1-Cyano-4-Dimetilamiopyridine Tetrafluoroborate (CDAP) kullanılarak Çözünür Polisakkaritlerin Aktivasyonu ve Konjugasyonu

Özet

Proteinler ve amin içeren ligandlar, ssiyansiyon reaktifi, 1-cyano-4-dimetilamiopyridine tetrafluoroborate (CDAP) tarafından aktive edilen polisakkaritlere, kurvalent protein (ligand)-polisakkarit konjugeleri oluşturmak için koaktif olarak bağlanabilir. Bu makalede, 0 °C'de kontrollü CDAP aktivasyonu ve değişen pH'da gerçekleştirme ve aktif polisakkaritlerin sonraki konjugasyonunu gerçekleştirmek için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır.

Özet

Konjuge aşılar aşılarda vaksinolojide dikkate değer gelişmeler vardır. Polisakkarit konjuge aşıların hazırlanması için, polisakkaritler rahatça işlevsel hale getirilebilir ve kullanımı kolay bir siyantüre reaktif olan 1-siyano-4-dimetilamopyridine tetrafluoroborate (CDAP) kullanılarak aşı taşıyıcı proteinlere bağlanabilir. CDAP, pH 7-9'da karbonhidrat hidroksil grupları ile reaksiyona geçerek polisakkaritleri aktive eder. CDAP'nin stabilitesi ve reaktivitesi yüksek oranda pH'a bağlıdır. Reaksiyonun pH'ı, CDAP'nin hidrolizi nedeniyle aktivasyon sırasında da azalır, bu da iyi pH kontrolünü tekrarlanabilir aktivasyonun anahtarı haline getirir. Orijinal CDAP aktivasyon protokolü, oda sıcaklığında unbuffered pH 9 çözeltilerinde gerçekleştirildi.

Bu durumdaki hızlı reaksiyon (<3 dk) ve hızlı CDAP hidrolizinden gelen hızlı pH düşüşü nedeniyle, hedef reaksiyon pH'ını kısa zaman diliminde hızlı bir şekilde ayarlamak ve korumak zordu. Burada açıklanan geliştirilmiş protokol, CDAP hidrolizini yavaşlatan ve aktivasyon süresini 3 dakikadan ~15 dakikaya uzatan 0 °C'de gerçekleştirilir. Dimetilamitropyridin (DMAP), CDAP reaktifini eklemeden önce polisakkarit çözeltisini hedef aktivasyon pH'ına önceden ayarlamak için tampon olarak da kullanılmıştır. Daha uzun reaksiyon süresi, daha yavaş CDAP hidrolizi ve DMAP tamponunun kullanımı ile birleştiğinde, aktivasyon pH'ının aktivasyon işleminin tüm süresi boyunca korunmasını kolaylaştırır. Geliştirilmiş protokol, etkinleştirme işlemini daha az çılgın, daha tekrarlanabilir ve ölçeklendirmeye daha uygun hale getirir.

Giriş

Bir taşıyıcı proteine aktif olarak bağlı polisakkaritlerden oluşanlar gibi konjuge aşılar, vaccinology^1,2'deki dikkat çekici gelişmeler arasındadır. Polisakkaritler, T hücreden bağımsız antijenler olarak, bebeklerde zayıf immünojeniktir ve antikorların hafızasını, sınıf değiştirmesini veya benzeşim olgunlaşmasını teşvik etmez³. Polisakkarit konjuge aşılarda bu eksiklikler aşılanır⁴. Çoğu polisakkarit konjugasyon için uygun bir kimyasal tutamağa sahip olmadığı için, önce reaktif veya "aktive" edilmelidir. Aktif polisakkarit daha sonra doğrudan protein (veya değiştirilmiş protein) ile bağlanır veya konjugasyondan önce ek türetme için işlevsel hale getirilir⁴. Çoğu lisanslı polisakkarit konjuge aşıları, polisakkarit hidroksilleri etkinleştirmek için indirgeyici aminasyon veya siyanilasyon kullanır. Daha önce kromatografi reçinelerini aktive etmek için kullanılan bir reaktif olan siyanojen bromür (CNBr), başlangıçta polisakkarit derivatizasyonu için kullanılmıştır. Bununla birlikte, CNBr, polisakkarit hidroksilleri cyano grubuna saldırmak için yeterince nükleofilik olacak şekilde kısmen deprotone etmek için genellikle ~ pH 10.5 veya daha büyük yüksek pH gerektirir. Yüksek pH baz-labile polisakkaritler için zararlı olabilir ve ne CNBr ne de başlangıçta oluşturulan aktif cyano-ester bu kadar yüksek pH'da yeterince kararlı değildir.

