Dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima/tessuto connettivo dei topi embrionali di 12,5 e 8 settimane

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un protocollo generalizzato per dissociare una grande quantità di singole cellule di alta qualità dall'epitelio e dal mesenchima / tessuto connettivo delle lingue del topo embrionali e adulte.

Abstract

La dissociazione cellulare è stata una procedura essenziale per gli studi a livello di singola cellula e/o a livello di popolazione cellulare (ad esempio, sequenziamento dell'RNA a singola cellula e coltura cellulare primaria). Produrre cellule vitali e sane in grandi quantità è fondamentale e le condizioni ottimali per farlo sono dipendenti dai tessuti. Le popolazioni cellulari nell'epitelio della lingua e nel mesenchima sottostante /tessuto connettivo sono eterogenee e le strutture tissutali variano in diverse regioni e in diversi stadi di sviluppo. Abbiamo testato protocolli per isolare le cellule dall'epitelio della lingua del topo e dal mesenchima / tessuto connettivo nelle prime fasi di sviluppo [giornata embrionale 12.5 (E12.5)] e giovani adulti (8 settimane). Una separazione netta tra l'epitelio e il mesenchima/tessuto connettivo sottostante era facile da realizzare. Tuttavia, per elaborare e isolare ulteriormente le cellule, producendo cellule sane vitali in grandi quantità e un'attenta selezione del buffer di digestione enzimatica, del tempo di incubazione e della velocità e del tempo di centrifugazione sono fondamentali. L'incubazione di epitelio separato o mesenchima/tessuto connettivo sottostante nello 0,25% di tripsiderina-EDTA per 30 min a 37 °C, seguita da centrifugazione a 200 x g per 8 min ha portato a un alto rendimento delle cellule ad un alto tasso di vitalità (>90%) indipendentemente dalle fasi del mouse e dalle regioni della lingua. Inoltre, abbiamo scoperto che sia le cellule del tessuto epiteliale dissociato che mesenchimale /connettivo dalle lingue embrionali e adulte potrebbero sopravvivere nel mezzo a base di coltura cellulare per almeno 3 ore senza una significativa diminuzione della vitalità cellulare. I protocolli saranno utili per studi che richiedono la preparazione di cellule isolate dalle lingue del topo nelle prime fasi di sviluppo (E12.5) e giovani adulti (8 settimane) che richiedono la dissociazione cellulare da diversi compartimenti tissutali.

Introduzione

La lingua dei mammiferi è un organo complesso critico per il gusto, il parlare e la lavorazione degli alimenti. È composto da più tipi di tessuti altamente organizzati compartimentati da mesenchima / tessuto connettivo e coperti da un foglio epiteliale stratificato contenente papille gustative e papille gustative. Le popolazioni cellulari sia nell'epitelio della lingua che nel mesenchima/tessuto connettivo sono eterogenee. Per comprendere meglio le funzioni e la distribuzione di un particolare tipo di cellule nella lingua, sono necessari studi utilizzando cellule dissociate. Ad esempio, il sequenziamento dell'RNA a singola cella è un metodo potente e ad alta produttività per la profilazione trascrittamica nelle singole cellule, progettato per comprendere il trascrittame del tessuto complesso con una risoluzione a singola cellula^1,2,3,4. La coltura cellulare primaria si è dimostrata uno strumento utile per studiare la funzione e la differenziazione delle cellule staminali/progenitrici per le papille^{gustative 5,6}. Questi studi richiedono una grande quantità di popolazioni cellulari isolate di alta qualità (ad esempio, numero totale sufficiente di cellule con concentrazione adeguata e alta vitalità).

Pertanto, è necessario isolare le cellule da diverse regioni dei tessuti linguali e in diverse fasi di sviluppo. Attualmente, non esiste un protocollo dettagliato disponibile per la dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima /tessuto connettivo sottostante. Qui, reportiamo un metodo di dissociazione cellulare ottimizzato per preparare le cellule per esperimenti che richiedono un'alta qualità di cellule vive come per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e le colture primarie di cellule staminali. Abbiamo scoperto che la selezione del tampone di digestione enzimatica, la pipettazione delicata, la selezione del mezzo di resuspensione e il tempo e la velocità di centrifugazione ottimali sono cruciali per generare queste grandi quantità di cellule di alta qualità.

