Métodos Quantitativos para Estudar Proteína Arginina Metiltransferase 1-9 Atividade em Células

Resumo

Esses protocolos fornecem a metodologia utilizada para avaliar a atividade enzimática de membros individuais da família de proteínas metiltransferase (PRMT) nas células. Diretrizes detalhadas sobre a avaliação da atividade prmt usando biomarcadores endógenos e exógenos, anticorpos de reconhecimento de metila-arginina e compostos de ferramentas inibidoras são descritos.

Resumo

As metilatransferases proteicas (PRMTs) catalisam a transferência de um grupo de metila para resíduos de arginina de proteínas substratos. A família PRMT é composta por nove membros que podem monometilar ou resíduos de arginina monometicamente/assimetricamente dimetilato. Vários anticorpos que reconhecem diferentes tipos de metilação de arginina de várias proteínas estão disponíveis; assim, fornecendo ferramentas para o desenvolvimento de ensaios biomarcadores de atividade PRMT. Os ensaios baseados em anticorpos PRMT são desafiadores devido à sobreposição de substratos e especificidades de anticorpos à base de motivos. São discutidas essas questões e a configuração experimental para investigar a metilação de arginina contribuída por PRMTs individuais. Através da cuidadosa seleção dos substratos representativos que são biomarcadores para oito dos nove PRMTs, foi projetado um painel de ensaios de atividade PRMT. Aqui, são relatados os protocolos de ensaios celulares que medem quantitativamente a atividade enzimática de membros individuais da família PRMT nas células. A vantagem dos métodos descritos é seu desempenho direto em qualquer laboratório com cultura celular e capacidades fluorescentes de manchas ocidentais. A especificidade do substrato e a confiabilidade dos anticorpos escolhidos foram totalmente validadas com abordagens de knockdown e superexpressão. Além das diretrizes detalhadas dos biomarcadores e anticorpos de ensaio, também são fornecidas informações sobre o uso de uma ferramenta inibidora de coleta de compostos para PRMTs.

Introdução

A metilação arginina é uma importante modificação pós-translacional que regula as interações proteína-proteína e proteína-RNA, desempenhando assim um papel importante em vários processos celulares, como emenda pré-mRNA, dano de DNA, resposta à transcrição e transdução mediada pelo fator de crescimento^1,2. A arginina é metilada por proteínas metiltransferases de arginina (PRMTs) resultando em arginina monometil (Rme1), dimetilarginina assimétrica (Rme2a), ou dimetilarginina simétrica (Rme2s)³. Com base no tipo de metilação, os PRMTs são classificados em três grupos: Tipo I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 e 8), que catalisam a dimetilação mono e assimétrica; Tipo II (PRMT5 e PRMT9), que catalisam a dimetilação mono e simétrica; e Tipo III (PRMT7), que só pode monometilato arginina³.

Devido a um número crescente de anticorpos específicos da metilação de arginina disponíveis comercialmente, a atividade prmt pode ser medida usando manchas ocidentais. A mancha ocidental baseada em fluorescentes é a técnica preferida em relação à detecção de chemiluminescente devido a um maior alcance dinâmico e linearidade, maior sensibilidade e permitindo multiplexagem⁴. Para quantificar os níveis de metilação proteica, é necessária a normalização do sinal de metilação para níveis totais de proteína. Ao escolher os anticorpos para proteína total e metilada criada em diferentes espécies hospedeiras (por exemplo, rato e coelho), anticorpos secundários rotulados com fluoroforos diferentes podem ser usados e o sinal para ambos os anticorpos pode ser determinado na mesma faixa amostral. Anticorpos de metil-arginina foram desenvolvidos para identificar e caracterizar proteínas monometiladas, assimetricamente, ou simetricamente dimetiladas onde a metil-arginina é encontrada em um contexto específico. Uma vez que a maioria dos PRMTs metilato glicina e motivos ricos em arginina dentro de seus substratos^5,vários anticorpos foram criados para os peptídeos contendo monometo ou assimétrico, dimetil-arginina-glicina simétrica repete como D5A12, ASYM24, ou ASYM25, e SYM111, respectivamente. Outros anticorpos de metila-arginina foram gerados contra uma biblioteca de peptídeos contendo dimetil-e-meginina assimétrica, simétrica e monometil em um contexto repetido facilitando a detecção de metil-arginina nestes contextos particulares⁶. Há também um número crescente de anticorpos que reconhecem marca de arginina específica em uma única proteína que permitem a detecção seletiva de metilação, como histone H4R3me2a ou BAF155-R1064me2a.

Existem vários inibidores prmt disponíveis comercialmente, que podem ser usados como ferramentas para ensaios celulares PRMT. No entanto, nem todos eles são completamente caracterizados para seletividade e efeitos fora do alvo e alguns devem ser usados com cautela. O Consórcio Genômico Estrutural, em colaboração com laboratórios acadêmicos e parceiros farmacêuticos, desenvolveu inibidores PRMT potentes, seletivos e permeáveis por células (sondas químicas) que podem ser usados sem restrições pela comunidade científica. Informações sobre esses inibidores podem ser encontradas em https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics e https://www.chemicalprobes.org/. Sondas químicas são inibidores de pequenas moléculas com IC₅₀ ou K_d in vitro d < 100 nM, mais de 30 vezes de seletividade sobre proteínas da mesma família, e atividade celular significativa a 1 μM. Além disso, cada sonda química tem um análogo químico próximo que está inativo contra o alvo pretendido^{7,8,9,10,11,12}.

