Méthodes quantitatives pour étudier l’activité de la protéine Arginine méthyltransférase 1-9 dans les cellules

Résumé

Ces protocoles fournissent la méthodologie utilisée pour évaluer l’activité enzymatique de membres individuels de la famille de la méthyltransférase d’arginine de protéine (PRMT) dans les cellules. Des directives détaillées sur l’évaluation de l’activité de PRMT utilisant des biomarkers endogènes et exogènes, la méthyl-arginine reconnaissant des anticorps, et les composés d’outil d’inhibiteur sont décrites.

Résumé

Les méthyltransférases protéiques (PRT) catalysent le transfert d’un groupe méthyle vers des résidus d’arginine de protéines de substrat. La famille de PRMT se compose de neuf membres qui peuvent monométhyler ou symétriquement/asymétriquement diméthyler des résidus d’arginine. Plusieurs anticorps reconnaissant différents types de méthylation de l’arginine de diverses protéines sont disponibles; fournissant ainsi des outils pour le développement d’essais de biomarqueurs d’activité PRMT. Les tests basés sur les anticorps PRMT sont difficiles en raison du chevauchement des substrats et des spécificités des anticorps à base de motifs. Ces issues et l’installation expérimentale pour étudier la méthylation d’arginine contribuée par des DIFFÉRENTS PRMTs sont discutées. Grâce à la sélection minutieuse des substrats représentatifs qui sont des biomarqueurs pour huit des neuf PRMT, un panel d’essais d’activité PRMT a été conçu. Ici, les protocoles pour des analyses cellulaires mesurant quantitativement l’activité enzymatique des différents membres de la famille de PRMT dans les cellules sont rapportés. L’avantage des méthodes décrites est leur performance simple dans n’importe quel laboratoire avec des capacités de culture cellulaire et de western blot fluorescent. La spécificité du substrat et la fiabilité des anticorps choisies ont été entièrement validées avec des approches de knockdown et de surexpression. En plus des lignes directrices détaillées sur les biomarqueurs et les anticorps d’essai, des informations sur l’utilisation d’un outil inhibiteur de la collecte de composés pour les PRMF sont également fournies.

Introduction

La méthylation de l’arginine est une modification post-traductionnelle importante qui régule les interactions protéine-protéine et protéine-ARN, jouant ainsi un rôle important dans divers processus cellulaires tels que l’épissage pré-ARNm, les dommages à l’ADN, la réponse de transcription et la transduction médiée par le facteur de croissance^1,2. L’arginine est méthylée par des protéines arginine méthyltransférases (PRT) aboutissant à la monométhyl arginine (Rme1), à ladiméthylarginine asymétrique (Rme2a), ou à la diméthylarginine symétrique (Rme2s)3. Sur la base du type de méthylation, les PRMT sont classés en trois groupes: type I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 et 8), qui catalysent la diméthylation mono- et asymétrique; Type II (PRMT5 et PRMT9), qui catalysent la diméthylation mono- et symétrique; et le type III (PRMT7), qui ne peut monométhyler que l’arginine³.

En raison d’un nombre croissant d’anticorps méthylation-spécifiques d’arginine disponibles dans le commerce, l’activité de PRMT peut être mesurée utilisant le buvard occidental. Le transfert western à base fluorescente est la technique préférée à la détection chimiluminescente en raison d’une plage dynamique et d’une linéarité plus grandes, d’une sensibilité plus élevée et d’un multiplexage^4. Pour quantifier les niveaux de méthylation des protéines, la normalisation du signal de méthylation aux niveaux totaux de protéines est nécessaire. En choisissant les anticorps pour les protéines totales et méthylées élevées chez différentes espèces hôtes (p. ex. souris et lapin), des anticorps secondaires marqués avec différents fluorophores peuvent être utilisés et le signal pour les deux anticorps peut être déterminé dans la même bande d’échantillon. Des anticorps de méthyl-arginine ont été développés pour identifier et caractériser les protéines monométhylated, asymétriquement, ou symétriquement dimethylated où la méthyl-arginine est trouvée dans un contexte spécifique. Étant donné que la majorité des PRMF méthylate glycine- et les motifs riches en arginine dans leurs substrats^5,plusieurs anticorps ont été augmentés pour les peptides contenant des répétitions monométhyliques ou asymétriques et symétriques de diméthyle-arginine-glycine telles que D5A12, ASYM24, ou ASYM25, et SYM11, respectivement. D’autres anticorps de méthyl-arginine ont été générés contre une bibliothèque peptidique contenant de la diméthyle asymétrique et symétrique et de la monométhyl arginine dans un contexte de répétition facilitant la détection de la méthyl-arginine dans ces contextes particuliers^6. Il existe également un nombre croissant d’anticorps qui reconnaissent la marque d’arginine spécifique sur une seule protéine qui permettent la détection sélective de la méthylation telle que l’histone H4R3me2a ou BAF155-R1064me2a.

Il existe plusieurs inhibiteurs de la PRMT disponibles dans le commerce, qui peuvent être utilisés comme outils pour les tests cellulaires de la PRMT. Cependant, tous ne sont pas bien caractérisés pour la sélectivité et les effets hors cible et certains doivent être utilisés avec prudence. Le Consortium de génomique structurelle, en collaboration avec des laboratoires universitaires et des partenaires pharmaceutiques, a mis au point des inhibiteurs de la PRMT (sondes chimiques) puissants, sélectifs et perméables aux cellules bien caractérisés qui peuvent être utilisés sans restriction par la communauté scientifique. Des informations sur ces inhibiteurs peuvent être trouvées sur https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics et https://www.chemicalprobes.org/. Les sondes chimiques sont des inhibiteurs de petites molécules avec IC in vitro ₅₀ ou K_d < 100 nM, une sélectivité supérieure à 30 fois sur les protéines de la même famille et une activité cellulaire significative à 1 μM. De plus, chaque sonde chimique a un analogue chimique proche qui est inactif contre la cible prévue^{7,8,9,10,11,12.}

Le but de ce protocole est de mesurer l’activité cellulaire des différents membres de la famille de PRMT utilisant la méthode occidentale fluorescente de tache. Ici, des informations détaillées sur les biomarqueurs d’analyse validés, les anticorps et les inhibiteurs actifs des cellules ainsi que des stratégies précieuses pour une mise en œuvre réussie de l’essai sont fournies.