Protocollo

L'uso degli animali (topi C57BL/6 durante tutto lo studio) è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Georgia ed è stato in conformità con le Linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali per la ricerca.

1. Uso animale

NOTA: I topi sono stati allevati e mantenuti nella struttura animale del dipartimento di scienze animali e lattiero-casearie dell'Università della Georgia a 22 °C sotto i cicli giorno/notte di 12 ore.

1. Designare mezzogiorno del giorno di rilevamento della spina vaginale nei topi come giorno embrionale (E) 0,5. Utilizzare embrioni a E12.5 e topi postnatali a 8 settimane di età per i seguenti esperimenti.

2. Preparazione prima dell'esperimento

NOTA: Gli strumenti necessari per questo protocollo sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Strumenti autoclave prima dell'esperimento. Sterilizzare gli strumenti utilizzando uno sterilizzatore di perline durante l'esperimento.
2. Pulire l'area chirurgica, il microscopio sezionato e l'armadio per la biosicurezza utilizzando il 70% di salviette di etanolo. Accendere la luce UV dell'armadio di biosicurezza e tenerla in funzione per 20 minuti prima della procedura sperimentale.
3. Preparare una miscela enzimatica di 1:1 dispasi (5,0 mg/ml) e collagenasi (2,0 mg/ml) ad una concentrazione finale rispettivamente di 2,5 e 1,0 mg/ml e filtrare la soluzione utilizzando il filtro siringa da 0,22 μm⁷.
   1. Preparare 1 mL di miscela enzimatica per una lingua adulta o 0,5 mL per una regione specifica della lingua (ad esempio, lingua posteriore o anteriore).
   2. Preparare 2 mL di miscela enzimatica per le lingue embrionali.
4. Effettuare 10 ml di BSA al 2,5% in 0,1 M PBS e filtrare la soluzione utilizzando una siringa da 1 ml e un filtro siringa da 0,22 μm.
5. Fare 500 μL di FBS al 5% in DMEM/F12.
6. Effettuare 3 ml di DMEM/F12 contenenti 10% FBS e 1% BSA e filtrare la soluzione utilizzando una siringa da 1 ml e un filtro siringa da 0,22 μm.