O objetivo deste protocolo é medir a atividade celular de membros individuais da família PRMT utilizando o método fluorescente de mancha ocidental. Aqui são fornecidas informações detalhadas sobre biomarcadores de ensaio validados, anticorpos e potentes inibidores ativos celulares, bem como estratégias valiosas para implementação bem-sucedida de ensaios.

Protocolo

1. Cultivo de células e revestimento

NOTA: Células de cultura com mídia recomendada e testam rotineiramente para contaminação por mycoplasma. As células HEK293T, MCF7 e C2C12 foram escolhidas como exemplos, uma vez que essas linhas celulares foram usadas com sucesso em ensaios PRMT.

1. Cultura HEK293T, MCF7 e C2C12 em DMEM suplementadas com 10% de soro bovino fetal (FBS), penicilina (100 U mL⁻¹⁾e estreptomicina (100 μg mL⁻¹) em pratos tratados com cultura tecidual (TC) de 10 cm.
2. Para o ensaio PRMT8, cresça células HEK293T indutíveis PRMT1 indutíveis em mídia contendo doxiciclina (2 μg/mL) por 3 dias antes do início do ensaio.
3. Para emplacar as células, remova e descarte a mídia da placa.
4. Adicione 10 mL de PBS (sem Ca⁺² e Mg⁺² íons) para lavar as células e descartar a solução.
5. Adicione 1 mL de Trypsin-EDTA (0,25%), incubar por 1 min a temperatura ambiente (RT) e, em seguida, descartar a solução. Incubar até que as células se tornem redondas e se desprendem da placa. Toque na placa para ajudar a desapegar as células, se necessário. Para células de difícil de testar, como C2C12, incubar a placa por 1-2 min a 37 °C.
   NOTA: Evite a exposição celular à solução de trippsina por períodos mais longos (>10 min), pois reduzirá a viabilidade celular.
6. Adicione 1 mL de mídia pré-armada à placa, e delicadamente células pipetas para cima e para baixo para quebrar aglomerados de células. Transfira as células para um tubo de 15 mL e adicione 3-5 mL de mídia.
7. Para medir o número celular, misture 10 μL de células com 10 μL de azul Trypan e transfira 10 μL para hemócitometro ou use qualquer outro método de contagem de células.
8. Diluir células à densidade celular recomendada e colocar 500 μL/bem em placas TC de 24 poços(Tabela 1). Para ensaios endógenos (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 e PRMT9), passe para a Etapa 3.1.

2. Transfecção celular

1. Para ensaios exógenos (PRMT3, PRMT6, PRMT8) transfetá-lo com a quantidade recomendada de DNA (Tabela 2). As células HEK293T são fáceis de transerficar para que qualquer reagente de transfecção possa ser usado, seguindo as instruções do fabricante.

3. Tratamento composto

NOTA: Não exceda a concentração final de sulfóxido de dimetil (DMSO) de 0,1% na mídia cultural. Mantenha a mesma concentração de DMSO em cada poço. Os inibidores seletivos prmt (sondas químicas) e seus análogos inativos intimamente relacionados podem ser encontrados na Tabela 3.

1. Para ensaios endógenos (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 e PRMT9), remova a mídia das células e substitua por 500 μL de mídia apenas por composto ou DMSO (controle).
   NOTA: Geralmente leva 2 dias para observar uma redução de mais de 80% nos níveis de metilação R.
2. Para ensaios exógenos (PRMT3, PRMT6, PRMT8), remover a mídia 4h após a transfecção, adicionar 500 μL de mídia apenas com composto ou DMSO (controle) e incubar por 20-24 h.

4. Preparação de lise celular

1. Remova todas as mídias dos poços, lave com 100 μL de PBS para remover a mídia residual e adicione 60 μL de tampão de lise (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM ácido trionáctico de 1 mM (EDTA), 10 mM MgCl₂, 0,5% Triton X-100, 12,5 U mL-1 benzonase, coquetel inibidor completo de protease sem EDTA) para cada poço.
   1. Incubar por menos de 1 min no RT, balançando a placa para distribuir o tampão de lise sobre as células. Em seguida, adicione 3 μL de 20% de sulfato de dodecyl de sódio (SDS), a uma concentração final de 1 % e misture tremendo suavemente. Transfira lysate em tubos de microcentrifuuagem e mantenha-o no gelo.
      NOTA: Adicione benzonase e coquetel inibidor de proteínas fresco antes de usar. A adição de benzonase hidrolisa rapidamente ácidos nucleicos que reduzem a viscosidade lisásica celular.
2. Determine a concentração proteica das amostras usando o Kit de Ensaio de Proteína BCA ou use qualquer outro método que tolere 1% de SDS na solução.
   1. Adicione 2 μL de normas de lise e proteína (0, 1, 2, 4 e 8 μg/mL de BSA no tampão de lise) nos poços da placa 96-bem clara.
   2. Misture o reagente A com o reagente B na proporção 50:1 e adicione 200 μL por poço. Incubar por 20 min a 37 °C e ler a absorvência.
3. Ajuste a concentração proteica com tampão de lise para ser igual nas amostras.
4. Adicione 20 μL de 4x Tampão de carga a 60 μL de liseto celular e aqueça a 95 °C por 5 min. Após a desnaturação do calor, os lises podem ser armazenados a -20 °C.

