Hücrelerde Protein Arginin Metiltransfenaz 1-9 Aktivitesini Incelemek için Nicel Yöntemler

Özet

Bu protokoller, protein arginin metiltransfenaz (PRMT) ailesinin bireysel üyelerinin hücrelerdeki enzymatic aktivitesini değerlendirmek için kullanılan metodolojiyi sağlar. Prmt aktivitesinin endojen ve eksojen biyobelirteçler kullanılarak değerlendirilmesi, metil-arginin tanıma antikorları ve inhibitör takım bileşikleri ile ilgili ayrıntılı yönergeler açıklanmıştır.

Özet

Protein metiltransfenazlar (PRMTs), bir metil grubunun substrat proteinlerinin arginin kalıntılarına transferini kataliz eder. PRMT ailesi, arginin kalıntılarını monometrik veya simetrik/asimetrik olarak dimetillat arginin kalıntılarına sahip dokuz üyeden oluşur. Çeşitli proteinlerin farklı arginin metilasyonlarını tanıyan çeşitli antikorlar mevcuttur; böylece, PRMT aktivite biyobelirteç tahlillerinin geliştirilmesi için araçlar sağlamak. PRMT antikor bazlı tahliller, üst üste binen substratlar ve motif bazlı antikor özellikleri nedeniyle zorludur. Bu konular ve bireysel PRMT'lerin katkıda bulunduğu arginin metilasyonunu araştırmak için deneysel kurulum tartışılmaktadır. Dokuz PRMT'den sekizi için biyobelirteç olan temsili substratların dikkatli seçimi ile prmt aktivite testlerinden oluşan bir panel tasarlanmıştır. Burada, PRMT ailesinin bireysel üyelerinin hücrelerdeki enzimatik aktivitesini nicel olarak ölçen hücresel tahlil protokolleri bildirilmiştir. Açıklanan yöntemlerin avantajı, hücre kültürü ve floresan batı leke yeteneklerine sahip herhangi bir laboratuvardaki basit performanslarıdır. Substrat özgüllüğü ve seçilen antikor güvenilirliği, devirme ve aşırı ifade yaklaşımları ile tamamen doğrulandı. Tahlil biyobelirteçleri ve antikorların ayrıntılı yönergelerine ek olarak, PRMT'ler için bir inhibitör takım bileşiği toplanmasının kullanımı hakkında da bilgi sağlanmaktadır.

Giriş

Arginin metilasyonu, protein-protein ve protein-RNA etkileşimlerini düzenleyen önemli bir çeviri sonrası modifikasyondur, bu nedenle mRNA öncesi birleştirme, DNA hasarı, transkripsiyon yanıtı ve büyüme faktörü aracılı transdüksiyon^1,2gibi çeşitli hücresel süreçlerde önemli bir rol oynar. Arginin protein arginin metiltransfenazlar (PRMTs) ile metillendirilir ve monometil arginin (Rme1), asimetrik dimetirlerjinin (Rme2a) veya simetrik dimetirlerjinin (Rme2s)^3. Metilasyon türüne göre PRMT'ler üç gruba ayrılır: Tip I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 ve 8), mono ve asimetrik dimetilasyonu katalze eden; Mono ve simetrik dimetilasyonu katalİze eden Tip II (PRMT5 ve PRMT9); ve Tip III (PRMT7), sadece monometrin arginin^3.

Piyasada bulunan arginin metilasyona özgü antikorların sayısının artması nedeniyle PRMT aktivitesi batı şişkinliği kullanılarak ölçülebilir. Floresan bazlı batı blot, daha fazla dinamik aralık ve doğrusallık, daha yüksek hassasiyet ve çoklama^4'eizin vermesi nedeniyle kemimuminesan algılama yerine tercih edilen tekniktir. Protein metilasyon seviyelerini ölçmek için metilasyon sinyalinin toplam protein seviyelerine normalleşmesi gerekir. Farklı konakçı türlerde (örneğin fare ve tavşan) yetiştirilen toplam ve metillenmiş protein için antikorlar seçilerek, farklı floroforlarla etiketlenmiş ikincil antikorlar kullanılabilir ve her iki antikor için sinyal aynı örnek bantta belirlenebilir. Metil-arginin antikorları, metil-arginin belirli bir bağlamda bulunduğu monometrik, asimetrik veya simetrik olarak dimetillenmiş proteinleri tanımlamak ve karakterize etmek için geliştirilmiştir. PRMT'lerin çoğunluğu alt tabakaları⁵içindeki metil glisini ve arginin bakımından zengin motiflerin çoğunluğu, D5A12, ASYM24 veya ASYM25 ve SYM11 gibi monometrik veya asimetrik, simetrik dimetil-arginin-glisin tekrarları içeren peptitler için çeşitli antikorlar yetiştirildi. Diğer metil-arginin antikorları, bu özel bağlamlarda metil-arginin tespitini kolaylaştıran tekrar bir bağlamda asimetrik, simetrik dimetil ve monometil arginin içeren bir peptit kütüphanesine karşı üretildi⁶. Ayrıca, histone H4R3me2a veya BAF155-R1064me2a gibi metilasyonun seçici olarak tespit edilmesini sağlayan tek bir proteinde spesifik arginin işaretini tanıyan antikorların sayısı da artmaktadır.

PRMT hücresel tahlilleri için araç olarak kullanılabilen ticari olarak kullanılabilen birkaç PRMT inhibitörü vardır. Bununla birlikte, hepsi seçicilik ve hedef dışı etkiler için kapsamlı bir şekilde karakterize değildir ve bazıları dikkatli kullanılmalıdır. Yapısal Genomik Konsorsiyum, akademik laboratuvarlar ve ilaç ortaklarıyla işbirliği içinde, bilim topluluğu tarafından hiçbir kısıtlama olmadan kullanılabilen iyi karakterize güçlü, seçici ve hücre geçirgen PRMT inhibitörleri (kimyasal problar) geliştirmiştir. Bu inhibitörler hakkında bilgi https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics ve https://www.chemicalprobes.org/ bulunabilir. Kimyasal problar in vitro IC 50 veya K_d < 100 nM, aynı ailedeki proteinler üzerinde 30 kat seçicilik ve 1 μM'de önemli hücresel aktiviteye sahip küçük molekülinhibitörleridir.