Protocole

1. Culture cellulaire et placage

REMARQUE: Culturez des cellules avec des milieux recommandés et testez régulièrement la contamination par les mycoplasmes. Les cellules HEK293T, MCF7 et C2C12 ont été choisies comme exemples puisque ces variétés de cellule ont été utilisées avec succès dans les essais PRMT.

1. Culture HEK293T, MCF7 et C2C12 dans du DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), de pénicilline (100 U mL⁻¹⁾et de streptomycine (100 μg mL⁻¹⁾dans des plats traités par culture tissulaire (TC) de 10 cm.
2. Pour le test PRMT8, cultiver des cellules HEK293T démontage inductibles PRMT1 dans un support contenant de la doxycycline (2 μg/mL) pendant 3 jours avant le début de l’essai.
3. Pour plaquer les cellules, retirez et jetez le support de la plaque.
4. Ajouter 10 mL de PBS (sans ions Ca⁺² et Mg⁺²⁾ pour laver les cellules et jeter la solution.
5. Ajouter 1 mL de Trypsine-EDTA (0,25 %), incuber pendant 1 min à température ambiante (RT), puis jeter la solution. Incuber jusqu’à ce que les cellules deviennent rondes et se détacher de la plaque. Appuyez sur la plaque pour aider à détacher les cellules, si nécessaire. Pour les cellules difficiles à trypsiniser, telles que C2C12, incuber la plaque pendant 1-2 min à 37 °C.
   REMARQUE: Évitez l’exposition cellulaire à la solution de trypsine pendant de plus longues périodes (>10 min) car cela réduira la viabilité des cellules.
6. Ajouter 1 mL de milieu pré-envahi à la plaque et pipeter délicatement les cellules de haut en bas pour briser les touffes cellulaires. Transférer les cellules dans un tube de 15 mL et ajouter 3 à 5 mL de support.
7. Pour mesurer le nombre de cellules, mélanger 10 μL de cellules avec 10 μL de bleu de Trypan et transférer 10 μL à l’hémocytomètre ou utiliser toute autre méthode de comptage cellulaire.
8. Diluer les cellules à la densité cellulaire recommandée et mettre 500 μL/puits dans des plaques TC de 24 puits(tableau 1). Pour les essais endogènes (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 et PRMT9), passez à l’étape 3.1.

2. Transfection cellulaire

1. Pour les essais exogènes (PRMT3, PRMT6, PRMT8), transfecter les cellules HEK293T avec la quantité recommandée d’ADN (tableau 2). Les cellules HEK293T sont faciles à transfecter, de sorte que n’importe quel réactif de transfection peut être utilisé, en suivant les instructions du fabricant.

3. Traitement composé

NOTA : Ne pas dépasser 0,1 % de concentration finale de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans les milieux de culture. Gardez la même concentration de DMSO dans chaque puits. Les inhibiteurs sélectifs de la PRMT (sondes chimiques) et leurs analogues inactifs étroitement apparentés se trouvent dans le tableau 3.

1. Pour les essais endogènes (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 et PRMT9), retirer les milieux des cellules et les remplacer par 500 μL de milieux par du composé ou du DMSO seul (témoin).
   REMARQUE: Il faut généralement 2 jours pour observer plus de 80% diminution des niveaux de méthylation R.
2. Pour les essais exogènes (PRMT3, PRMT6, PRMT8), retirer le milieu 4 h après la transfection, ajouter 500 μL de milieu avec du composé ou du DMSO seul (témoin) et incuber pendant 20 à 24 h.

4. Préparation du lysat cellulaire

1. Retirer tous les milieux des puits, laver avec 100 μL de PBS pour éliminer les milieux résiduels et ajouter 60 μL de tampon de lyse (20 mM tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 1 mM, MgCl 10 mM_2,Triton X-100 à 0,5 %, benzonase 12,5 U mL−1, cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTA) à chaque puits.
   1. Incuber pendant moins de 1 min à TA, en berçant la plaque pour répartir le tampon de lyse sur les cellules. Ajouter ensuite 3 μL de 20 % p/v de dodécyl sulfate de sodium (FDS), jusqu’à une concentration finale de 1 %, et mélanger en secouant doucement. Transférer le lysat dans des tubes à microcentrifugation et le garder sur la glace.
      REMARQUE: Ajouter la benzonase et le cocktail d’inhibiteurs de protéines frais avant utilisation. L’ajout de benzonase hydrolyse rapidement les acides nucléiques, ce qui réduit la viscosité du lysat cellulaire.
2. Déterminer la concentration en protéines des échantillons à l’aide de la trousse d’analyse des protéines BCA ou utiliser toute autre méthode qui tolère 1 % de FDS en solution.
   1. Ajouter 2 μL d’étalons de lysat et de protéines (0, 1, 2, 4 et 8 μg/mL de BSA dans le tampon de lyse) dans les puits de la plaque claire de 96 puits.
   2. Mélanger le réactif A avec le réactif B au rapport de 50:1 et ajouter 200 μL par puits. Incuber pendant 20 min à 37 °C et lire l’absorbance.
3. Ajustez la concentration en protéines avec un tampon de lyse pour qu’elle soit égale dans tous les échantillons.
4. Ajouter 20 μL de tampon de chargement 4x à 60 μL de lysat cellulaire et chauffer à 95 °C pendant 5 min. Après daturation thermique, les lysats peuvent être conservés à -20 °C.