5. Análise de manchas ocidentais

1. Carregar 5-20 μg de lysato celular total para análise de proteínas histonas e 20-100 μg para outras proteínas em um gel de proteína Bis-Tris de 4-12%.
2. Execute o gel em MPS SDS em buffer de execução (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS w/v, 1 mM EDTA, pH 7.7) por cerca de 2 h a 100 V ou até que a frente de corante atinja a parte inferior do gel.
3. Se realizar uma transferência molhada, monte o sanduíche de transferência no tampão de transferência Tris-Glycine gelado (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 20% v/v metanol e 0,05% w/v SDS).
   1. Coloque esponjas, papel filtro, membrana PVDF e gel de acordo com as instruções do fabricante. Ative a membrana PVDF mergulhando em metanol e gel equilibrado no buffer de transferência para 30 s antes da montagem.
      NOTA: Use membrana de mancha ocidental PVDF recomendada, pois possui baixa autofluorescência e adequação para proteínas de baixo peso molecular, como histones(Tabela de Materiais).
4. Transfira proteínas do gel para a membrana PVDF no buffer de transferência Tris-Glycine a 70 V por 1,5 h no gelo.
5. Bloqueie a membrana por 30 minutos no tampão de bloqueio (5% de leite w/v em soro fisiológico tamponado por fosfato, PBS). Enxágüe com tampão de lavagem (PBST: 0,1% v/v Tween-20 em PBS) e incubar com anticorpos primários na solução de albumina de soro bovino (BSA) (5% BSA em PBST) durante a noite a 4 °C(Tabela 3).
   NOTA: Para um armazenamento mais longo, o filtro esteriliza a solução BSA, adicione 0,02% de azida de sódio w/v e mantenha a 4 °C.
6. Lave a membrana 3 x 5 min com PBST. Em seguida, incubar com anticorpos anti-coelho de cabra (IR800) e anti-rato de burro (IR680) em tampão de bloqueio recomendado(Tabela de Materiais, Tabela 3) por 30 min na RT e lavar 3 x 5 min com PBST.
7. Leia o sinal em um imager de manchas ocidentais fluorescentes a 800 e 700 nm. Use preferencialmente o instrumento que permite imagens de bandas fortes e fracas claramente em uma única imagem com alta sensibilidade e alcance dinâmico, alta relação sinal-ruído, um aviso quando uma saturação de imagem é atingida, bem como multiplexação de duas cores fluorescentes na mesma faixa de amostra.
8. Determine as intensidades da banda para análise de manchas ocidentais usando um software apropriado para imagens ocidentais fluorescentes.

Resultados

Exemplos de resultados de manchas ocidentais para ensaios celulares de PRMTs individuais são apresentados abaixo. Os detalhes dos ensaios também são resumidos na Tabela 4.

Ensaio PRMT1
PRMT1 é o principal contribuinte para a histone 4 arginina 3 dimetilação assimétrica (H4R3me2a) nas células¹³. Após a perda da atividade PRMT1, os níveis globais de Rme1 e Rme2s aumentam significativamente¹³. Como mostrado nas Figuras 1A e 1B,vários anticorpos podem ser usados para monitorar mudanças globais em Rme1, Rme2a, Rme2s, bem como H4R3me2a. Uma diminuição significativa nos níveis globais de Rme2a e H4R3me2a e aumentos em Rme1 e Rme2s pode ser observada após 3 dias de knockdown PRMT1 (Figura 1A,B). As linhas celulares diferem no sinal basal H4R3me2a, portanto, para facilitar o monitoramento da perda de atividade PRMT1, podem ser utilizadas linhas celulares como MCF7 com altos níveis de metilação basal(Figura 1C). O tempo ideal para observar o efeito da inibição prmt1, por exemplo, no tratamento com o inibidor do tipo I PRMT MS023⁸, é de 2 dias(Figura 1D,1E). O tratamento mais longo resulta em redução da viabilidade celular e crescimento.

Ensaio PRMT3
Para o ensaio celular PRMT3, não foram detectadas proteínas biomarcadores seletivas que alteram a metilação na mancha ocidental após o knockdown ou a superexpressão do PRMT3. PRMT3 mostrou-se assimetricamente dimetilato H4R3 in vitro¹⁴, no entanto, a marca é predominantemente depositada por PRMT1, e, portanto, um ensaio exógeno com PRMT3 superexpresso foi projetado. Consistente com achados in vitro, a superexpressão do PRMT3 do tipo selvagem, mas não seu mutante catalítico (E338Q) levou a um aumento nos níveis de H4R3me2a(Figura 2A). As células HEK293T foram utilizadas por terem baixa metilação basal desta marca(Figura 1C). O ensaio foi ainda validado com o inibidor seletivo PRMT3 SGC707⁷, que inibiu a metilação assimétrica H4R3 dependente do PRMT3 (Figura 2B).

Ensaio PRMT4
PRMT4 dimetilatos assimétricos BAF155 em arginina 1064¹⁵. Como o anticorpo detectador BAF165-R1064me2a está comercialmente disponível, a atividade PRMT4 nas células pode ser monitorada por mancha ocidental detectando as alterações nos níveis de marca R1064me2a. A perda de proteína PRMT4 ou inibição da atividade catalítica com o inibidor seletivo PRMT4, TP-064¹⁰, resulta em diminuição nos níveis BAF165-R1064me2a(Figura 3). Um tratamento de 2 dias geralmente é suficiente para remover a maior parte do sinal de metilação.