Bu protokolün amacı, floresan batı lekesi yöntemini kullanarak bireysel PRMT aile üyelerinin hücresel aktivitesini ölçmektir. Burada doğrulanmış test biyobelirteçleri, antikorlar ve güçlü hücre aktif inhibitörleri ve başarılı tahlil uygulaması için değerli stratejiler hakkında ayrıntılı bilgi verilmiştir.

Protokol

1. Hücre kültleme ve kaplama

NOT: Önerilen ortama sahip kültür hücreleri ve mikoplazma kontaminasyonu için rutin olarak test edin. Hek293T, MCF7 ve C2C12 hücreleri örnek olarak seçilmiştir, çünkü bu hücre hatları PRMT testlerinde başarıyla kullanılmıştır.

1. DMEM'deki Kültür HEK293T, MCF7 ve C2C12, 10 cm doku kültürüyle işlenmiş (TC) yemeklerde %10 fetal sığır serumu (FBS), penisilin⁽¹⁰⁰U mL⁻¹⁾ve streptomisin (100 μg mL −1) ile desteklenmiştir.
2. PRMT8 tahlili için, test başlamadan önce 3 gün boyunca prmt1 indükleyen hek293T hücrelerini doksiksin (2 μg/mL) içeren medyada büyütün.
3. Hücreleri kaplamak için, ortamı plakadan çıkarın ve atın.
4. Hücreleri yıkamak ve çözeltiyi atmak için 10 mL PBS (Ca⁺² ve Mg⁺² iyonları olmadan) ekleyin.
5. 1 mL Trypsin-EDTA (%0,25) ekleyin, oda sıcaklığında (RT) 1 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından çözeltiyi atın. Hücreler yuvarlanana kadar kuluçkaya yaslanın ve plakadan ayırın. Gerekirse hücreleri ayırmaya yardımcı olmak için plakaya dokunun. C2C12 gibi denenecek zor hücreler için plakayı 37 °C'de 1-2 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Hücre canlılığını azaltacağından, hücrenin tripsin çözeltisine daha uzun süre (>10 dk) maruz kalmasından kaçının.
6. Plakaya 1 mL önceden ısıtilmiş ortam ekleyin ve hücre kümelerini parçalamak için hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı borulayın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 3-5 mL ortam ekleyin.
7. Hücre sayısını ölçmek için, 10 μL hücreyi 10 μL Trypan mavisi ile karıştırın ve 10 μL'yi hemositometreye aktarın veya başka bir hücre sayma yöntemi kullanın.
8. Önerilen hücre yoğunluğuna göre hücreleri seyreltin ve 24 kuyulu TC plakalarına 500 μL / kuyu koyun (Tablo 1). Endojen testlerde (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 ve PRMT9) Adım 3.1'e geçin.

2. Hücre nakli

1. Eksojen tahliller için (PRMT3, PRMT6, PRMT8) HEK293T hücrelerini önerilen DNA miktarı ile transfect (Tablo 2). HEK293T hücrelerinin transfect edilmesi kolaydır, böylece üreticinin talimatına uyarak herhangi bir transfeksiyon reaktifi kullanılabilir.

3. Bileşik tedavi

NOT: Kültür ortamlarında %0,1 son dimetil sülfit (DMSO) konsantrasyonunu aşmayın. Her kuyuda aynı DMSO konsantrasyonu tutun. Seçici PRMT inhibitörleri (kimyasal problar) ve yakından ilişkili inaktif analogları Tablo 3'tebulunabilir.

1. Endojen testlerde (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 ve PRMT9), hücrelerden ortam çıkarın ve 500 μL ortamla sadece bileşik veya DMSO (kontrol) ile değiştirin.
   NOT: R metilasyon seviyelerinde %80'in üzerinde azalma gözlemlemek genellikle 2 gün sürer.
2. Eksojen tahliller (PRMT3, PRMT6, PRMT8) için, transfeksiyondan sonra 4 saat medyayı çıkarın, sadece bileşik veya DMSO (kontrol) ile 500 μL ortam ekleyin ve 20-24 saat kuluçkaya yatırın.

4. Hücre lysate hazırlığı

1. Kuyulardaki tüm ortamları çıkarın, artık ortamı çıkarmak için 100 μL PBS ile yıkayın ve 60 μL lizis tamponu ekleyin (20 mM Tris-HCl pH 8, Her kuyuya 150 mM NaCl, 1 mM etileniaediaminetetraasetik asit (EDTA), 10 mM MgCl₂, %0,5 Triton X-100, 12,5 U mL−1 benzonaz, komple EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli).
   1. RT'de 1 dakikadan daha az bir süre kuluçkaya yatırarak liziz tamponu hücrelere dağıtmak için plakayı sallar. Daha sonra son % 1 konsantrasyona 3 μL% 20 w / v sodyum dodecyl sülfat (SDS) ekleyin ve hafifçe sallayarak karıştırın. Lisatları mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve buzda tutun.
      NOT: Kullanmadan önce benzonaz ve protein inhibitörü kokteyli taze ekleyin. Benzonaz ilavesi, hücreli likat viskozitesini azaltan nükleik asitleri hızla hidrolize eder.
2. BCA Protein Test Kiti kullanarak numunelerin protein konsantrasyonunun belirlenmesi veya çözeltide %1 SDS'nin tolere edilmesi için başka bir yöntem kullanılması.
   1. 96 kuyulu şeffaf plakanın kuyularına 2 μL lizat ve protein standartları (lizis tamponunda 0, 1, 2, 4 ve 8 μg/mL BSA) ekleyin.
   2. Reaktif A'yı 50:1 oranında B reaktifi karıştırın ve kuyu başına 200 μL ekleyin. 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yaslanın ve emiciliği okuyun.
3. Lizis tamponu ile protein konsantrasyonu numuneler arasında eşit olacak şekilde ayarlayın.
4. 60 μL hücre lisatine 20 μL 4x Yükleme Tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 95 °C'de ısıtın. Isı denatürasyonundan sonra, lysates -20 ° C'de saklanabilir.