CDAP (1-cyano-4-dimetilamiopyridine tetrafluoroborate; Şekil 1) polisakkaritlerin aktivasyonu için siyansilat maddesi olarak kullanılmak üzere^Leesve ark. Kristal ve kullanımı kolay olan CDAP'nin, polisakkaritleri CNBr'den daha düşük bir pH'da ve daha az yan reaksiyonla aktive ettiği bulunmuştur. CNBr'nin aksine, CDAP ile aktive edilen polisakkaritler doğrudan proteinlere eşlenebilir ve sentez sürecini basitleştirebilir. CDAP ile aktive edilen polisakkaritler, amino veya hidrazit türetilmiş polisakkaritler yapmak için bir diamin (örneğin, heksan diamin) veya bir dihidrazit (örneğin, adipik dihidrazit, ADH) ile işlevsel hale getirilebilir. Polisakkaritlerin çapraz bağını bastırmak için yüksek konsantrasyonda homobiyfunctional reaktif kullanılır. Amino polisakkaritler daha sonra protein konjugasyonu için kullanılan sayısız tekniklerden herhangi biri kullanılarak konjuge edilebilir. Hidrazür türetilmiş polisakkaritler genellikle karbodiimid reaktifi (örneğin, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (EDAC))^{kullanılarak}proteinlerle birleştirilir. CDAP polisakkarit aktivasyonunun daha da optimizasyonu Lees ve ark.⁸ tarafından tanımlanmıştır ve burada açıklanan protokole dahil edilmiştir.

CDAP konjugasyonuna genel bakış
CDAP protokolü iki aşama olarak kavramsallaştırılabilir: (1) polisakkaritin aktivasyonu ve (2) aktif polisakkaritin bir protein veya ligand ile konjugasyonu (Şekil 2). İlk adımın amacı polisakkaritleri verimli bir şekilde etkinleştirmek, ikinci adımın amacı ise aktif polisakkaride verimli bir şekilde konjuge etmektir. Aktif polisakkarit iki adımı birbirine bağlar. Bu kavramsallaştırma, her adımın kritik öğelerine odaklanmaya yardımcı olur. Şekil 2, hidroliz reaksiyonları ve yan reaksiyonlarla birlikte istenen aktivasyon ve kavramsal reaksiyonları göstererek bu kavramsallaştırmayı genişletir.

Aktivasyon aşamasında, üç ana endişe CDAP stabilitesi, polisakkarit hidroksillerle CDAP reaksiyoni ve aktif polisakkarit stabilitesidir (Şekil 3). CDAP hidrolizi, aktif polisakkarit ve yan reaksiyonların hidrolizi gibi pH ile artar. Bununla birlikte, polisakkarit ile CDAP reaksiyonı pH artırılır. Cdap ile polisakkaritlerin verimli bir şekilde etkinleştirilmesi, 1) polisakkarit ve CDAP'nin reaktivitesi ve 2) hem reaktifin hem de aktif polisakkaritin hidrolizi ve yan reaksiyonları arasında bir denge gerektirir.

Lees ve ark.⁵tarafından açıklanan orijinal CDAP aktivasyon protokolünde, polisakkaritlerin CDAP aktivasyonu oda sıcaklığında unbuffered pH 9 çözeltisinde gerçekleştirildi. Etkinleştirme oranının bu durum altında hızlı olduğu ve etkinleştirmenin 3 dakika içinde tamamlanmış olacağı bulunmuştur. Reaksiyona cdap'in hızlı hidrolizi de eşlik etti ve bu da etkilenmemiş reaksiyon çözeltisinin hızlı bir pH düşmesine neden oldu. Bu kadar kısa bir zaman diliminde reaksiyon pH'ını hedef değerde hızlı bir şekilde yükseltmek ve korumak zordu. Açıklanan protokolde, 100 mg/mL stok çözeltisinden unbuffered polisakkarit çözeltisine CDAP eklenerek aktivasyon gerçekleştirildi. pH daha sonra "0.2 M trietilamin eşit hacim" ile 30 s yükseltildi. Konjuge edilecek protein daha sonra aktivasyon reaksiyona 2,5 dk sonra eklendi. Özellikle, aktivasyon adımının pH'ı iyi kontrol edildi ve büyük olasılıkla başlangıçta hedef pH'ı aştı. Hızlı pH ayarı gerektiren hızlı reaksiyon, etkinleştirme işlemini kontrol etmeyi zorlaştırdı ve ölçeklendirmeyi zorlaştırdı.