Ensaio PRMT5
PRMT5 é responsável pela maioria da dimetilação siginina sintina. Foi relatado anteriormente que as várias proteínas complexas de SMN, incluindo smBB', são substratos PRMT5¹⁶. A atividade PRMT5 pode ser monitorada olhando para mudanças nos níveis globais de dimetilação de arginina simétrica ou dimetilação simétrica das proteínas da SmBB. O knockdown do PRMT5, mas não PRMT1, 3, 4, 6 e 7 resulta em uma diminuição nos níveis globais de Rme2s(Figura 4A). Na maioria das linhas celulares, o tratamento de células com inibidores seletivos PRMT5 LLY-283¹¹ e GSK591 por 2-3 dias suprimiu a maior parte do sinal SmBB'Rme2s(Figura 4B). A maioria das células são sensíveis à inibição prmt5, o que resulta em uma diminuição na proliferação celular e morte celular com exposição prolongada do inibidor.

Ensaio PRMT6
Foi relatado que o PRMT6 é o principal contribuinte para a histona H3 arginina 2 dimetilação assimétrica (H3R2me2a) nas células¹⁷. Nas células HEK293T, o knockdown PRMT6 por 3 dias não foi suficiente para observar uma diminuição significativa nos níveis de H3R2me2a. No entanto, a superexpressão do tipo selvagem PRMT6, mas não seu mutante catalítico (V86K/D88A) aumenta os níveis de H3R2me2a, bem como H3R8me2a e H4R3me2a(Figura 5A). Existem vários inibidores que inibem a atividade PRMT6 com diferentes potências e seletividade: inibidor PRMT6 seletivo e alusérico SGC6870¹⁸, inibidor PRMT tipo I MS023⁸e inibidor PRMT4/6 MS049⁹. Todos estes PRMT6 dependentes inibidos H3R2 (Figura 5B),bem como dimetilação assimétrica H4R3 e H3R8 (dados não mostrados).

Ensaio PRMT7
Os monometilados PRMT7 arginina 469 em formas constitutivas e indutíveis de HSP70 (HSPA8 e HSPA1/6, respectivamente)¹². Embora não existam anticorpos disponíveis comercialmente, que detectem os níveis de HSP70-R469me1, a marca pode ser detectada com anticorpos monometonas. A perda de proteína PRMT7 ou inibição da atividade catalítica com o inibidor seletivo PRMT7, SGC3027¹², resulta na diminuição dos níveis de HSP70-R469me1 (Figura 6A, B). SGC3027 é um prodrug permeável celular, que em células é convertido por reductases para o inibidor seletivo PRMT7 SGC8158, portanto a potência celular pode diferir entre as linhas celulares. Várias linhas de células cancerígenas expressam isoformas indutíveis de HSP70 em altos níveis, e a metilação pode ser difícil de detectar devido a uma faixa inespecífica sobreposta de origem nuclear(Figura 6C). Portanto, para o ensaio celular PRMT7, são recomendadas linhas celulares que expressam principalmente HSPA8 como C2C12, ou uma vez que o HSP70 localiza principalmente no citoplasma, determinam os níveis de HSP70-R469me1 na fração citoplasmática das linhas celulares preferenciais.

Ensaio PRMT8
PRMT8 é o único PRMT com um padrão de expressão restrito ao tecido - em grande parte expresso no cérebro¹⁹. Ele compartilha 80% de similaridade de sequência e tem uma preferência de substrato semelhante ao PRMT1¹⁹. Difere do PRMT1 principalmente no N-terminus, onde a miristoitação resulta na associação de PRMT8 com a membrana plasmática²⁰. Foi relatado que PRMT8 juntamente com prMT1 metilatos proteína de ligação RNA EWS²¹. Uma vez que a atividade PRMT8 é baixa em linhas celulares não neuronais e o EWS também pode ser metilado por PRMT1, um ensaio no qual o PMRT8 é co-expresso juntamente com o EWS em células knockdown PRMT1 foi desenvolvido. Uma vez que o PRMT1 é um gene essencial e sua perda de longo prazo resulta em morte celular, um sistema indutível no qual o PRMT1 é derrubado por 3 dias antes do uso no ensaio PRMT8(Figura 7A). A co-expressão do PRMT8 do tipo selvagem, mas não catalicamente inativo mutante (E185Q), juntamente com o EWS resultou em aumento dos níveis de dimetilação assimétrica EWS(Figura 7B). Vários anticorpos dimetilarginina assimétricas foram testados e a metilação só foi detectada com anticorpo Asym25. O ensaio foi ainda validado com uma sonda química seletiva PRMT tipo I, MS023⁸, que diminuiu a dimetilação assimétrica dependente de PRMT8 de EWS exógeno (Figura 7B). Embora o MS023 seja muito potente na inibição do PRMT8 em ensaios in vitro, nas células altas concentrações de MS023 são necessárias para ver a inibição da metilação²¹.