5. Batı blot analizi

1. Histone proteinlerinin analizi için 5-20 μg ve diğer proteinler için 20-100 μg toplam hücre lisatı% 4-12 Bis-Tris protein jeline yükleyin.
2. Jeli MOPS SDS'de tampon (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, %0,1 SDS w/v, 1 mM EDTA, pH 7,7) ile 100 V'de yaklaşık 2 saat boyunca veya boya önü jelin dibine ulaşana kadar çalıştırın.
3. Islak transfer yapıyorsanız, transfer sandviçini buz gibi Tris-Glisin transfer tamponunda (25 mM Tris, 192 mM Glisin, %20 v/v metanol ve %0,05 w/v SDS) monte edin.
   1. Süngerleri, filtre kağıdını, PVDF membranını ve jeli üreticinin talimatlarına göre yerleştirin. Montajdan önce 30 sn boyunca transfer tamponunda metanol ve denge jeli içine batırarak PVDF membranını etkinleştirin.
      NOT: Düşük otofluoresans ve histonlar(Malzeme Tablosu)gibi düşük moleküler ağırlıklı proteinler için uygunluk olduğundan önerilen PVDF batı şişkin membran kullanın.
4. Proteinleri jelden Tris-Glisin transfer tamponunda PVDF membranlarına buz üzerinde 1,5 saat boyunca 70 V'ta aktarın.
5. Blok tamponunda membranları 30 dakika boyunca engelleyin (fosfat tamponlu salin, PBS'de% 5 w/v süt). Yıkama tamponu (PBST: PBS'de % 0,1 v/v Ara-20) ile durulayın ve sığır serum albümin (BSA) çözeltisinde (PBST'de% 5 BSA) birincil antikorlarla bir gecede 4 °C'de(Tablo 3)kuluçkaya yatırın.
   NOT: Daha uzun depolama için BSA çözeltisini filtreleyin, %0,02 w/v sodyum azit ekleyin ve 4 °C'de tutun.
6. MEMBRAN 3 x 5 dk PBST ile yıkayın. Daha sonra önerilen blokaj tamponunda keçi-anti-tavşan (IR800) ve eşek anti-fare (IR680) antikorları ile kuluçkaya yatırın (Malzeme Tablosu, Tablo 3) RT'de 30 dakika ve PBST ile 3 x 5 dakika yıkayın.
7. Sinyali 800 ve 700 nm'de floresan bir batı leke görüntüleyicisinde okuyun. Tercihen, güçlü ve soluk bantların yüksek hassasiyet ve dinamik aralık, yüksek sinyal-gürültü oranı, görüntü doygunluğuna ulaşıldığında bir uyarı ve aynı örnek banttaki iki floresan rengin çoklanması ile tek bir görüntüde net bir şekilde görüntülenmesini sağlayan cihazı kullanın.
8. Floresan batı görüntüleme için uygun yazılımı kullanarak batı leke analizi için bant yoğunluklarını belirleyin.

Sonuçlar

Bireysel PRMT'lerin hücresel tahlilleri için batı lekesi sonuçları örnekleri aşağıda sunulmuştur. Tahlil detayları tablo 4'te de özetlenmiştir.

PRMT1 tahlil
PRMT1 hücrelerde histone 4 arginin 3 asimetrik dimetilasyon (H4R3me2a) ana katkıda bulunur¹³. PRMT1 aktivitesinin kaybedilmesi üzerine, küresel Rme1 ve Rme2s seviyeleri önemli ölçüde^{artar 13}. Şekil 1A ve 1B'de gösterildiği gibi, Rme1, Rme2a, Rme2s ve H4R3me2a'daki küresel değişiklikleri izlemek için çeşitli antikorlar kullanılabilir. Küresel Rme2a ve H4R3me2a seviyelerinde önemli bir düşüş ve Rme1 ve Rme2'lerde artışlar 3 günlük PRMT1 nakavttan sonra gözlenebilir (Şekil 1A, B). Bazal H4R3me2a sinyalinde hücre hatları farklılık gösterir, bu nedenle PRMT1 aktivitesinin kaybını izlemeyi kolaylaştırmak için, yüksek bazal metilasyon seviyelerine sahip MCF7 gibi hücre hatları kullanılabilir (Şekil 1C). PRMT1 inhibisyonunun etkisini gözlemlemek için en uygun süre, örneğin TIP I PRMT inhibitörü MS023 8 ile tedavi üzerine,²gündür(Şekil 1D,1E). Daha uzun tedavi hücre canlılığının ve büyümesinin azalmasına neden olur.

PRMT3 tahlil
PRMT3 hücresel tahlili için, PRMT3 devirme veya aşırı ifade üzerine batı lekesinde metilasyon değişikliklerinin tespit edilemediği seçici biyobelirteç proteinleri tespit edilemedi. PRMT3 asimetrik dimetilit H4R3 in vitro¹⁴olarak gösterilmiştir, ancak, işaret ağırlıklı olarak PRMT1 tarafından biriktirilir ve bu nedenle aşırı ifade edilen PRMT3 ile eksojen bir test tasarlanmıştır. In vitro bulgularla tutarlı olarak, vahşi tip PRMT3'ün aşırı ifade edilmesi, ancak katalitik mutantının (E338Q) H4R3me2a seviyelerinde bir artışa yol açtı (Şekil 2A). HEK293T hücreleri, bu işaretin düşük bazal metilasyonuna sahip oldukları için kullanılmıştır (Şekil 1C). Tahlil ayrıca PRMT3 seçici inhibitörü SGC707⁷ile daha da doğrulandı, bu da PRMT3'e bağımlı H4R3 asimetrik metilasyonını inhibe etti (Şekil 2B).

PRMT4 tahlil
PRMT4 asimetrik olarak arginin 1064 15'te BAF155'i dimetillatlar. BAF165-R1064me2a'yı tespit eden antikor ticari olarak mevcut olduğundan, hücrelerdeki PRMT4 aktivitesi R1064me2a işaret seviyelerindeki değişiklikler tespit edilerek batı lekesi tarafından izlenebilir. PRMT4 seçici inhibitörü, TP-064¹⁰ile PRMT4 proteininin kaybı veya katalitik aktivitenin inhibisyonu, BAF165-R1064me2a seviyelerinde bir azalmaya neden olur (Şekil 3). Metilasyon sinyalinin çoğunu çıkarmak için genellikle 2 günlük bir tedavi yeterlidir.