3. Separazione dell'epitelio della lingua dal mesenchima/tessuto connettivo sottostante

1. Separazione dell'epitelio dal mesenchima di una lingua del topo E12.5
   1. Eutanasia topi femmine gravidi a tempo che trasportano embrioni E12.5 posizionandolo in una camera di CO_{2 seguita} da lussazione cervicale.
      NOTA: Gli embrioni di topo a E12.5 vengono raccolti dopo le 12:00 (pomeriggio) del 12 ° giorno dopo il rilevamento della spina vaginale nei topi femmine in gravidanza.
   2. Trasferire i topi nell'area chirurgica. Bagnare l'addome del topo usando il 70% di etanolo per evitare che la pelliccia entra nel sito operativo.
   3. Aprire l'addome usando forbici sezionanti per esporre le corna uterine che trasportano embrioni. Sezionare le corna uterine utilizzando forbici sezionanti e trasferirlo a 15 mL di soluzione di Tirolo fresco in un piatto da coltura da 100 mm.
   4. Sezionare gli embrioni (Figura 1A₁) dalle corna uterina sotto un microscopio sezionante utilizzando mini-forbici e forcep fini.
   5. Aprire accuratamente la cavità orale ampia utilizzando forcep fini e sezionare la lingua dalla mattiera utilizzando mini-forbici (Figura 1A₂).
   6. Lavare le lingue utilizzando 15 mL di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto da coltura da 100 mm.
   7. Trasferire i tessuti a 2 mL di miscela enzimatica di dispasi (2,5 mg/mL) e collagenasi (1,0 mg/mL) in un piatto di coltura da 35 mm con spatola e forceps fini in un armadio di biosicurezza. Incubare per 20 min a 37 °C.
   8. Trasferire le lingue a 15 mL di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto di coltura da 100 mm e rimuovere delicatamente il mesenchima dall'epitelio dal lato ventrale utilizzando forcep fini.
      NOTA: I fogli epiteliali possono essere separati senza forza meccanica durante l'incubazione.
   9. Lavare due volte l'epitelia separata e il mesenchima in 15 mL di soluzione di Tyrode sterile fresco in un piatto da coltura da 100 mm.
      NOTA: Le attività della dispasi e della collagenasi saranno inibite dall'EDTA nella procedura di dissociazione cellulare (fase 4.1).
2. Separazione dell'epitelio della lingua dal tessuto connettivo sottostante dei topi adulti
   1. Eutanasia il topo a 8 settimane di età posizionandolo in una camera di CO_2. Confermare che il mouse è eutanasiato senza respiri e risposta forepaw-pinch.
   2. Trasferire i topi nell'area chirurgica. Bagnare la testa del topo usando il 70% di etanolo per evitare che la pelliccia entra nella cavità orale.
   3. Tagliare gli angoli della bocca lungo la guancia usando forbici sezionanti per aprire la cavità orale. Sezionare la lingua con mattiglia(Figura 1B₁) e posizionare in un piatto di plastica con uno strato di involucro di plastica.
   4. Utilizzando le forcep chirurgiche per tenere la lingua al microscopio sezionato, iniettare la miscela enzimatica di dispasi (2,5 mg/mL) e collagenasi (1,0 mg/mL) nello spazio sub-epiteliale della lingua attraverso il tagliente(Figura 1B₁, frecce) della lingua posteriore.
      1. Iniettare 1 mL di miscela enzimatica uniformemente a tutta la lingua per la raccolta dei tessuti sia dalla lingua anteriore che posteriore.
      2. Iniettare 0,5 mL di miscela enzimatica localmente alla lingua anteriore per la raccolta dei tessuti dalla punta della lingua o alla lingua posteriore per la raccolta circonvallata dei tessuti di papilla.
         NOTA: La lingua si gonfierà man mano che l'enzima si accumula(Figura 1B₂). L'iniezione delicata dell'enzima può impedire che la pressione danneggi l'epitelio e mantenere il maggior enzima possibile nella lingua.
   5. Avvolgere la lingua con un involucro di plastica e incubare la lingua per 30 minuti a 37 °C.
   6. Utilizzare mini-forbici per sezionare la punta della lingua e / o la papilla circonvallata e utilizzare spatole e forcelle fini per trasferire i tessuti a 15 mL di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto di coltura da 100 mm.
   7. Separare l'epitelio dal tessuto connettivo sottostante nello spazio sub-epiteliale digerito dall'enzima usando mini-forbici. Tagliare i tessuti a una dimensione adeguata in base al requisito degli esperimenti a valle.
   8. Lavare l'epitelio separato e il tessuto connettivo sottostante due volte in 15 mL di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto di coltura da 100 mm.
      NOTA: Le attività della dispasi e della collagenasi saranno inibite dall'EDTA nella procedura di dissociazione cellulare (fase 4.1).

4. Dissociazione cellulare

NOTA: Il protocollo di dissociazione cellulare qui descritto può essere applicato all'epitelio della lingua e al mesenchima / tessuto connettivo sia nei topi embrionali E12.5 che in quello di 8 settimane. Per ridurre la perdita di cellule durante l'agitazione e il trasferimento delle sospensioni cellulari, utilizzare punte commerciali a bassa ritenzione o punte di pipetta pre-rivestite con BSA al 2,5% in 0,1 M PBS a pH 7,4⁸.

1. Trasferire i tessuti utilizzando spatola e forcelle fini a 3 mL dello 0,25% di tripsiderina-EDTA in un nuovo piatto da coltura da 35 mm per 30 min a 37 °C. Agitare delicatamente i tessuti ogni 5 minuti con punte di pipetta da 1 mL.
   NOTA: Non tagliare la punta della pipetta, poiché il tagliente può danneggiare fisicamente le cellule dissociate.
2. Aggiungere 500 μL di FBS al 5% in DMEM/F12 per interrompere la reazione e trasferire il mezzo in un tubo di centrifuga a bassa legatura da 5 ml.
3. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 8 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernatante.
4. Sospendere delicatamente le cellule in 3 mL di DMEM/F12 contenenti 10% FBS e 1% BSA utilizzando punte di pipetta da 1 mL e filtrare le cellule utilizzando un colino cellulare da 70 μm, seguito da un colino cellulare da 35 μm.
5. Sospensione della cella di centrifuga a 200 x g per 8 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la maggior parte del mezzo e lasciare 50-300 μL come volume finale per sospendere di nuovo le celle.
   NOTA: Regolare la concentrazione delle cellule in base alle esigenze degli esperimenti a valle modificando il volume finale della sospensione a singola cella.

