kabında yıkayın.
   7. Dokuları, biyogüvenlik kabininde spatula ve ince tokmaklar bulunan 35 mm'lik bir kültür çanasında dispaz (2,5 mg/mL) ve kollajenaz (1,0 mg/mL) enzim karışımına 2 mL'ye aktarın. 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yaslanın.
   8. Dilleri 100 mm'lik bir kültür çanağına 15 mL taze steril Tyrode çözeltisine aktarın ve ince forsepsler kullanarak mezenkimi epitelden hafifçe çıkarın.
      NOT: Epitel levhalar inkübasyon sırasında mekanik kuvvet olmadan ayrılabilir.
   9. Ayrılmış epitel ve mezenkimleri 15 mL taze steril Tyrode çözeltisinde 100 mm'lik bir kültür tabağında iki kez yıkayın.
      NOT: Hücre ayrışması prosedüründe dispaz ve kollajenaz aktiviteleri EDTA tarafından inhibe edilecektir (adım 4.1).
2. Dil epitelinin yetişkin farelerin alttaki bağ dokusundan ayrılması
   1. Fareyi 8 haftalıkken co₂ haznesine yerleştirerek ötenazi yaptırın. Farenin nefessiz ve önceden çimdikleme yanıtı olmadan ötenazi yaptığını onaylayın.
   2. Fareleri cerrahi bölgeye aktarın. Kürkün ağız boşluğuna girmesini önlemek için% 70 etanol kullanarak fare kafasını ıslatın.
   3. Ağız boşluğunu açmak için kesme makası kullanarak ağız köşelerini yanak boyunca kesin. Dili mandibula ile parçalara bölün (Şekil 1B₁) ve plastik bir tabakaya plastik bir sargı tabakası ile yerleştirin.
   4. Dili bir diseksiyon mikroskobu altında tutmak için cerrahi epoplar kullanarak, dilin epitel altı boşluğuna dispaz (2,5 mg/mL) ve kollajenaz (1,0 mg/mL) enzim karışımını arka dilin kesme kenarından(Şekil 1B₁, oklar) enjekte edin.
      1. Hem ön hem de arka dilden doku toplanması için tüm dil için 1 mL enzim karışımını eşit olarak enjekte edin.
      2. Dil ucundan doku toplanması için ön dile veya circumvallate papilla doku koleksiyonu için arka dil için lokal olarak 0,5 mL enzim karışımı enjekte edin.
         NOT: Enzim biriktikçe dil şişer (Şekil 1B₂). Enzimin nazik enjeksiyonu, basıncın epitellere zarar vermesini önleyebilir ve dilde mümkün olduğunca fazla enzim tutabilir.
   5. Dili plastik sargı ile sarın ve dili 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
   6. Dil ucunu ve/veya circumvallate papillayı parçalamak için mini makas kullanın ve 100 mm'lik bir kültür çanağına 15 mL taze steril Tyrode çözeltisine doku aktarmak için spatula ve ince forseps kullanın.
   7. Epitelleri, mini makas kullanarak enzimle sindirilen alt epitel uzayındaki alttaki bağ dokusundan ayırın. Aşağı akış deneylerinin ihtiyacına göre dokuları uygun bir boyuta kırpın.
   8. Ayrılmış epitel ve alttaki bağ dokusunu 15 mL taze steril Tyrode çözeltisinde 100 mm'lik bir kültür kabında iki kez yıkayın.
      NOT: Hücre ayrışması prosedüründe dispaz ve kollajenaz aktiviteleri EDTA tarafından inhibe edilecektir (adım 4.1).

4. Hücre ayrışması

NOT: Burada açıklanan hücre ayrışma protokolü hem E12.5 embriyonik hem de 8 haftalık farelerde dil epitel ve mezenkim/bağ dokusuna uygulanabilir. Hücre süspansiyonunun ajitasyonu ve transferi sırasında hücre kaybını azaltmak için, pH 7.4^8'de0.1 M PBS'de% 2.5 BSA ile ticari düşük tutma pipet uçları veya önceden kaplanmış pipet uçları kullanın.