PRMT5 tahlil
PRMT5, protein asinin simetrik dimetilasyonunun çoğundan sorumludur. Daha önce SmBB'ler de dahil olmak üzere çeşitli SMN kompleks proteinlerinin PRMT5 substratları¹⁶olduğu bildirilmiştir. PRMT5 aktivitesi, SmBB'nin proteinlerinin simetrik arginin dimetilasyonu veya simetrik dimetilasyonundaki küresel seviyelerdeki değişikliklere bakılarak izlenebilir. PRMT5'indevrilmesi , ancak PRMT1, 3, 4, 6 ve 7'nin değil, küresel Rme2s seviyelerinde bir azalmaya neden olur (Şekil 4A). Çoğu hücre hattında, PRMT5 seçici inhibitörleri LLY-283¹¹ ve GSK591 olan hücrelerin 2-3 gün boyunca tedavisi SmBB'Rme2s sinyalinin çoğunu baskılamıştır (Şekil 4B). Çoğu hücre PRMT5 inhibisyona karşı hassastır, bu da hücre çoğalmasında ve uzun süreli inhibitör maruziyeti ile hücre ölümünde azalmaya neden olur.

PRMT6 tahlil
PRMT6'nın hücre^17'dekiH3 arginin 2 asimetrik dimetilasyona (H3R2me2a) ana katkıda bulunduğu bildirilmiştir. HEK293T hücrelerinde 3 gün boyunca PRMT6 nakavt H3R2me2a seviyelerinde önemli bir düşüş gözlemlemek için yeterli değildi. Bununla birlikte, vahşi TIP PRMT6'nın aşırı ifadesi, ancak katalitik mutantının (V86K / D88A) H3R2me2a seviyelerinin yanı sıra H3R8me2a ve H4R3me2a(Şekil 5A)seviyelerini arttırır. Farklı güç ve seçiciliğe sahip PRMT6 aktivitesini engelleyen birkaç inhibitör vardır: seçici, allosterik PRMT6 inhibitörü SGC6870¹⁸, PRMT tipi I inhibitörü MS023⁸ve PRMT4/6 inhibitörü MS049⁹. Tüm bunlar inhibe PRMT6 bağımlı H3R2 (Şekil 5B), yanı sıra H4R3 ve H3R8 asimetrik dimetilasyon (veri gösterilmez).

PRMT7 tahlil
PRMT7, HSP70'in (sırasıyla HSPA8 ve HSPA1/6) hem kesin hem de indükleyici formlarında arginin 469'u monometrik olarak oluşturur¹². HSP70-R469me1 seviyelerini tespit eden piyasada mevcut antikor olmamasına rağmen, pan monometril antikorlarla iz tespit edilebilir. PRMT7 seçici inhibitörü SGC3027¹²ile PRMT7 proteininin kaybı veya katalitik aktivitenin inhibisyonu, HSP70-R469me1 seviyelerinin azalmasına neden olur (Şekil 6A, B). SGC3027, hücrelerde indirgemeler tarafından PRMT7 seçici inhibitörü SGC8158'e dönüştürülen hücre geçirgen bir prodrugdur, bu nedenle hücresel güç hücre çizgileri arasında farklılık gösterebilir. Birkaç kanser hücre hattı yüksek seviyelerde indüklenebilir HSP70 izoformlarını ifade eder ve üst üste binen nükleer kökenli belirsiz bir bant nedeniyle metilasyonu tespit etmek zor olabilir (Şekil 6C). Bu nedenle, PRMT7 hücresel tahlili için, C2C12 gibi çoğunlukla HSPA8'i ifade eden hücre çizgileri önerilir veya HSP70 esas olarak sitoplazmada lokalize olduğundan, tercih edilen hücre hatlarının sitoplazmik fraksiyonunda HSP70-R469me1 seviyelerini belirleyin.

PRMT8 tahlil
PRMT8, doku kısıtlamalı ifade deseni olan tek PRMT'dir - büyük ölçüde beyinde ifade edilir¹⁹. %80 sıra benzerliğini paylaşır ve PRMT1¹⁹ile benzer bir substrat tercihlerine sahiptir. Prmt1'den özellikle N-terminusta farklıdır, burada miristoilasyon PRMT8'in plazma membran²⁰ile ilişkilendirilmesiyle sonuçlanır. PRMT8'in PRMT1 metilleri RNA bağlayıcı protein EWS²¹ile birlikte. Nöronal olmayan hücre hatlarında PRMT8 aktivitesi düşük olduğundan ve EWS prmt1 ile metille edilebildiğinden, PMRT8'in PRMT1 nakavt hücrelerinde EWS ile birlikte ifade edildiği bir test geliştirilmiştir. PRMT1 önemli bir gen olduğundan ve uzun süreli kaybı hücre ölümüyle sonuçlandırıldığından, PRMT1'in PRMT8 testinde kullanılmadan önce 3 gün boyunca yıkıldığı indüklanabilir bir sistem kullanılmıştır (Şekil 7A). Vahşi tip PRMT8'in birlikte ifade edilir, ancak kataltik olarak inaktif mutant (E185Q) değildir, EWS ile birlikte EWS asimetrik dimetilasyon seviyelerinin artmasına neden oldu (Şekil 7B). Birkaç asimetrik dimetilarjinin antikoru test edildi ve metilasyon sadece Asym25 antikoru ile tespit edildi. Test ayrıca, eksojen EWS'nin PRMT8'ebağımlı asimetrik dimetilasyonunu azaltan BIR PRMT tipi I seçici kimyasal prob olan MS023 8 ile daha da doğrulandı (Şekil 7B). MS023 in vitro tahlillerde PRMT8 inhibe çok güçlü olmasına rağmen, hücrelerde metilasyon inhibisyonu²¹görmek için yüksek MS023 konsantrasyonları gereklidir.