5. Analyse par transfert western

1. Chargez 5 à 20 μg de lysat cellulaire total pour l’analyse des protéines histones et 20 à 100 μg pour les autres protéines dans un gel de protéines Bis-Tris à 4-12 %.
2. Faire fonctionner le gel dans un tampon de fonctionnement MOPS SDS (MOPS 50 mM, Base Tris 50 mM, SDS w/v à 0,1%, EDTA 1 mM, pH 7,7) pendant environ 2 h à 100 V ou jusqu’à ce que le front de teinture atteigne le fond du gel.
3. Si vous effectuez un transfert humide, assemblez le sandwich de transfert dans un tampon de transfert de Tris-Glycine glacé (25 mM tris, 192 mM de glycine, 20% v / v de méthanol et 0,05% p / v SDS).
   1. Placez les éponges, le papier filtre, la membrane pvdf et le gel conformément aux instructions du fabricant. Activer la membrane PVDF en trempant dans le méthanol et équilibrer le gel dans le tampon de transfert pendant 30 s avant l’assemblage.
      REMARQUE: Utilisez la membrane buvarde occidentale PVDF recommandée car elle a une faible autofluorescence et convient aux protéines de faible poids moléculaire, telles que les histones(table des matériaux).
4. Transférer les protéines du gel à la membrane PVDF dans le tampon de transfert tris-glycine à 70 V pendant 1,5 h sur glace.
5. Bloquer la membrane pendant 30 min dans un tampon de blocage (5 % p/v de lait dans une solution saline tamponnée au phosphate, PBS). Rincer avec un tampon de lavage (PBST : 0,1 % v/v Tween-20 dans le PBS) et incuber avec des anticorps primaires dans une solution d’albumine sérique bovine (BSA) (BSA à 5 % dans le PBST) pendant la nuit à 4 °C(tableau 3).
   REMARQUE : Pour un stockage plus long, stériliser la solution BSA par filtre, ajouter 0,02 % p/v d’azide de sodium et conserver à 4 °C.
6. Laver la membrane 3 x 5 min avec du PBST. Incuber ensuite avec des anticorps anti-lapin (IR800) et anti-souris âne (IR680) dans un tampon de blocage recommandé(Table des matériaux, Tableau 3)pendant 30 min à RT et laver 3 x 5 min avec du PBST.
7. Lisez le signal sur un imageur western blot fluorescent à 800 et 700 nm. Utilisez de préférence l’instrument qui permet d’imager clairement des bandes fortes et faibles dans une seule image avec une sensibilité et une plage dynamique élevées, un rapport signal/bruit élevé, un avertissement lorsqu’une saturation d’image est atteinte ainsi que le multiplexage de deux couleurs fluorescentes dans la même bande d’échantillon.
8. Déterminer les intensités de bande pour l’analyse par transfert western à l’aide d’un logiciel approprié pour l’imagerie occidentale fluorescente.

Résultats

Des exemples de résultats de western blot pour les essais cellulaires de PRMF individuels sont présentés ci-dessous. Les détails des essais sont également résumés dans le tableau 4.

Test PRMT1
PRMT1 est le principal contributeur à la diméthylation asymétrique de l’histone 4 arginine 3 (H4R3me2a) dans les cellules^13. En cas de perte d’activité PRMT1, les niveaux mondiaux de Rme1 et Rme2s augmentent de manière significative^{de 13.} Comme le montrent les figures 1A et 1B,plusieurs anticorps peuvent être utilisés pour surveiller les changements globaux dans Rme1, Rme2a, Rme2s, ainsi que H4R3me2a. Une diminution significative des niveaux globaux de Rme2a et H4R3me2a et des augmentations de Rme1 et Rme2s peuvent être observées après 3 jours de knockdown PRMT1 (Figure 1A,B). Les lignées cellulaires diffèrent par le signal basal H4R3me2a, par conséquent, pour faciliter la surveillance de la perte d’activité PRMT1, des lignées cellulaires telles que MCF7 avec des niveaux élevés de méthylation basale peuvent être utilisées (Figure 1C). Le délai optimal pour observer l’effet de l’inhibition de PRMT1, par exemple lors d’un traitement avec un inhibiteur de prmt de type I MS023^8,est de 2 jours(figure 1D,1E). Un traitement plus long entraîne une réduction de la viabilité et de la croissance cellulaires.

Essai PRMT3
Pour le test cellulaire PRMT3, aucune protéine de biomarqueur sélectif dont la méthylation change n’a pu être détectée dans le western blot lors du knockdown ou de la surexpression de PRMT3. PRMT3 a été montré pour diméthylate asymétriquement H4R3 in vitro^14,cependant, la marque est principalement déposée par PRMT1, et donc un test exogène avec PRMT3 surexprimé a été conçu. Conformément aux résultats in vitro, la surexpression de PRMT3 de type sauvage, mais pas de son mutant catalytique (E338Q), a entraîné une augmentation des niveaux de H4R3me2a(figure 2A). Les cellules HEK293T ont été utilisées car elles présentent une faible méthylation basale de cette marque (Figure 1C). Le test a ensuite été validé avec l’inhibiteur sélectif PRMT3 SGC707^7,qui a inhibé la méthylation asymétrique H4R3 dépendante de PRMT3(figure 2B).