Ensaio PRMT9
PRMT9 foi mostrado para dimetilato simetricamente SAP145 em arginina 508²². Infelizmente, nenhum anticorpo comercialmente disponível pode reconhecer a marca. Para o ensaio PRMT9, foram utilizados anticorpos que foram gentilmente dotados pelo Dr. Yanzhong Yang (Beckman Research Institute of City of Hope). Quando superexpresso, tipo selvagem, mas não R508K mutante SAP145 é metilado por PRMT9 (Figura 8A). O ensaio foi projetado para monitorar os níveis de SAP145-R508me2s endógenos e foi validado com o Composto X, um protótipo do inibidor PRMT9 (trabalho em andamento, ainda não publicado), que inibe potentemente PRMT9 in vitro com potência nanomolar. Composto X diminuiu os níveis de SAP145-R508me2s de forma dependente de dose(Figura 8B).

Figura 1. Ensaio celular PRMT1. ( A )Oknockdown PRMT1 resulta em uma diminuição da dimetilação assimétrica assimétrica global de arginina (Rme2a) e aumento dos níveis de dimetilação de arginina simétrica (Rme2s) e monometilação (Rme1). A eficiência de knockdown PRMT1 é apresentada no painel B. (B) PRMT1 knockdown diminui a dimetilação assimétrica de histone H4R3 (H4R3me2a). (C) Os níveis basais de H4R3me2a diferem entre diferentes linhas celulares. (D) O inibidor de PRMT tipo I MS023 diminui os níveis de H4R3me2a de forma dependente de dose. As células MCF7 foram tratadas com MS023 por 2 dias. (E) O gráfico representa o ajuste não linear das intensidades de sinal H4R3me2a normalizadas para total de histona H4. MS023 IC50 = 8,3 nM (n=1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Ensaio celular PRMT3. (A) A superexpressão do tipo selvagem (WT), mas não o mutante catalítico E338Q do PRMT3 aumenta os níveis de H4R3me2a em células HEK293T. As células foram transfectadas com PRMT3 marcado por BANDEIRA por 24 h. (B) Inibidor seletivo PRMT3, SGC707, diminui a desmetilação assimétrica HMT3 dependente de HMT3 Ectópica Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Ensaio celular PRMT4. ( A )Oknockdown PRMT4 resulta em uma diminuição da dimetilação assimétrica de arginina BAF155-R1064 (células HEK293T). (B) Inibidor seletivo PRMT4, TP-064, diminui os níveis BAF155-R1064Rme2a. As células HEK293T foram tratadas com composto por 2 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Ensaio celular PRMT5. ( A )Oknockdown PRMT5 resulta em uma diminuição dos níveis globais de dimetilação de arginina simétrica (células MCF7). (B) Inibidores seletivos PRMT5 GSK591 e LLY-283, diminuem a dimetilação de arginina siginina siginina da SmBB (verde), enquanto os níveis totais de SmBB permanecem inalterados (vermelho). As células MCF7 foram tratadas com compostos por 2 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Ensaio celular PRMT6. (A) A superexpressão do tipo selvagem (WT) mas não v86K/D88A mutante catalítico PRMT6 aumenta os níveis de H4R3me2a, H3R2me2a e H3R8me2a em células HEK293T. As células foram transfectadas com PRMT6 marcado por BANDEIRA por 24 h. (B) Inibidor seletivo PRMT6 (SGC6870), inibidor PRMT tipo I (MS023) e inibidor PRMT4/6 (MS049) diminuem os níveis de H3R2me2a dependentes de PRMT6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Ensaio celular PRMT7. (A) O nocaute PRMT7 resulta em uma diminuição da monometilação HSP70-R469 (células HCT116). (B) Inibidores seletivos PRMT7, SGC3027, diminui a monometilação HSP70-R469 em células C2C12. As células foram tratadas com composto por 2 dias. (C) A detecção de metilação HSP70-R469 de HSP70 indutível (HSPA1/6) com anticorpos de arginina monometil (Rme1) pode ser difícil devido a uma faixa inespecífica sobreposta de origem nuclear. Recomenda-se medir os níveis de metilação de HSP70 na fração citoplasmática. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Ensaio celular PRMT8. (A) A metilação PRMT8 de EWS pode ser detectada quando a atividade PRMT1 é inibida por knockdown. As células HEK293T foram transduzidas com um vetor de knockdown PRMT1 indutível. Após 3 dias de tratamento de doxiciclina, os níveis de PRMT1 foram drasticamente reduzidos. (B) Quando o PRMT1 é derrubado, o Exógeno EWS é assimimetricamente dimetilado por prmt8 tipo selvagem superexpresso, mas não mutante catalítico (E185Q) de PRMT8. A metilação é diminuída por uma alta concentração do inibidor prmt tipo I (MS023). As células HEK293T PRMT1KD foram co-transintraídas com o tipo selvagem PRMT8 marcado por BANDEIRA ou mutante catalítico e EWS marcado por GFP e tratados com MS023 por 20 h. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8. Ensaio celular PRMT9. (A) Tipo selvagem, mas não R508K mutante SAP145 é metilado por PRMT9. As células HEK293T foram transfectadas com SAP145 com etiqueta GFP por 1 dia. (B) O protótipo do inibidor PRMT9 (Composto X) diminui a dimetilação simétrica R508 dependente de PRMT9 de SAP145 de forma dependente de dose. As células HEK293T foram tratadas com o composto por 2 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

PRMT	Células	Densidade por ml
PRMT1	MCF7	1 x 105
PRMT3	HEK293T	2 x 105
PRMT4	HEK293T	1 x 105
PRMT5	MCF7	1 x 105
PRMT6	HEK293T	2 x 105
PRMT7	C2C12	1 x 105
PRMT8	HEK293T (PRMT1 KD)*	2 x 105
PRMT9	HEK293T	2 x 105
*tratar células com doxiciclina (2 μg/mL) 3 dias antes de emplacar para ensaio PRMT8

Mesa 1. Tipos e densidades de células recomendadas para ensaios PRMT.