PRMT9 tahlil
PRMT9'un Arginin 508^22'deSAP145'i simetrik olarak dimetillat olarak gösterdiği gösterilmiştir. Ne yazık ki, piyasada bulunan hiçbir antikor işareti tanıyamaz. PRMT9 testi için, Dr. Yanzhong Yang (Beckman Umut Şehri Araştırma Enstitüsü) tarafından nazikçe hediye edilen antikorlar kullanıldı. Aşırı ifade edildiğinde, vahşi tip ancak R508K mutant SAP145 PRMT9 (Şekil 8A)tarafından metillenmiştir. Test, endojen SAP145-R508me2s seviyelerini izlemek için tasarlanmıştır ve PRMT9 in vitroyu nanomoler güçle güçlü bir şekilde inhibe eden bir prototip PRMT9 inhibitörü olan Compound X ile doğrulanmıştır. Bileşik X, SAP145-R508me2s seviyelerini doza bağlı bir şekilde azalttı (Şekil 8B).

Şekil 1. PRMT1 hücresel test. (A) PRMT1 nakavt, küresel asimetrik arginin dimetilasyonun (Rme2a) azalmasına ve simetrik arginin dimetilasyon (Rme2s) ve monometrik (Rme1) seviyelerinin artmasına neden olur. PRMT1 devirme verimliliği B panelinde sunulur. (B) PRMT1 devirme, histone H4R3'ün (H4R3me2a) asimetrik dimetilasyonunu azaltır. (C) Bazal H4R3me2a düzeyleri farklı hücre çizgilerinde farklılık gösterir. (D) Tip I PRMT inhibitörü MS023, H4R3me2a seviyelerini doza bağlı bir şekilde azaltır. MCF7 hücreleri 2 gün boyunca MS023 ile tedavi edildi. (E) Grafik, toplam histon H4 olarak normalleştirilen H4R3me2a sinyal yoğunluklarının doğrusal olmayan uyumunu temsil eder. MS023 IC50 = 8,3 nM (n=1). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. PRMT3 hücresel test. (A) PRMT3'ün E338Q katalitik mutantının değil, vahşi tip (WT) aşırı ifade, HEK293T hücrelerinde H4R3me2a seviyelerini arttırır. Hücreler 24 saat boyunca BAYRAK etiketli PRMT3 ile transkred edildi. (B) PRMT3 seçici inhibitörü, SGC707, ektopik PRMT3 bağımlı H4R3 asimetrik demethylation azaltır Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. PRMT4 hücresel test. (A) PRMT4 devirme BAF155-R1064 asimetrik arginin dimetilasyonun (HEK293T hücreleri) azalmasına neden olur. (B) PRMT4 selektif inhibitörü, TP-064, BAF155-R1064Rme2a seviyelerini azaltır. HEK293T hücreleri 2 gün boyunca bileşik ile tedavi edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. PRMT5 hücresel test. (A) PRMT5 nakavt küresel simetrik arginin dimetilasyon seviyelerinin (MCF7 hücreleri) azalmasına neden olur. (B) PRMT5 seçici inhibitörler GSK591 ve LLY-283, SmBB'nin simetrik arginin dimetilasyonunu (yeşil) azaltırken, toplam SmBB seviyeleri değişmeden kalır (kırmızı). MCF7 hücreleri 2 gün boyunca bileşiklerle tedavi edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5. PRMT6 hücresel test. (A) V86K/D88A katalitik mutant PRMT6'nın değil, vahşi tipte aşırı ifade, HEK293T hücrelerinde H4R3me2a, H3R2me2a ve H3R8me2a seviyelerini arttırır. Hücrelere 24 h. (B) PRMT6 seçici inhibitörü (SGC6870), PRMT tip I inhibitörü (MS023) ve PRMT4/6 inhibitörü (MS049) için BAYRAK etiketli PRMT6 ile transkred edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6. PRMT7 hücresel test. (A) PRMT7 nakavt HSP70-R469 monometrilasyonun (HCT116 hücreleri) azalmasına neden olur. (B) PRMT7 seçici inhibitörler, SGC3027, C2C12 hücrelerinde HSP70-R469 monometrilasyon azaltır. Hücreler 2 gün boyunca bileşik ile tedavi edildi. (C) Indüklenebilir HSP70'in (HSPA1/6) pan monometil arginin antikorları (Rme1) ile HSP70-R469 metilasyonunun tespiti, nükleer kökenli belirsiz bir bant nedeniyle zor olabilir. Sitoplazmik fraksiyonda HSP70 metilasyon seviyelerinin ölçülmesi önerilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7. PRMT8 hücresel test. (A) PRMT1 aktivitesi nakavtla inhibe edildiğinde EWS'nin PRMT8 metilasyonu tespit edilebilir. HEK293T hücreleri indüklenen prmt1 devirme vektörü ile transdüklendi. 3 günlük doksiksin tedavisinden sonra PRMT1 düzeyleri büyük ölçüde azaldı. (B) PRMT1 yıkıldığında, eksojen EWS, aşırı ifade edilen vahşi tip PRMT8 ile asimetrik olarak dimetil edilir, ancak PRMT8'in katalitik mutant (E185Q) tarafından değil. Metilasyon, yüksek konsantrasyonda PRMT tip I inhibitörü (MS023) ile azalır. HEK293T PRMT1KD hücreleri BAYRAK etiketli PRMT8 vahşi tipi veya katalitik mutant ve GFP etiketli EWS ile birlikte transkripsiyona uğramış ve MS023 ile 20 saat boyunca tedavi edilmiştir.

Şekil 8. PRMT9 hücresel test. (A) Vahşi tip ancak R508K mutant SAP145 PRMT9 tarafından metillenmiş değildir. HEK293T hücreleri 1 gün boyunca GFP etiketli SAP145 ile transkt edildi. (B) Prototip PRMT9 inhibitörü (Bileşik X), SAP145'in PRMT9 bağımlı R508 simetrik dimetilasyonunu doza bağlı bir şekilde azaltır. HEK293T hücreleri 2 gün boyunca bileşik ile tedavi edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

PRMT	Hücre	Ml başına yoğunluk
PRMT1	MCF7	1 x 105
PRMT3	HEK293T	2 x 105
PRMT4	HEK293T	1 x 105
PRMT5	MCF7	1 x 105
PRMT6	HEK293T	2 x 105
PRMT7	C2C12	1 x 105
PRMT8	HEK293T (PRMT1 KD)*	2 x 105
PRMT9	HEK293T	2 x 105
*PRMT8 test için kaplamadan 3 gün önce doksiksin (2 μg/mL) ile hücreleri tedavi edin

Tablo 1. PRMT tahlilleri için önerilen hücre tipleri ve yoğunlukları.