Test PRMT4
PRMT4 diméthylates asymétriquement BAF155 à l’arginine 1064¹⁵. Étant donné que l’anticorps détectant BAF165-R1064me2a est disponible dans le commerce, l’activité PRMT4 dans les cellules peut être surveillée par western blot en détectant les changements dans les niveaux de la marque R1064me2a. La perte de la protéine PRMT4 ou l’inhibition de l’activité catalytique avec l’inhibiteur sélectif PRMT4, TP-064¹⁰, entraîne une diminution des niveaux de BAF165-R1064me2a (Figure 3). Un traitement de 2 jours est généralement suffisant pour éliminer la majeure partie du signal de méthylation.

Test PRMT5
PRMT5 est responsable de la majorité de la diméthylation symétrique de la protéine arginine. Il a été précédemment rapporté que les différentes protéines du complexe SMN, y compris smbb', sont des substrats PRMT5¹⁶. L’activité prmt5 peut être surveillée en examinant les changements dans les niveaux globaux de diméthylation symétrique d’arginine ou de diméthylation symétrique des protéines de smbb' . L’élimination de PRMT5,mais pas de PRMT1, 3, 4, 6 et 7 entraîne une diminution des niveaux globaux de Rme2s(Figure 4A). Dans la plupart des lignées cellulaires, le traitement des cellules avec les inhibiteurs sélectifs PRMT5 LLY-283¹¹ et GSK591 pendant 2-3 jours a supprimé la majeure partie du signal SmBB’Rme2s (Figure 4B). La plupart des cellules sont sensibles à l’inhibition de PRMT5, qui se traduit par une diminution de la prolifération cellulaire et de la mort cellulaire avec une exposition prolongée aux inhibiteurs.

Test PRMT6
Il a été rapporté que PRMT6 est le principal contributeur à l’histone H3 arginine 2 diméthylation asymétrique (H3R2me2a) dans les cellules¹⁷. Dans les cellules HEK293T, le knockdown PRMT6 pendant 3 jours n’était pas suffisant pour observer une diminution significative des niveaux de H3R2me2a. Cependant, la surexpression du type sauvage PRMT6 mais pas de son mutant catalytique (V86K/D88A) augmente les niveaux de H3R2me2a, ainsi que de H3R8me2a et H4R3me2a (Figure 5A). Il existe plusieurs inhibiteurs qui inhibent l’activité PRMT6 avec une puissance et une sélectivité différentes: inhibiteur sélectif et allostérique de PRMT6 SGC6870^18,inhibiteur de PRMT de type I MS023⁸et inhibiteur DE PRMT4/6 MS049^9. Tous ces éléments inhibant le H3R2 dépendant du PRMT6(figure 5B),ainsi que la diméthylation asymétrique du H4R3 et du H3R8 (données non présentées).

Test PRMT7
PRMT7 monométhylates arginine 469 sous des formes constitutives et inductibles de HSP70 (HSPA8 et HSPA1/6, respectivement)¹². Bien qu’il n’y ait pas d’anticorps disponibles dans le commerce, qui détectent les niveaux de HSP70-R469me1, la marque peut être détectée avec des anticorps monométhyliques pan. La perte de la protéine PRMT7 ou l’inhibition de l’activité catalytique avec l’inhibiteur sélectif PRMT7, SGC3027¹², entraîne une diminution des niveaux de HSP70-R469me1 (Figure 6A, B). SGC3027 est un promédicament perméable aux cellules, qui dans les cellules est converti par les réductases à l’inhibiteur sélectif PRMT7 SGC8158, donc la puissance cellulaire peut différer entre les lignées cellulaires. Plusieurs lignées cellulaires cancéreuses expriment des isoformes HSP70 inductibles à des niveaux élevés, et la méthylation peut être difficile à détecter en raison d’une bande non spécifique d’origine nucléaire qui se chevauche (Figure 6C). Par conséquent, pour le test cellulaire PRMT7, les lignées cellulaires qui expriment principalement HSPA8 telles que C2C12 sont recommandées, ou puisque HSP70 se localise principalement dans le cytoplasme, déterminer les niveaux de HSP70-R469me1 dans la fraction cytoplasmique des lignées cellulaires préférées.

Test PRMT8
PRMT8 est le seul PRMT avec un modèle d’expression restreint aux tissus - largement exprimé dans le cerveau¹⁹. Il partage 80% de similarité de séquence et a une préférence de substrat similaire à PRMT1¹⁹. Il diffère de PRMT1 principalement au niveau du N-terminus, où la myristoylation entraîne l’association de PRMT8 avec la membrane^{plasmique 20.} Il a été rapporté que PRMT8 avec PRMT1 méthyle la protéine de liaison à l’ARN EWS²¹. Étant donné que l’activité prmt8 est faible dans les lignées cellulaires non neuronales et que l’EWS peut également être méthylé par PRMT1, un test dans lequel PMRT8 est co-surexprimé avec EWS dans les cellules de knockdown PRMT1 a été développé. Étant donné que PRMT1 est un gène essentiel et que sa perte à long terme entraîne la mort cellulaire, un système inductible dans lequel PRMT1 est renversé pendant 3 jours avant d’être utilisé dans le test PRMT8 a été utilisé(Figure 7A). La co-expression de PRMT8 de type sauvage, mais pas de mutant catalytiquement inactif (E185Q), ainsi que du SEW ont entraîné une augmentation des niveaux de diméthylation asymétrique du SEW(figure 7B). Plusieurs anticorps asymétriques de dimethylarginine ont été examinés et la méthylation a été seulement détectée avec l’anticorps d’Asym25. Le test a ensuite été validé avec une sonde chimique sélective PRMT de type I, MS023^8,qui a diminué la diméthylation asymétrique dépendante de PRMT8 des EWS exogènes(figure 7B). Bien que MS023 soit très puissant pour inhiber PRMT8 dans les essais in vitro, dans les cellules, des concentrations élevées de MS023 sont nécessaires pour voir l’inhibition de la méthylation²¹.