Özgün protokolün aksine, burada açıklanan değiştirilmiş protokolün iki büyük geliştirmesi vardır. İlk olarak, polisakkarit çözeltisinin pH'ı, CDAP eklenmeden önce arabellek olarak DMAP kullanılarak hedef aktivasyon pH'ına önceden ayarlanır. DMAP 9.5 pKa'ya sahiptir ve bu nedenle pH 9 etrafında iyi tamponlama gücüne sahiptir ve diğer birçok tamponun aksine, DMAP'ın CDAP hidrolizi^8'iteşvik ettiği tespit edildi. Ayrıca, DMAP zaten bir proses aradır ve bu nedenle reaksiyon karışımına yeni bir bileşen eklemez. CDAP eklemeden önce pH'ı önceden ayarlamak, reaksiyonun başındaki büyük pH salınımını ortadan kaldırır ve reaksiyon sırasında hedef pH'ın daha verimli bir şekilde korunmasını sağlar. İkinci gelişme, CDAP hidroliz oranının oda sıcaklığındakinden belirgin şekilde daha yavaş olduğu 0 °C'de aktivasyon reaksiyonunu gerçekleştirmektir. 0 °C'de daha uzun reaktif yarı ömrü ile, daha düşük sıcaklıkta daha yavaş aktivasyon oranını telafi etmek için aktivasyon süresi 3 dakikadan 15 dakikaya çıkarılır. Daha uzun reaksiyon süresi, tepki pH'ını korumayı kolaylaştırır. 0 °C kullanımı ayrıca pH'a duyarlı polisakkaritlerin bozulmasını yavaşlatır ve bu da bu tür polisakkarit konjugelerinin hazırlanmasını mümkün hale getirir. Protokoldeki iyileştirmeler, etkinleştirme işlemini daha az çılgın, kontrol etmesi daha kolay, daha tekrarlanabilir ve ölçeklendirmeye daha uygun hale getirir.

Bu makalede, polisakkaritin 0 °C'de ve belirli bir hedef pH'da kontrollü CDAP aktivasyonunun gerçekleştirilmesi ve ADH ile etkinleştirilen polisakkaritlerin daha sonra türetilmesi için geliştirilmiş protokol açıklanmaktadır. Ayrıca, modifiye polisakkarit üzerinde hidrazit seviyesinin belirlenmesi için Qi ve ark.⁹yöntemine dayanan bir trinitrobenzen sülfik asit (TNBS) tahlildir. Resorcinol ve sülfürik asit^10'a dayanan hexozlar için değiştirilmiş bir tahlil de açıklanmıştır, bu da daha geniş bir polisakkarit aralığını belirlemek için kullanılabilir. CDAP aktivasyonu ve konjugasyonu hakkında daha fazla bilgi için okuyucu, Lees ve arkadaşları tarafından önceki^{yayınlar 5,6,8'e} atıfta bulunulmaktadır.

Protokol

NOT: Polisakkarit aktivasyon ve fonksiyonelleştirme prosedürlerini gerçekleştirmeden önce polisakkarit çözeltisini, ADH çözeltisini, DMAP solüsyonunu ve CDAP stok çözeltisini önceden hazırlayın. Çözümleri ve ekipmanları organize, kullanışlı ve mantıklı bir konuma yerleştirin. Açıklanan reaksiyon 10 mg polisakkarit içindir ve yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Ölçeklendirmeden önce protokolün küçük bir ölçekte değerlendirilmesi önerilir.

1. 5 mg/mL polisakkarit çözeltisi, 2 mL hazırlayın.