PRMT	μg DNA/24 kuyu	Addgene #	Ek notlar
PRMT3	0.5 BAYRAK-PRMT3	164695
	veya 0,5 BAYRAK PRMT3 (E338Q)	164696
PRMT6	0.5 BAYRAK-PRMT6	164697
	veya 0,5 BAYRAK-PRMT6(V86K/D88A)	164698
PRMT8	0,05 EWS-GFP	164701
	0,45 PRMT8 BAYRAK	164699
	veya 0,45 PRMT8(E185Q)-BAYRAK	164700
PRMT9	0,05 SAP145-GFP	Na	Dr. Yanzhong Yang'dan, Beckman Umut Şehri Araştırma Enstitüsü'nden hediye
	veya 0,05 SAP145-R508K-GFP
	0.45 boş vektör

Tablo 2. Transfeksiyon deneyi için önerilen DNA konsantrasyonu.

PRMT	antikor	Kimyasal prob (Hücre aktivitesi IC50)	Negatif kontrol
PRMT1	H4R3me2a (1:2000)	MS023 -PRMT türü I	MS094
	Rme1 (1:1000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = sırasıyla 9, 56, 1000, 5000 nM)
	Rme2s (1:2000)
	Rme2a (1:2000)
	Rme2a (ASYM24, 1:3000)
	Rme2a (ASYM25, 1:2000)
	H4 (1:2000)
	B-actin (1:500 )
PRMT3	H4 (1:2000)	SGC707 (IC50 = 91 nM)	XY-1
	H4R3me2a (1:2000)
	BAYRAK (1:5000)
PRMT4	BAF155 (1:200)	TP-064 (IC50 = 43 nM)	TP064N
	BAF155-R1064me2a (1:3000)	SKI-73 (IC50 = 540 nM)*	SKI-73N*
PRMT5	anti-SmBB' (1:100)	LLY-283 (IC50 = 30 nM)	LLY-284
	Rme2s (#13222, 1:2000)	GSK591 (IC50 = 56 nM)	SGC2096
PRMT6	H4R3me2a (1:2000)	SGC6870 (IC50 = 0,9 μM)	SGC6870N
	H4 (1:2000)	MS023 -PRMT türü I	MS094
	H3R2me2a ( 1:2000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = sırasıyla 9, 56, 1000, 5000 nM)
	H3R8me2a (1:2000)	MS049 (SıRASıYLA PRMT 4, 6 IC50 = 970, 1400 nM)	MS049N
	H3 ( 1:5000)
	BAYRAK ( 1:5000)
PRMT7	Rme1 (1:1000)	SGC3027 (IC50 = 1300 nM) *	SGC3027N*
	Hsp/Hsc70 (1:2000)*
PRMT8	GFP (1:3000)	MS023 (50 μM)	MS094
	Rme2a (ASYM25,1:2000)
	BAYRAK (1:5000)
PRMT9	SAP145 (1:1000)
	DR. Yanzhong Yang'dan SAP145-R508me2s -nazik hediye, Beckman Umut Şehri Araştırma Enstitüsü (1:1000) (PIMID: 25737013)
İkincil antikorlar	keçi-anti-tavşan IgG-IR800 (1:5000)
	eşek fare karşıtı IgG-IR680 (1:5000)
*- antikor HSPA8, HSPA1 ve HSPA6'yı tanır (aşırı eksprese edilmiş GFP etiketli proteinlerle test edilir), *prodrug - IC50 çeşitli hücre hatları arasında farklılık gösterebilir

Tablo 3. Önerilen antikorlar ve PRMT kimyasal prob/negatif kontrol aracı bileşikleri.

PRMT

Biyobelirteç

Tahlil okuması

Tahlil doğrulaması

Önerilen hücre hattı

Ref.

PRMT1

H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a

H4R3me2a seviyeleri toplam H4 global Rme1, Rme2a veya Rme2s seviyeleri B-actin normalleştirilmiştir.

PRMT1'in devrilmesi bazal H4R3me2a ve küresel Rme2a seviyelerini azalttı ve hücrelerde küresel Rme1 ve Rme2s seviyelerini artırdı (Şek.1A, B). PRMT Tip I kimyasal prob MS023, H4R3me2a seviyelerini doza bağımlı bir şekilde azalttı (Şek. 1D).

Hücreler bazal H4R3me2a seviyelerinde farklılık gösterir (Şek. 1C). MCF7 hücreleri yüksek bazal H4R3me2a seviyelerine sahiptir, bu da PRMT1 aktiviteslerindeki düşüşü izleyen tahliller için tercih edilir.

8

PRMT3

H4R3me2a

H4R3me2a metilasyon seviyeleri eksojen BAYRAK etiketli PRMT3 WT veya katalitik E338Q mutant (arka plan) toplam histone H4 normalleştirilmiş

Vahşi tip PRMT3'ün aşırı ifade edildi, ancak katalitik mutantının (E338Q) H4R3me2a'yı (Şek. 2A) artırmadı. PRMT3 seçici inhibitörü SGC707, H4R3me2a seviyelerinde PRMT3 bağımlı artışını azalttı (Şek. 2B)

HEK293T hücreleri, eksojen PRMT3 aktivitesini izlemek için tercih edilen düşük bazal H4R3me2a seviyelerine (Şekil 1C) sahiptir

7

PRMT4

BAF155-R1064me2a

BAF155-R1064me2a seviyeleri toplam BAF155'e normalleştirildi

PRMT4 nakavt BAF155'in asimetrik dimetilasyonunu azalttı (Şek. 3A). PRMT4 seçici kimyasal prob (TP-064) ile 2 günlük tedavi BAF155'in asimetrik dimetilasyonunda azalma oldu (Şek. 3B).