Test PRMT9
PRMT9 a été montré pour diméthyler symétriquement SAP145 à l’arginine 508^22. Malheureusement, aucun anticorps disponible dans le commerce ne peut reconnaître la marque. Pour le test PRMT9, des anticorps qui ont été gentiment doués par le Dr Yanzhong Yang (Beckman Research Institute of City of Hope) ont été utilisés. Lorsqu’il est surexprimé, le type sauvage mais pas le mutant R508K SAP145 est méthylé par PRMT9(Figure 8A). Le test a été conçu pour surveiller les niveaux de SAP145-R508me2 endogènes et a été validé avec le composé X, un prototype d’inhibiteur de PRMT9 (travaux en cours, pas encore publiés), qui inhibe puissamment PRMT9 in vitro avec une puissance nanomolaire. Le composé X a diminué les niveaux de SAP145-R508me2s d’une manière dépendante de la dose(Figure 8B).

Figure 1. Essai cellulaire PRMT1. (A) Prmt1 knockdown a comme conséquence une diminution de dimethylation asymétrique globale d’arginine (Rme2a) et des niveaux accrus de dimethylation symétrique d’arginine (Rme2s) et de monomethylation (Rme1). L’efficacité de knockdown PRMT1 est présentée dans le panneau B.(B)le knockdown PRMT1 diminue la diméthylation asymétrique de l’histone H4R3 (H4R3me2a). (C) Les niveaux basaux de H4R3me2a diffèrent selon les lignées cellulaires. (D) L’inhibiteur de la PRMT de type I MS023 diminue les niveaux de H4R3me2a d’une manière dépendante de la dose. Des cellules MCF7 ont été traitées avec MS023 pendant 2 jours. (E) Le graphique représente l’ajustement non linéaire des intensités de signal H4R3me2a normalisées à l’histone totale H4. MS023 IC50 = 8,3 nM (n=1). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Essai cellulaire PRMT3. (A) La surexpression du sauvage-type (WT) mais pas du mutant catalytique E338Q de PRMT3 augmente des niveaux de H4R3me2a dans les cellules HEK293T. Les cellules ont été transfectées avec FLAG-tagged PRMT3 pour 24 h. (B) inhibiteur sélectif PRMT3, SGC707, diminue prmt3 ectopique dépendante H4R3 asymétrique déméthylation S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Essai cellulaire PRMT4. (A) PRMT4 knockdown a comme conséquence une diminution de dimethylation asymétrique d’arginine BAF155-R1064 (cellules HEK293T). (B) Inhibiteur sélectif PRMT4, TP-064, diminue les niveaux de BAF155-R1064Rme2a. Des cellules de HEK293T ont été traitées avec le composé pendant 2 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Essai cellulaire PRMT5. (A) Prmt5 knockdown a comme conséquence une diminution des niveaux symétriques globaux de dimethylation d’arginine (cellules MCF7). (B) PRMT5 inhibiteurs sélectifs GSK591 et LLY-283, diminuer SmBB' diméthylation symétrique de l’arginine (vert), tandis que les niveaux totaux de SmBB' restent inchangés (rouge). Des cellules MCF7 ont été traitées avec des composés pendant 2 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Essai cellulaire PRMT6. (A) La surexpression du type sauvage (WT) mais pas V86K/D88A mutant catalytique PRMT6 augmente H4R3me2a, H3R2me2a, et les niveaux de H3R8me2a dans les cellules HEK293T. Des cellules ont été transfectées avec PRMT6 FLAG-marqué pour 24 h.(B)inhibiteur sélectif PRMT6 (SGC6870), inhibiteur de type I de PRMT (MS023), et inhibiteur PRMT4/6 (MS049) diminuer les niveaux dépendants de H3R2me2a PRMT6. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6. Essai cellulaire PRMT7. (A) PRMT7 knockout entraîne une diminution de la monométhylation HSP70-R469 (cellules HCT116). (B) les inhibiteurs sélectifs prmt7, SGC3027, diminue la monométhylation HSP70-R469 dans les cellules C2C12. Des cellules ont été traitées avec le composé pendant 2 jours. (C) La détection de la méthylation HSP70-R469 de HSP70 inductible (HSPA1/6) avec des anticorps d’arginine de monométhyle pan (Rme1) peut être difficile en raison d’une bande non spécifique de chevauchement d’origine nucléaire. Il est recommandé de mesurer les niveaux de méthylation HSP70 dans la fraction cytoplasmique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7. Essai cellulaire PRMT8. (A) PRMT8 méthylation de l’EWS peut être détectée lorsque l’activité PRMT1 est inhibée par knockdown. Des cellules HEK293T ont été transduites avec un vecteur induisible de knockdown PRMT1. Après 3 jours de traitement de doxycycline, des niveaux PRMT1 ont été drastiquement réduits. (B) Lorsque PRMT1 est renversé, l’EWS exogène est asymétriquement diméthylé par le type sauvage surexprimé PRMT8 mais pas le mutant catalytique (E185Q) de PRMT8. La méthylation est diminuée par une concentration élevée d’inhibiteur de type I de PRMT (MS023). Les cellules HEK293T PRMT1KD ont été co-transfectées avec le type sauvage PRMT8 marqué par FLAG ou le mutant catalytique et le EWS marqué par GFP et traitées avec MS023 pendant 20 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8. Essai cellulaire PRMT9. (A) Le type sauvage mais pas le mutant R508K SAP145 est méthylé par PRMT9. Des cellules HEK293T ont été transfectées avec SAP145 GFP-marqué pendant 1 jour. (B) Le prototype d’inhibiteur PRMT9 (Composé X) diminue la diméthylation symétrique prmt9 dépendante R508 de SAP145 d’une manière dépendante de la dose. Des cellules de HEK293T ont été traitées avec le composé pendant 2 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

PRMT	Cellules	Densité par ml
PRMT1	MCF7	1 x 105
PRMT3	HEK293T	2 x 105
PRMT4	HEK293T	1 x 105
PRMT5	MCF7	1 x 105
PRMT6	HEK293T	2 x 105
PRMT7	C2C12	1 x 105
PRMT8	HEK293T (PRMT1 KD)*	2 x 105
PRMT9	HEK293T	2 x 105
*traiter les cellules avec de la doxycycline (2 μg/mL) 3 jours avant le placage pour le test PRMT8

Tableau 1. Types de cellules et densités recommandés pour les essais PRMT.