PRMT	μg DNA/24-well	Addgene #	Notas adicionais
PRMT3	0.5 BANDEIRA-PRMT3	164695
	ou 0,5 FLAG-PRMT3 (E338Q)	164696
PRMT6	0.5 BANDEIRA-PRMT6	164697
	ou 0,5 FLAG-PRMT6(V86K/D88A)	164698
PRMT8	0,05 EWS-GFP	164701
	0.45 PRMT8-FLAG	164699
	ou 0,45 PRMT8(E185Q)-FLAG	164700
PRMT9	0.05 SAP145-GFP	NA	presente do Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope
	ou 0,05 SAP145-R508K-GFP
	0,45 vetor vazio

Mesa 2. A concentração de DNA recomendada para o experimento de transfecção.

PRMT	anticorpo	Sonda química (atividade celular IC50)	Controle negativo
PRMT1	H4R3me2a (1:2000)	MS023 -PRMT tipo I	MS094
	Rme1 (1:1000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM, respectivamente)
	Rme2s (1:2000)
	Rme2a (1:2000)
	Rme2a (ASYM24, 1:3000)
	Rme2a (ASYM25, 1:2000)
	H4 (1:2000)
	B-actin (1:500 )
PRMT3	H4 (1:2000)	SGC707 (IC50 = 91 nM)	XY-1
	H4R3me2a (1:2000)
	BANDEIRA (1:5000)
PRMT4	BAF155 (1:200)	TP-064 (IC50 = 43 nM)	TP064N
	BAF155-R1064me2a (1:3000)	SKI-73 (IC50 = 540 nM)*	SKI-73N*
PRMT5	anti-SmBB' (1:100)	LLY-283 (IC50 = 30 nM)	LLY-284
	Rme2s (#13222, 1:2000)	GSK591 (IC50 = 56 nM)	SGC2096
PRMT6	H4R3me2a (1:2000)	SGC6870 (IC50 = 0,9 μM)	SGC6870N
	H4 (1:2000)	MS023 -PRMT tipo I	MS094
	H3R2me2a ( 1:2000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM, respectivamente)
	H3R8me2a (1:2000)	MS049 (PRMT 4, 6 IC50 = 970, 1400 nM, respectivamente)	MS049N
	H3 ( 1:5000)
	BANDEIRA ( 1:5000)
PRMT7	Rme1 (1:1000)	SGC3027 (IC50 = 1300 nM) *	SGC3027N*
	Hsp/Hsc70 (1:2000)*
PRMT8	GFP (1:3000)	MS023 (50 μM)	MS094
	Rme2a (ASYM25,1:2000)
	BANDEIRA (1:5000)
PRMT9	SAP145 (1:1000)
	SAP145-R508me2s -presente tipo do Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope (1:1000) (PIMID: 25737013)
Anticorpos secundários	cabra-anti-coelho IgG-IR800 (1:5000)
	burro anti-mouse IgG-IR680 (1:5000)
*- anticorpo reconhece HSPA8, HSPA1 e HSPA6 (testados com proteínas com etiqueta gfp superexpressas), *prodrug – o IC50 pode diferir entre várias linhas celulares

Mesa 3. Anticorpos recomendados e compostos de ferramenta de controle químico PRMT/negativo.

PRMT

Biomarcador

Leitura de ensaio

Validação de ensaios

Linha celular recomendada

Ref.

PRMT1

H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a

Os níveis de H4R3me2a normalizaram para os níveis totais de Rme1 global de H4, Rme2a ou Rme2s normalizados para B-actin.

O knockdown do PRMT1 diminuiu os níveis basais de H4R3me2a e Rme2a global e aumentou os níveis globais de Rme1 e Rme2s em células (Fig.1A, B). A sonda química PRMT Tipo I MS023 diminuiu os níveis de H4R3me2a de forma dependente de dose (Fig. 1D).

As células diferem nos níveis basais de H4R3me2a (Fig. 1C). As células MCF7 possuem altos níveis basais de H4R3me2a, o que o torna preferível para ensaios que monitoram a diminuição da atividade PRMT1.

8

PRMT3

H4R3me2a

Níveis de metilação H4R3me2a causados por PRMT3 WT com marca de BANDEIRA exógena ou mutante E338Q catalítico (fundo) normalizados para total histone H4

A superexpressão do tipo selvagem PRMT3, mas não seu mutante catalítico (E338Q) aumentou h4R3me2a (Fig. 2A). Inibidor seletivo PRMT3 SGC707 diminuiu o aumento dependente de PRMT3 nos níveis de H4R3me2a (Fig. 2B)

As células HEK293T têm baixos níveis basais de H4R3me2a (Fig 1C), o que é preferível para monitorar a atividade exógena PRMT3

7

PRMT4

BAF155-R1064me2a

Níveis BAF155-R1064me2a normalizados para o total de BAF155

O knockdown PRMT4 diminuiu a dimetilação assimétrica de BAF155 (Fig. 3A). O tratamento de 2 dias com sonda química seletiva PRMT4 (TP-064) diminuiu a dimetilação assimétrica de BAF155 (Fig. 3B).