Herhangi bir hücre satırı

10

PRMT5

SmBB'-Rme2'ler

Toplam SmBB'ye normalleştirilen tava Rme2s antikorları (CST) ile tespit edilen SmBB'-Rme2s seviyeleri'

PRMT5'in devrilmesi, SmBB'nin simetrik dimetilasyon seviyelerinin düşmesine neden oldu (Şek. 4A). PRMT5 seçici kimyasal problar, GSK591 ve LLY285 ile 2 günlük tedavi, SmBB'-Rme2s seviyelerinde azalma (Şek. 4B).

Herhangi bir hücre satırı

11

PRMT6

H4R3me2a H3R2me2a H3R8me2a

H4R3me2a, H3R2me2a veya H3R8me2a metilasyon seviyeleri eksojen BAYRAK etiketli PRMT6 WT ile artar, ancak katalitik V86K, D88A mutant (arka plan) sırasıyla toplam histonE H4 veya H3 olarak normalleştirilmez

Vahşi tip PRMT6'nın aşırı ifade edildi, ancak katalitik mutantının (V86K, D88A) H3R2me2a, H3R8me2a ve H4R3me2a seviyelerini arttırdı (Şek. 5A). Allosterik PRMT6 inhibitörü (SGC6870), PRMT tip I inhibitörü MS023 , PRMT4/6 inhibitörü MS049, H3R2me2a seviyelerinde PRMT6 bağımlı artışını azalttı (Şek. 5B).

HEK293T hücreleri, eksojen PRMT6 aktivitesini izlemek için tercih edilen düşük bazal H4R3me2a, H3R2me2a ve H3R8me2a seviyelerine sahiptir.

8,9

PRMT7

HSP70-R469me1

HSP70-Rme1 metilasyon seviyeleri toplam HSP70 olarak normalleştirildi

PRMT7 nakavt veya nakavt azaltılmış HSP70 monometrilasyon (Şek. 6A). PRMT7 seçici kimyasal prob SGC3027 ile 2 günlük tedavi, PRMT7 bağımlı HSP70 monometrilasyonunu doza bağımlı bir şekilde azaltmıştır (Şek. 6B).

C2C12, HT180 Çeşitli kanser hücre hatları, metilasyon sinyali nükleer kökenli spesifik olmayan bir proteinle örtüşen HSP70'in indüklenen bir formunu ifade eder (Şek. 6C). Bu durumda sitoplazmik fraksiyondaki HSP70 metilasyon seviyelerini analiz etmenizi öneririz.

12

PRMT8

EWS-Rme2a

Eksojen GFP etiketli EWS metilasyon seviyeleri, PRMT1 KO hücrelerinde toplam GFP sinyaline normalleştirilmiş eksojen BAYRAK etiketli PRMT8 WT veya E185Q katalitik mutantın (arka plan) neden olduğu.

Vahşi TIP PRMT8'in aşırı ifade, ancak katalitik E185Q mutant metillenmiş ektopik EWS'nin sadece PRMT1 KD hücrelerinde ifade edilmemiştir (Şek. 7A). PRMT tip I kimyasal prob MS023, eksojen EWS'nin PRMT8 tarafından asimetrik dimetilasyonunu inhibe etti (Şek. 8B).

HEK293T PRMT1 KD (indüklanabilir). PRMT1 nakavt hücre ölümü ile sonuçlanır, bu nedenle indüklanabilir bir sistem kullanmanızı öneririz.

8

PRMT9

SAP145-R508me2s

R508'de PRMT9 bağımlı SAP145 simetrik dimetilasyon SAP145'e normalleştirildi

PRMT9 kaybı, ancak PRMT5 değil, SAP145'in simetrik dimetilasyonunun azalmasına neden oluyor. GFP etiketli SAP145 WT ancak SAP145mut (R508K) PRMT9 tarafından metillendi (Şek. 8A). Prmt9 inhibitörü prototipi Copound X ile 2 günlük tedavi, SAP145-R508me2s seviyelerini doza bağlı bir şekilde azalttı Şekil 8B).

Herhangi bir hücre satırı

21

Tablo 4. PRMT tahlil özeti.

Tartışmalar

Burada, PRMT ailesinin üyeleri için floresan batı şişkinlik yöntemlerini kullanan ayrıntılı hücresel test protokolleri açıklanmıştır. Arginin metilasyonundaki değişikliklerin bireysel PRMT kaybı veya katalitik inhibisyon üzerine kolayca tespit edilebildiği ve diğer aile üyeleri tarafından telafi edilemediği benzersiz substratlar seçilmiştir. Bazı proteinler birden fazla PRMT^21,23ile metillenir, bu da bazı PRMT'lerin belirli bir protein substratı^{24 , 25 , 26,27}'de sadece az miktarda hücresel işarete katkıda bulunduğu substrat özgüllüğünde bir çakışma olduğunu gösterir, örneğin, hem PRMT8 hem de PRMT1 EWS'nin metilasyonuna katkıda bulunur. Bu nedenle, her test, devir ve / veya aşırı ifade deneyleri ile substratların ve antikorların kapsamlı bir şekilde doğrulanmasını ve iyi karakterize edilmiş seçici inhibitörlerle daha fazla doğrulamayı gerektiriyordu. Metil-arginin işaret düzeylerini dolaylı olarak etkileyebilecek hücre canlılığının ve çoğalmasının bileşik etkilerini önlemek için PRMT sonrası kayıp/inhibisyon sonrası 2-3 gün içinde metilasyon işareti değişikliklerinin tespit edilebileceği PRMT'ye özgü substratlar belirlendi. PRMT1, 4, 5, 7 ve 9 için benzersiz substratlar bulmak mümkün olsa da; PRMT3, 6 ve 8 için fonksiyon yaklaşımının kazanımının istihdam edilmesi gerekiyordu. Çeşitli hücresel hedefler için çeşitli arginin metil spesifik antikorlar test edildi, ancak hiçbiri PRMT3 ve PRMT6 nakavttan sonraki 3 gün içinde önemli değişiklikleri tespit edemedi; Bu nedenle, biyobelirteç tahlilleri, taban çizgisi substrat metilasyonu için bir kontrol görevi gören katalitik olarak inaktif mutantlarla birlikte ektopik olarak ifade edilen enzimler kullanılarak geliştirilmiştir. PRMT8 yakın bir PRMT1 homolog'udur ve benzer substrat tercihlerini paylaşır. Bir PRMT8 seçici biyobelirteç tanımlanamadığı için, PRMT8'in EWS ile birlikte ifade edildiği PRMT1 knockdown hücrelerinde bir test geliştirilmiştir. PRMT1 aynı zamanda H4R3 asimetrik metilasyonundan sorumlu önemli bir enzimdir, bu nedenle H4R3me2a'yı PRMT3 ve PRMT6 hücresel tahlilleri için biyobelirteç olarak kullanmak için, düşük bazal H4R3me2a seviyelerine sahip hücreler seçildi ve katalitik olarak inaktif mutantlar arka plan kontrolü olarak kullanıldı. Endojen tahliller tercih edilse de, eksojen tahliller birkaç seçici PRMT inhibitörünün hücresel gücünü test etmek için paha biçilmezdir^7,8,9. PRMT biyolojisi hakkında artan bilgi birikimimizle, PRMT3, PRMT6 ve PRMT8 için daha spesifik biyobelirteç proteinleri bularak tahlilleri geliştirmeyi bekliyoruz.