PRMT	μg d’ADN/24-puits	Addgene #	Notes complémentaires
PRMT3	0.5 FLAG-PRMT3	164695
	ou 0,5 FLAG-PRMT3 (E338Q)	164696
PRMT6	0.5 FLAG-PRMT6	164697
	ou 0,5 FLAG-PRMT6 (V86K/D88A)	164698
PRMT8	0,05 EWS-GFP	164701
	0,45 PRMT8-FLAG	164699
	ou 0,45 PRMT8(E185Q)-FLAG	164700
PRMT9	0,05 SAP145-GFP	Na	don du Dr Yanzhong Yang, Institut de recherche Beckman de la Ville de l’espoir
	ou 0,05 SAP145-R508K-GFP
	0,45 vecteur vide

Tableau 2. La concentration d’ADN recommandée pour l’expérience de transfection.

PRMT	anticorps	Sonde chimique (activité cellulaire IC50)	Contrôle négatif
PRMT1	H4R3me2a (1:2000)	MS023 -PRMT type I	MS094
	Rme1 (1:1000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM, respectivement)
	Rme2s (1:2000)
	Rme2a (1:2000)
	Rme2a (ASYM24, 1:3000)
	Rme2a (ASYM25, 1:2000)
	H4 (1:2000)
	B-actine (1:500 )
PRMT3	H4 (1:2000)	CGT707 (CI50 = 91 nM)	XY-1
	H4R3me2a (1:2000)
	DRAPEAU (1:5000)
PRMT4	BAF155 (1:200)	TP-064 (CI50 = 43 nM)	TP064N
	BAF155-R1064me2a (1:3000)	SKI-73 (IC50 = 540 nM)*	SKI-73N*
PRMT5	anti-SmBB' (1:100)	LLY-283 (IC50 = 30 nM)	LLY-284
	Rme2s (#13222 1:2000)	GSK591 (IC50 = 56 nM)	CGT2096
PRMT6	H4R3me2a (1:2000)	CGT6870 (CI50 = 0,9 μM)	SGC6870N
	H4 (1:2000)	MS023 -PRMT type I	MS094
	H3R2me2a ( 1:2000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM, respectivement)
	H3R8me2a (1:2000)	MS049 (PRMT 4, 6 IC50 = 970, 1400 nM, respectivement)	MS049N
	H3 ( 1:5000)
	DRAPEAU ( 1:5000)
PRMT7	Rme1 (1:1000)	CGT3027 (CI50 = 1300 nM) *	CGT3027N*
	Hsp/Hsc70 (1:2000)*
PRMT8	GFP (1:3000)	MS023 (50 μM)	MS094
	Rme2a (ASYM25,1:2000)
	DRAPEAU (1:5000)
PRMT9	SAP145 (1:1000)
	SAP145-R508me2s -cadeau du Dr Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope (1:1000) (PIMID: 25737013)
Anticorps secondaires	chèvre-anti-lapin IgG-IR800 (1:5000)
	âne anti-souris IgG-IR680 (1:5000)
*- anticorps reconnaît HSPA8, HSPA1 et HSPA6 (testé avec des protéines surexprimées marquées GFP), * promédicament – la CI50 peut différer entre diverses lignées cellulaires

Tableau 3. Anticorps recommandés et sonde chimique PRMT /composés d’outils de contrôle négatifs.

PRMT

biomarqueur

Lecture de l’essai

Validation des essais

Lignée cellulaire recommandée

ref.

PRMT1

H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a

Niveaux de H4R3me2a normalisés aux niveaux totaux de H4 global Rme1, Rme2a ou Rme2s normalisés en B-actine.

Knockdown de PRMT1 a diminué les niveaux basaux de H4R3me2a et de Rme2a globaux et a augmenté les niveaux globaux de Rme1 et Rme2s dans les cellules (Fig.1A, B). La sonde chimique DE TYPE I MS023 de PRMT a réduit les niveaux de H4R3me2a d’une manière dépendante de la dose (fig. 1D).

Les cellules diffèrent par les niveaux basaux de H4R3me2a (Fig. 1C). Les cellules MCF7 ont des niveaux basaux élevés de H4R3me2a, ce qui le rend préférable pour les essais surveillant la diminution de l’activité PRMT1.

8

PRMT3

H4R3me2a

Niveaux de méthylation H4R3me2a causés par prmt3 WT exogène marqué par FLAG ou mutant E338Q catalytique (fond) normalisé à l’histone totale H4

La surexpression du type sauvage PRMT3 mais pas de son mutant catalytique (E338Q) a augmenté H4R3me2a (fig. 2A). L’inhibiteur sélectif PRMT3 SGC707 a diminué l’augmentation dépendante de PRMT3 des niveaux de H4R3me2a (Fig. 2B)

Les cellules HEK293T ont de faibles niveaux basaux de H4R3me2a (fig. 1C), ce qui est préférable pour surveiller l’activité PRMT3 exogène

7

PRMT4

BAF155-R1064me2a

Niveaux de BAF155-R1064me2a normalisés au total BAF155

Le knockdown PRMT4 a diminué la diméthylation asymétrique du FBA155 (Fig. 3A). Le traitement de 2 jours avec la sonde chimique sélective PRMT4 (TP-064) a diminué la diméthylation asymétrique de BAF155 (fig. 3B).