5. Test di conteggio cellulare e vitalità con emocitometro

NOTA: Per migliorare la precisione di misura, sono consigliate 3 repliche tecniche per ogni campione.

1. Mescolare delicatamente 5-10 μL della sospensione a singola cella con un volume uguale di blu Trypan e aggiungere all'emocitometro.
   NOTA: Pulire accuratamente l'emocitometro utilizzando il 70% di etanolo prima dell'uso. Le particelle di polvere sull'emocitometro saranno macchiate di blu scuro e influenzeranno l'accuratezza del test di vitalità. Controllare l'emocitometro al microscopio.
2. Contare il numero totale di celle, il numero di celle vive (bianche) e il numero di celle morte (blu scuro) macchiate rispettivamente da Trypan blue (Figura 2, frecce) in 4 quadrati con 16 griglie (Figura 2) utilizzando il microscopio invertito con sistema di imaging.
3. Calcolare la concentrazione cellulare:
   Concentrazione cellulare =
   1. Calcola la fattibilità:
      Vitalità =

Risultati

Separazione dell'epitelio della lingua dal mesenchima/tessuto connettivo sottostante
Nella lingua embrionale del topo, uno spazio nello spazio sub-epiteliale è visibile dopo una corretta digestione enzimatica. I fogli epiteliali di alcune lingue sono separati senza forza meccanica durante l'incubazione.

Nella lingua adulta del topo, un'iniezione enzimatica di successo è indicata dal gonfiore nelle aree iniettate (Figura 1B₂...

Discussione

Ad oggi, non è stato disponibile un protocollo dettagliato per la dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima /tessuto connettivo sottostante. Questo protocollo di dissociazione cellulare corrente fornisce una procedura riproducibile per generare una sospensione a singola cella con un'elevata vitalità cellulare (>90%) dai tessuti della lingua del topo, compresi i fogli epiteliali e i tessuti mesenchima/connettivi sia allo stadio embrionale che postnatale, anche se le cellule isolate di E12,5 e t...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
bovine serum albumin (BSA)	Gold Biotechnology	A-420-100
C57BL/6 mouse (C57BL/6J)	The Jackson Laboratory	000664
collagenase (Collagenase A)	Sigma-Aldrich	10103586001
culture dish (35 mm in diameter)	Genesee Scientific	32-103G
culture dish (100 mm in diameter)	Genesee Scientific	32-107G
dispase (Dispase II)	Sigma-Aldrich	04942078001
dissecting scissors (Student Fine Scissors)	Find Science Tool	91460-11
DMEM/F12	Gibco	11320033
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	C838U82
fine forceps (Dumount #3 Forceps)	Find Science Tool	11293-00
hemocytometer	Hausser Scientific	3520
inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System)	Life Technologies	AMEX1000
low retention pipette tips	METTLER TOLEDO	17014342
mini-scissors (Evo Spring Scissors)	Fine Science Tool	15800-01
plastic warp	VWR	46610-056
spatula (Moria Spoon)	Fine Science Tool	10321-08
surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps)	Fine Science Tool	11223-20
Trypan blue	Gibco	15250061
Tyrode’s solution	Sigma-Aldrich	T2145-10L	made from Tyrode's salts
0.25% typsin-EDTA	Gibco	25200056
0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Hoefer	33946	made from 1 M PBS
0.22-μm syringe filter	Genesee Scientific	25-243
70% ethanol	Koptec	233919	made from 100% ethanol
1-mL syringe	BD	8194938
5-mL low binding microcentrifuge tube	Eppendorf	30122348
30-G needle	BD	9193532
35-μm cell strainer	Falcon	64750
70-μm cell strainer	Falcon	64752