Qualquer linha celular

10

PRMT5

SmBB'-Rme2s

Os níveis de SmBB'-Rme2s detectados com anticorpos pan Rme2s (CST) normalizados para total de SmBB'

O knockdown do PRMT5 resultou na diminuição dos níveis de dimetilação simétrica da SmBB (Fig. 4A). Tratamento de 2 dias com sondas químicas seletivas PRMT5, GSK591 e LLY285, diminuiu os níveis de SmBB'-Rme2s (Fig. 4B).

Qualquer linha celular

11

PRMT6

H4R3me2a H3R2me2a H3R8me2a

Os níveis de metilação H4R3me2a, H3R2me2a ou H3R8me2a são aumentados por PRMT6 WT, com marca de BANDEIRA exógena, mas não catalítica V86K, mutante D88A (fundo) normalizado para total histona H4 ou H3, respectivamente

A superexpressão dos níveis prmt6 tipo selvagem, mas não seu mutante catalítico (V86K,D88A) aumentou os níveis de H3R2me2a, H3R8me2a e H4R3me2a (Fig. 5A). Inibidor alusico PRMT6 (SGC6870), inibidor prmt tipo I MS023 , inibidor PRMT4/6 MS049 diminuiu o aumento dependente prmt6 nos níveis de H3R2me2a (Fig. 5B).

As células HEK293T têm baixos níveis de H4R3me2a basal, H3R2me2a e H3R8me2a, o que é preferível para monitorar a atividade exógena PRMT6

8,9

PRMT7

HSP70-R469me1

Os níveis de metilação HSP70-Rme1 normalizados para o total de HSP70

Nocaute ou knockdown PRMT7 reduziu a monometilação HSP70 (Fig. 6A). Tratamento de 2 dias com sonda química seletiva PRMT7 SGC3027 diminuiu a monometilação HSP70 dependente de PRMT7 de forma dependente de dose (Fig. 6B).

C2C12, HT180 Várias linhas de células cancerígenas expressam uma forma indutível de HSP70 cujo sinal de metilação se sobrepõe a uma proteína inespecífica de origem nuclear (Fig. 6C). Neste caso, recomendamos analisar os níveis de metilação de HSP70 na fração citoplasmática.

12

PRMT8

EWS-Rme2a

Níveis de metilação EWS com etiqueta GFP exógenos causados por fógenos PMT ou mutante catalítico E185Q (fundo), normalizados para sinal GFP total em células KO PRMT1.

Superexpressão do tipo selvagem PRMT8 mas não catalítico E185Q mutante metilado ectópico eWS apenas em células PRMT1 KD (Fig. 7A). PrMT tipo I sonda química MS023 inibiu dimetilação assimétrica de EWS exógeno por PRMT8 (Fig. 8B).

HEK293T PRMT1 KD (indutível). O knockdown PRMT1 resulta em morte celular, por isso recomendamos o uso de um sistema indutível.

8

PRMT9

SAP145-R508me2s

Dimetilação simétrica dependente PRMT9 SAP145 em R508 normalizada para SAP145

A perda PRMT9, mas não PRMT5, leva à diminuição da dimetilação simétrica do SAP145. O SAP145 WT com etiqueta GFP, mas não o SAP145mut (R508K) foi metilado por PRMT9 (Fig. 8A). Tratamento de 2 dias com Copound X, o inibidor do protótipo PRMT9, diminuiu os níveis de SAP145-R508me2s de forma dependente de dose Fig 8B).

Qualquer linha celular

21

Mesa 4. PrMT ensaios resumo.

Discussão

Aqui, são descritos os protocolos detalhados de ensaio celular para membros da família PRMT que usam métodos fluorescentes de manchas ocidentais. Substratos únicos para os quais as alterações na metilação de arginina podem ser facilmente detectadas após perda individual de PRMT ou inibição catalítica e não podem ser compensadas por outros membros da família. Algumas proteínas são metiladas por múltiplos PRMTs^21,23, sugerindo uma sobreposição na especificidade do substrato onde alguns PRMTs contribuem apenas com uma pequena quantidade de marca celular em um determinado substrato proteico^24,25,26,27, por exemplo, tanto PRMT8 quanto PRMT1 contribuem para a metilação de EWS. Portanto, cada ensaio exigia validação minuciosa de substratos e anticorpos com experimentos de knockdown e/ou superexpressão e posterior validação com inibidores seletivos bem caracterizados. Foram identificados substratos específicos de PRMT para os quais alterações de marca de metilação poderiam ser detectadas dentro de 2-3 dias após a perda/inibição de PRMT para evitar efeitos compostos de viabilidade celular reduzida e proliferação que podem afetar indiretamente os níveis de marca de metil-arginina. Embora fosse possível encontrar substratos únicos para PRMT1, 4, 5, 7 e 9; para PRMT3, 6 e 8, o ganho de função tinha que ser empregado. Vários anticorpos específicos de metila de arginina foram testados para vários alvos celulares, mas nenhum foi capaz de detectar alterações significativas dentro de 3 dias após o knockdown prmt3 e PRMT6; portanto, os ensaios biomarcadores foram desenvolvidos usando enzimas expressas em êxtase juntamente com mutantes catalicamente inativos, que serviram como controle para a metilação do substrato de linha de base. PRMT8 é um homólogo prmt1 próximo e compartilha preferências semelhantes de substrato. Como um biomarcador seletivo PRMT8 não pôde ser identificado, um ensaio em células de knockdown PRMT1 foi desenvolvido, onde PRMT8 foi co-expresso em conjunto com o EWS. PRMT1 também é uma enzima importante responsável pela metilação assimétrica H4R3, portanto, para usar H4R3me2a como biomarcador para ensaios celulares PRMT3 e PRMT6, células com baixos níveis basais H4R3me2a foram escolhidas, bem como mutantes catalicamente inativos foram usados como controle de fundo. Embora os ensaios endógenos sejam preferidos, os ensaios exógenos se mostram inestimáveis para testar a potência celular de vários inibidores seletivos de PRMT^7,8,9. Com o conhecimento crescente da biologia PRMT, esperamos melhorar os ensaios encontrando proteínas biomarcadoras mais específicas para PRMT3, PRMT6 e PRMT8.