Toute lignée cellulaire

10

PRMT5

SmBB'-Rme2s

Niveaux de SMBB'-Rme2s détectés avec des anticorps pan Rme2s (CST) normalisés à la SMBB totale'

L’élimination du PRMT5 a entraîné une diminution des niveaux de diméthylation symétrique des SMBB (fig. 4A). Traitement de 2 jours avec des sondes chimiques sélectives PRMT5, GSK591 et LLY285, a diminué les niveaux de SmBB'-Rme2s (Fig. 4B).

Toute lignée cellulaire

11

PRMT6

H4R3me2a H3R2me2a H3R8me2a

Les niveaux de méthylation de H4R3me2a, H3R2me2a ou H3R8me2a sont augmentés par le PRMT6 WT exogène marqué par FLAG mais pas le mutant V86K, D88A catalytique (fond) normalisé à l’histone totale H4 ou H3, respectivement

La surexpression du type sauvage PRMT6 mais pas de son mutant catalytique (V86K, D88A) a augmenté les niveaux de H3R2me2a, H3R8me2a et H4R3me2a (Fig. 5A). L’inhibiteur allostérique de PRMT6 (SGC6870), l’inhibiteur de PRMT de type I MS023, l’inhibiteur de PRMT4/6 MS049 a diminué l’augmentation dépendante de PRMT6 des niveaux de H3R2me2a (fig. 5B).

Les cellules HEK293T ont de faibles niveaux basaux de H4R3me2a, H3R2me2a et H3R8me2a, ce qui est préférable pour surveiller l’activité PRMT6 exogène

8,9

PRMT7

HSP70-R469me1

Niveaux de méthylation HSP70-Rme1 normalisés au HSP70 total

Le knockout ou le knockdown PRMT7 a réduit la monométhylation HSP70 (Fig. 6A). Le traitement de 2 jours avec la sonde chimique sélective PRMT7 SGC3027 a diminué la monométhylation HSP70 dépendante de PRMT7 d’une manière dépendante de la dose (Fig. 6B).

C2C12, HT180 Plusieurs lignées cellulaires cancéreuses expriment une forme inductible de HSP70 dont le signal de méthylation chevauche une protéine non spécifique d’origine nucléaire (fig. 6C). Dans ce cas, nous recommandons d’analyser les niveaux de méthylation HSP70 dans la fraction cytoplasmique.

12

PRMT8

EWS-Rme2a

Niveaux exogènes de méthylation EWS marqués par GFP causés par le mutant catalytique PRMT8 WT ou E185Q exogène marqué par FLAG (fond), normalisés au signal GFP total dans les cellules KO PRMT1.

Surexpression du type sauvage PRMT8 mais non catalytique E185Q mutant méthylé ectopique EWS uniquement dans les cellules PRMT1 KD (Fig. 7A). La sonde chimique MS023 de type I de PRMT a inhibé la diméthylation asymétrique des SEW exogènes par PRMT8 (fig. 8B).

HEK293T PRMT1 KD (inductible). Prmt1 knockdown entraîne la mort cellulaire, nous vous recommandons donc d’utiliser un système inductible.

8

PRMT9

SAP145-R508me2s

Diméthylation symétrique SAP145 dépendante de PRMT9 à R508 normalisée à SAP145

La perte PRMT9 mais pas PRMT5 entraîne une diminution de la diméthylation symétrique de SAP145. Sap145 WT marqué GFP mais pas SAP145mut (R508K) a été méthylé par PRMT9 (Fig. 8A). Le traitement de 2 jours avec Copound X, le prototype d’inhibiteur prmt9, a diminué les niveaux de SAP145-R508me2s d’une manière dépendante de la dose Fig 8B).

Toute lignée cellulaire

21

Tableau 4. Résumé des essais PRMT.

Discussion

Ici, les protocoles d’analyse cellulaire détaillés pour les membres de la famille PRMT sont décrits qui utilisent des méthodes de buvard occidental fluorescent. Des substrats uniques pour lesquels les changements de la méthylation d’arginine peuvent être facilement détectés sur la perte individuelle de PRMT ou l’inhibition catalytique et ne peuvent pas être compensés par d’autres membres de la famille ont été choisis. Certaines protéines sont méthylées par plusieurs PRMT^21,23,ce qui suggère un chevauchement dans la spécificité du substrat où certains PRMT N’apportent qu’une petite quantité de marque cellulaire dans un substrat protéique donné^24,25,26,27,par exemple, PRMT8 et PRMT1 contribuent à la méthylation de l’EWS. Par conséquent, chaque essai nécessitait une validation approfondie des substrats et des anticorps avec des expériences de knockdown et/ou de surexpression et une validation supplémentaire avec des inhibiteurs sélectifs bien caractérisés. Des substrats spécifiques de PRMT ont été identifiés pour lesquels des changements de marque de méthylation pourraient être détectés dans les 2-3 jours de perte/inhibition de POST-PRMT pour éviter des effets de composition de viabilité et de prolifération cellulaire réduites qui peuvent indirectement affecter les niveaux de marque de méthyl-arginine. Bien qu’il ait été possible de trouver des substrats uniques pour PRMT1, 4, 5, 7 et 9; pour PRMT3, 6 et 8, l’approche du gain de fonction a dû être utilisée. Plusieurs anticorps méthyl-spécifiques d’arginine ont été examinés pour de diverses cibles cellulaires, mais aucun n’a pu détecter des changements significatifs dans les 3 jours de prmt3 et de knockdown PRMT6 ; par conséquent, des essais de biomarqueurs ont été développés utilisant des enzymes exprimées ectopiquement ainsi que des mutants catalytiquement inactifs, qui ont servi de contrôle pour la méthylation de substrat de ligne de base. PRMT8 est un homologue PRMT1 proche et partage des préférences de substrat similaires. Comme un biomarqueur sélectif PRMT8 n’a pas pu être identifié, un test dans les cellules knockdown PRMT1 a été développé, où PRMT8 a été co-exprimé avec EWS. PRMT1 est également une enzyme majeure responsable de la méthylation asymétrique H4R3, par conséquent, pour utiliser H4R3me2a comme biomarqueur pour les tests cellulaires PRMT3 et PRMT6, des cellules avec de faibles niveaux basaux de H4R3me2a ont été choisies ainsi que des mutants catalytiquement inactifs ont été utilisés comme contrôle de fond. Bien que les dosages endogènes soient préférés, les dosages exogènes s’avèrent inestimables pour tester la puissance cellulaire de plusieurs inhibiteurs sélectifs de prmt^7,8,9. Avec une connaissance croissante de la biologie de la PRMT, nous prévoyons d’améliorer les tests en trouvant des protéines de biomarqueurs plus spécifiques pour PRMT3, PRMT6 et PRMT8.