Doğrulanmış antikorların ve uygun kontrollerin kullanımı PRMT test performansı için kritik öneme sahiptir. Burada önerilen tüm antikorlar nakavt ve aşırı ifade deneyleri ile iyice doğrulanmıştır, ancak özellikle poliklonal antikorlar durumunda toplu-toplu farklılıklar performanslarını hala etkileyebilir. Bu nedenle, test güvenilirliğini doğrulamak için genetik yöntemlerin ve kimyasal probların yakından ilişkili negatif kontrolleriyle birlikte kullanılması çok önemlidir. Ek olarak, protein aşırı ekspresyonu gerektiren PRMT tahlilleri için, bazal metilasyon seviyelerini belirlemek için vahşi tip protein ile birlikte katalitik olarak inaktif mutantların kullanılması çok önemlidir.

PrMT'lerin hücrelerdeki aktivitesinin profilini çıkarmak için bu nicel tahlil koleksiyonu, bilim topluluğu için geniş ölçüde yararlı olabilir, çünkü sadece temel hücre kültleme ve floresan batı şişkinlik tekniklerini içeren minimum ekipman ve sınırlı teknik uzmanlıkla hızlı ve kolay bir şekilde uygulanabilir. PRMT'ler için önerilen antikorlar ve kimyasal problar, belirli bir ABPP probunun uygunluğunu belirlemek, hedef katılımını izlemek ve rekabetçi ABPP formatını kullanarak hedef dışı etkileri değerlendirmek için aktivite tabanlı protein profilleme (ABPP) tahlilleri için de kullanılabilir. Burada tartışılan tahlil geliştirme yaklaşımları protein lizin-metiltransfezler ve asetiltransfenazlar gibi diğer enzim aileleri için de tahmin edilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm TC dishes	Greiner bio-one	664160
24-well TC plates	Greiner bio-one	662160
4–12% Bis-Tris Protein Gels	ThermoFisher Scientiffic	NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX
Amersham Hybond P PVDF membrane	Millipore-Sigma	10600021
anti-Asym 24	Millipore-Sigma	07-414
anti-Asym 25	Millipore-Sigma	09-814
anti-B-actin	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47778
anti-BAF155	Santa Cruz Biotechnologies	sc-32763
anti-BAF155-R1064me2a	Millipore-Sigma	ABE1339
anti-FLAG (#, 1:5000)	Millipore-Sigma	F4799
anti-GFP	Clontech	632381
anti-H3	Abcam	ab10799
anti-H3R2me2a	Millipore-Sigma	04-848
anti-H3R8me2a	Rockland	600-401-I67
anti-H4	Abcam	ab174628
anti-H4R3me2a	Active Motif	39705
anti-Hsp/Hsc70	Enzo	ADI-SPA-820
anti-PRMT1	Millipore-Sigma	07-404
anti-PRMT3	Abcam	ab191562
anti-PRMT4	Bethyl	#A300-421A
anti-PRMT5	Abcam	ab109451
anti-PRMT6	Abcam	ab47244
anti-PRMT7	Abcam	ab179822
anti-Rme1	CST	8015
anti-Rme2a	CST	13522
anti-Rme2s	CST	13222
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)		09-814
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)	Abcam	ab56800
anti-SAP145-R508me2s			kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope
anti-SmBB’	Santa Cruz Biotechnologies	sc-130670
benzonase			PRODUCED IN-HOUSE
BSA	Millipore-Sigma	A7906
C2C12			gift from Dr. Stephane Richard, McGill University
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Millipore-Sigma	11873580001
DMEM	Wisent	319-005-CL
DMSO	Bioshop	DMS666.100
donkey anti-mouse IgG-IR680	Licor	926-68072
doxycycline	Millipore-Sigma	D9891
EDTA	Bioshop	EDT111.500
FBS	Wisent	80150
glycine	Bioshop	GLN002.5
goat-anti-rabbit IgG-IR800	Licor	926-32211
HEK293T			gift from Dr. Sam Benchimol, York University
Image Studio Software ver 5.2	Licor
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	ThermoFisher Scientiffic	NP0007
MCF7		ATCC® HTB-22™
NaCl	Bioshop	SOD001.1
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	ThermoFisher Scientiffic	NP0001
Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST)	Licor	927-40000	Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001
Odyssey CLX Imaging System	Licor	model number 9140
PBS (tissue culture)	Wisent	311-010-CL
PBS (western blot)	Bioshop	PBS405.4
penstrep	Wisent	450-201-EL
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientiffic	23225
SDS	Bioshop	SDS001.1
skim milk powder	Bioshop	SKI400.500
TC20 automated cell counter	Biorad	1450102
Tripsin-EDTA (0.25%)	Wisent	325-043-EL
Tris	Bioshop	TRS003.5
Tritton X-100	Bioshop	TRX506
trypan blue	GIBCO	15250-061
Tween-20	Bioshop	TWN510.500