1. Spatula ve ince forseps kullanarak dokuları 37 °C'de 30 dakika boyunca yeni bir 35 mm kültür çanağıyla % 0,25 trypsin-EDTA'nın 3 mL'sine aktarın. 1 mL pipet uçları ile her 5 dakikada bir dokuları hafifçe çalkalayın.
   NOT: Kesme kenarı ayrışmış hücrelere fiziksel olarak zarar verebileceği için pipet ucunu kesmeyin.
2. Reaksiyonu durdurmak ve ortamı 5 mL düşük bağlayıcı santrifüj tüpüne aktarmak için DMEM/F12'ye 500 μL%5 FBS ekleyin.
3. Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj hücre süspansiyonu ve süpernatantı çıkarın.
4. 1 mL pipet uçları kullanarak % 10 FBS ve% 1 BSA içeren 3 mL DMEM / F12'deki hücreleri yavaşça yeniden askıya alın ve hücreleri 70 μm hücre süzgeci ve ardından 35 μm hücre süzgeci kullanarak filtreleyin.
5. Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj hücre süspansiyonu. Ortamın çoğunu çıkarın ve hücreleri yeniden askıya almak için son hacim olarak 50-300 μL bırakın.
   NOT: Tek hücreli süspansiyonun son hacmini değiştirerek hücrelerin konsantrasyonlarını aşağı akış deneylerinin gereksinimlerine göre ayarlayın.

5. Hemositometre kullanılarak hücre sayımı ve uygulanabilirlik testi

NOT: Ölçüm doğruluğunu artırmak için her numune için 3 teknik çoğaltma önerilir.

1. Tek hücreli süspansiyonun 5-10 μL'lik kısmını eşit hacimde Trypan mavisi ile hafifçe karıştırın ve hemositometreye ekleyin.
   NOT: Kullanmadan önce hemositometreyi %70 etanol kullanarak iyice temizleyin. Hemositometredeki toz parçacıkları koyu mavi renkte boyanacak ve canlılık testinin doğruluğunu etkileyecektir. Hemositometreyi mikroskop altında kontrol edin.
2. Görüntüleme sistemi ile ters mikroskop kullanarak 16 ızgaralı 4 karede sırasıyla Trypan mavisi(Şekil 2, oklar) ile boyanmış toplam hücre sayısını, canlı hücre sayısını(beyaz)ve ölü hücre sayısını (koyu mavi) sayın.
3. Hücre konsantrasyonu hesaplayın:
   Hücre konsantrasyonu =
   1. Uygulanabilirliği hesaplayın:
      Yaşayabilirlik =

Sonuçlar

Dil epitelinin alttaki mezenkim/bağ dokusundan ayrılması
Embriyonik fare dilinde, uygun enzim sindiriminden sonra epitel altı boşlukta bir boşluk görülür. Bazı dillerin epitel levhaları inkübasyon sırasında mekanik kuvvet olmadan ayrılır.

Yetişkin fare dilinde, enjekte edilen bölgelerdeki şişlik ile başarılı bir enzim enjeksiyonu belirtilir (Şekil 1B₂), bu da enzimin dil tarafından tutulabile...

Tartışmalar

Bugüne kadar, dil epitelinden ve alttaki mezenkim/ bağ dokusundan hücre ayrışması için ayrıntılı bir protokol mevcut olmamıştır. Bu geçerli hücre ayrıştırma protokolü, yüksek hücre canlılığı (%>90) olan tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için tekrarlanabilir bir yordam sağlar E12.5 ve yetişkin farelerden izole edilmiş hücreler farklı olsa da hem embriyonik hem de doğum sonrası evrelerde epitel levhalar ve mezenkim/bağ dokuları da dahil olmak üzere fare dili dokularından. Örneğ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
bovine serum albumin (BSA)	Gold Biotechnology	A-420-100
C57BL/6 mouse (C57BL/6J)	The Jackson Laboratory	000664
collagenase (Collagenase A)	Sigma-Aldrich	10103586001
culture dish (35 mm in diameter)	Genesee Scientific	32-103G
culture dish (100 mm in diameter)	Genesee Scientific	32-107G
dispase (Dispase II)	Sigma-Aldrich	04942078001
dissecting scissors (Student Fine Scissors)	Find Science Tool	91460-11
DMEM/F12	Gibco	11320033
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	C838U82
fine forceps (Dumount #3 Forceps)	Find Science Tool	11293-00
hemocytometer	Hausser Scientific	3520
inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System)	Life Technologies	AMEX1000
low retention pipette tips	METTLER TOLEDO	17014342
mini-scissors (Evo Spring Scissors)	Fine Science Tool	15800-01
plastic warp	VWR	46610-056
spatula (Moria Spoon)	Fine Science Tool	10321-08
surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps)	Fine Science Tool	11223-20
Trypan blue	Gibco	15250061
Tyrode’s solution	Sigma-Aldrich	T2145-10L	made from Tyrode's salts
0.25% typsin-EDTA	Gibco	25200056
0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Hoefer	33946	made from 1 M PBS
0.22-μm syringe filter	Genesee Scientific	25-243
70% ethanol	Koptec	233919	made from 100% ethanol
1-mL syringe	BD	8194938
5-mL low binding microcentrifuge tube	Eppendorf	30122348
30-G needle	BD	9193532
35-μm cell strainer	Falcon	64750
70-μm cell strainer	Falcon	64752