L’utilisation d’anticorps validés et de contrôles appropriés est essentielle pour la performance de l’essai PRMT. Tous les anticorps recommandés ici ont été soigneusement validés par des expériences de knockdown et de surexpression, cependant, les différences de lot à lot, en particulier dans le cas des anticorps polyclonaux, peuvent encore influencer leurs performances. Par conséquent, il est crucial d’utiliser des méthodes génétiques et des sondes chimiques ainsi que leurs contrôles négatifs étroitement liés pour confirmer la fiabilité de l’analyse. De plus, pour les tests PRMT qui nécessitent une surexpression des protéines, il est crucial d’utiliser des mutants catalytiquement inactifs ainsi que des protéines de type sauvage pour déterminer les niveaux de méthylation basale.

Cette collection d’essais quantitatifs pour le profilage de l’activité des PRMTs dans les cellules peut être largement utile pour la communauté scientifique car elle peut être rapidement et facilement mise en œuvre avec un équipement minimal et une expertise technique limitée, impliquant uniquement des techniques de culture cellulaire de base et de buvardage occidental fluorescent. Les anticorps et les sondes chimiques recommandés pour les PRMF peuvent également être utilisés pour les tests de profilage des protéines basés sur l’activité (ABPP) afin d’établir la pertinence d’une sonde ABPP donnée, de surveiller l’engagement de la cible et d’évaluer les effets hors cible en utilisant le format ABPP compétitif. Les approches de développement d’analyse discutées ici peuvent également être extrapolées pour d’autres familles d’enzymes telles que les protéines lysine-méthyltransférases et les acétyltransférases.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm TC dishes	Greiner bio-one	664160
24-well TC plates	Greiner bio-one	662160
4–12% Bis-Tris Protein Gels	ThermoFisher Scientiffic	NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX
Amersham Hybond P PVDF membrane	Millipore-Sigma	10600021
anti-Asym 24	Millipore-Sigma	07-414
anti-Asym 25	Millipore-Sigma	09-814
anti-B-actin	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47778
anti-BAF155	Santa Cruz Biotechnologies	sc-32763
anti-BAF155-R1064me2a	Millipore-Sigma	ABE1339
anti-FLAG (#, 1:5000)	Millipore-Sigma	F4799
anti-GFP	Clontech	632381
anti-H3	Abcam	ab10799
anti-H3R2me2a	Millipore-Sigma	04-848
anti-H3R8me2a	Rockland	600-401-I67
anti-H4	Abcam	ab174628
anti-H4R3me2a	Active Motif	39705
anti-Hsp/Hsc70	Enzo	ADI-SPA-820
anti-PRMT1	Millipore-Sigma	07-404
anti-PRMT3	Abcam	ab191562
anti-PRMT4	Bethyl	#A300-421A
anti-PRMT5	Abcam	ab109451
anti-PRMT6	Abcam	ab47244
anti-PRMT7	Abcam	ab179822
anti-Rme1	CST	8015
anti-Rme2a	CST	13522
anti-Rme2s	CST	13222
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)		09-814
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)	Abcam	ab56800
anti-SAP145-R508me2s			kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope
anti-SmBB’	Santa Cruz Biotechnologies	sc-130670
benzonase			PRODUCED IN-HOUSE
BSA	Millipore-Sigma	A7906
C2C12			gift from Dr. Stephane Richard, McGill University
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Millipore-Sigma	11873580001
DMEM	Wisent	319-005-CL
DMSO	Bioshop	DMS666.100
donkey anti-mouse IgG-IR680	Licor	926-68072
doxycycline	Millipore-Sigma	D9891
EDTA	Bioshop	EDT111.500
FBS	Wisent	80150
glycine	Bioshop	GLN002.5
goat-anti-rabbit IgG-IR800	Licor	926-32211
HEK293T			gift from Dr. Sam Benchimol, York University
Image Studio Software ver 5.2	Licor
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	ThermoFisher Scientiffic	NP0007
MCF7		ATCC® HTB-22™
NaCl	Bioshop	SOD001.1
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	ThermoFisher Scientiffic	NP0001
Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST)	Licor	927-40000	Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001
Odyssey CLX Imaging System	Licor	model number 9140
PBS (tissue culture)	Wisent	311-010-CL
PBS (western blot)	Bioshop	PBS405.4
penstrep	Wisent	450-201-EL
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientiffic	23225
SDS	Bioshop	SDS001.1
skim milk powder	Bioshop	SKI400.500
TC20 automated cell counter	Biorad	1450102
Tripsin-EDTA (0.25%)	Wisent	325-043-EL
Tris	Bioshop	TRS003.5
Tritton X-100	Bioshop	TRX506
trypan blue	GIBCO	15250-061
Tween-20	Bioshop	TWN510.500