O uso de anticorpos validados e controles apropriados são fundamentais para o desempenho do ensaio PRMT. Todos os anticorpos recomendados aqui foram completamente validados por experimentos de knockdown e superexpressão, no entanto, as diferenças em lote a lote, especialmente no caso de anticorpos policlonais, ainda podem influenciar seu desempenho. Portanto, é crucial usar métodos genéticos e sondas químicas juntamente com seus controles negativos intimamente relacionados para confirmar a confiabilidade do ensaio. Além disso, para ensaios prmt que requerem superexpressão proteica, é crucial usar mutantes catalicamente inativos, juntamente com proteínas do tipo selvagem para determinar os níveis de metilação basal.

Esta coleção de ensaios quantitativos para traçar o perfil da atividade de PRMTs nas células pode ser amplamente útil para a comunidade científica, uma vez que pode ser implementada de forma rápida e fácil com equipamentos mínimos e conhecimento técnico limitado, envolvendo apenas técnicas básicas de cultivo de células e manchas ocidentais fluorescentes. Os anticorpos e sondas químicas recomendados para PRMTs também podem ser utilizados para ensaios de perfil de proteína baseado em atividade (ABPP) para estabelecer a adequação de uma determinada sonda ABPP, monitorar o engajamento de alvos e avaliar efeitos fora do alvo usando o formato ABPP competitivo. As abordagens de desenvolvimento de ensaios aqui discutidas também podem ser extrapoladas para outras famílias enzimáticas, como proteínas lysina-metiltransferases e acetiltransferases.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm TC dishes	Greiner bio-one	664160
24-well TC plates	Greiner bio-one	662160
4–12% Bis-Tris Protein Gels	ThermoFisher Scientiffic	NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX
Amersham Hybond P PVDF membrane	Millipore-Sigma	10600021
anti-Asym 24	Millipore-Sigma	07-414
anti-Asym 25	Millipore-Sigma	09-814
anti-B-actin	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47778
anti-BAF155	Santa Cruz Biotechnologies	sc-32763
anti-BAF155-R1064me2a	Millipore-Sigma	ABE1339
anti-FLAG (#, 1:5000)	Millipore-Sigma	F4799
anti-GFP	Clontech	632381
anti-H3	Abcam	ab10799
anti-H3R2me2a	Millipore-Sigma	04-848
anti-H3R8me2a	Rockland	600-401-I67
anti-H4	Abcam	ab174628
anti-H4R3me2a	Active Motif	39705
anti-Hsp/Hsc70	Enzo	ADI-SPA-820
anti-PRMT1	Millipore-Sigma	07-404
anti-PRMT3	Abcam	ab191562
anti-PRMT4	Bethyl	#A300-421A
anti-PRMT5	Abcam	ab109451
anti-PRMT6	Abcam	ab47244
anti-PRMT7	Abcam	ab179822
anti-Rme1	CST	8015
anti-Rme2a	CST	13522
anti-Rme2s	CST	13222
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)		09-814
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)	Abcam	ab56800
anti-SAP145-R508me2s			kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope
anti-SmBB’	Santa Cruz Biotechnologies	sc-130670
benzonase			PRODUCED IN-HOUSE
BSA	Millipore-Sigma	A7906
C2C12			gift from Dr. Stephane Richard, McGill University
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Millipore-Sigma	11873580001
DMEM	Wisent	319-005-CL
DMSO	Bioshop	DMS666.100
donkey anti-mouse IgG-IR680	Licor	926-68072
doxycycline	Millipore-Sigma	D9891
EDTA	Bioshop	EDT111.500
FBS	Wisent	80150
glycine	Bioshop	GLN002.5
goat-anti-rabbit IgG-IR800	Licor	926-32211
HEK293T			gift from Dr. Sam Benchimol, York University
Image Studio Software ver 5.2	Licor
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	ThermoFisher Scientiffic	NP0007
MCF7		ATCC® HTB-22™
NaCl	Bioshop	SOD001.1
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	ThermoFisher Scientiffic	NP0001
Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST)	Licor	927-40000	Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001
Odyssey CLX Imaging System	Licor	model number 9140
PBS (tissue culture)	Wisent	311-010-CL
PBS (western blot)	Bioshop	PBS405.4
penstrep	Wisent	450-201-EL
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientiffic	23225
SDS	Bioshop	SDS001.1
skim milk powder	Bioshop	SKI400.500
TC20 automated cell counter	Biorad	1450102
Tripsin-EDTA (0.25%)	Wisent	325-043-EL
Tris	Bioshop	TRS003.5
Tritton X-100	Bioshop	TRX506
trypan blue	GIBCO	15250-061
Tween-20	Bioshop	TWN510.500