1. Liyofilize polisakkarit için
   1. Açmadan önce polisakkarit kabının oda sıcaklığına gelmesini izin verin. Analitik bir terazi kullanarak vidalı kapak tüpünün içinde 10 mg polisakkarit tartın. Tozun daha kolay örneklenmesi ve daha doğru tartımı için statik bir ortadan kaldırıcı kullanın.
   2. Polisakkarit çözmek için tüpe 2 mL 0,15 M sodyum klorür (NaCl) ekleyin. Kapağı ve girdabı tüp.
      NOT: Sodyum klorür CDAP reaksiyonu etkilemez, ancak polisakkarit ikincil yapısını etkileyebilir. Bazı polisakkaritler farklı tuz konsantrasyonlarında daha çözünür.
   3. Polisakkarit moleküler ağırlığına bağlı olarak 12-24 saat boyunca uç-uç dönüşü ile tüpü karıştırın, böylece polisakkarit tam olarak nemlendirilemez. Gerekirse, çözünürlüğü teşvik etmek için tüpü hafifçe ısıtın.
2. Tamponlu çözeltide çözünür polisakkarit için
   NOT: Verimli CDAP aktivasyonu için, polisakkarit çözeltisi, özellikle fosfat iyonu olmak üzere herhangi bir tampon içermemelidir. Tamponu su veya tuzlu su çözeltisi ile değiştirmek ve polisakkarit konsantrasyonu 5 mg / mL'ye ayarlamak için aşağıdaki prosedürü izleyin.
   1. Uygun moleküler ağırlık kesme (MWCO) 4 mL veya 15 mL santrifüj dönüş filtre cihazı edinin.
      NOT: MWCO, polisakkaritin moleküler ağırlığından ideal olarak 5-10 kat daha küçüktür.
   2. Filtre kesici ucuna ~20 mg polisakkarit içeren tamponlanmış polisakkarit çözeltisinin bir hacmini ekleyin. Su veya tuzlu su çözeltisi ile tam işarete doldurun. Filtreyi sıkıca kapla. Birkaç kez uç-uç ile karıştırın.
   3. Filtre cihazını üretici tarafından önerilen santrifüj kuvvetine santrifüjleyin. Santrifüjleme süresinin her dönüşte en az 5 kat hacim azaltma elde edecek kadar uzun olduğundan emin olun. Akışa geç. Filtre cihazını yeniden bir araya edin.
   4. Filtre kesici ucu tam işarete tatlı su veya tuzlu su çözeltisi ile yeniden doldurun. Filtreyi sıkıca kapla. Filtredeki içeriği uç-uç dönüşü ~10 kez veya nazik girdap ile karıştırın; dönüşü tekrarlayın.
      NOT: Polisakkarit, santrifüj cihazının filtre kesici ucunun altında birikerek bir jel oluşturabilir. Filtre kesici ucunun içindeki retentant'ın bir sonraki dönüşten önce taze dolumla yeniden karıştırılması önerilir.
   5. Dolum ve spin döngüsünü en az 3 kez tekrarlayın.
   6. Polisakkarit retentantını filtre kesici uçtan kurtarmak için aşağıdaki egzersizi izleyin.
      1. Filtre ucuna tatlı su veya tuzlu su ekleyin, böylece hacim ~1 mL olacaktır. Yukarı ve aşağı pipetleme veya nazik girdap ile karıştırın.
      2. Tüm karışık retentantları 5 mL'lik bir tüpe aktarın. Filtre ucuna 1 mL tatlı su veya tuzlu su ekleyin. Filtreyi yukarı ve aşağı pipetleme veya nazik girdaplama ile durulayın. Tüm durulamaları geri kazanılan polisakkarit ile aktarın ve birleştirin.
   7. Polisakkarit konsantrasyonu belirleyin (bkz. bölüm 7.3'teki polisakkarit test). Polisakkarit ek su veya tuzlu su ile 5 mg / mL seyreltin.
3. Polisakkarit çözeltisi hazırlandığında, polisakkarit çözeltisini içeren tüpü bir buz kovasında soğutun.

2. 0,5 M adipik asit dihidrazit (ADH) çözeltisi, 10 mL hazırlayın.

1. Analitik bir dengede 0,87 g ADH ağırlığında ve 8 mL'de 0,1 M HEPES (4-(2-hidroksetil)-1-piperazineethanesulfonic asit), pH 8'de çözün.
2. Bir pH metre ile izlenen 1 M sodyum hidroksit (NaOH) ile hedef pH'a ayarlayın. Ek tampon ile 10 mL'ye getirin ve pH'ı yeniden onaylayın.

3. 2,5 M DMAP çözeltisi, 10 mL hazırlayın.

NOT: DMAP toksiktir ve cilde nüfuz edecektir. İşlemi yaparken nitril eldiven giyin.

1. 50 mL konik bir tüpe 3 g DMAP dikkatlice tartın. DMAP'ye 5 ml su ekleyin ve bulutlu bir çözelti (~ 7 mL) elde etmek için 5 dakika boyunca girdap yaparak karıştırın.
2. Karıştırırken, DMAP çözeltisine 10 N hidroklorik asit (HCl) 50 μL artış ekleyin. Her ekleme arasında karıştırın. Çözüm netleştiğinde eklemeyi durdurun.
3. DMAP çözümünü ~pH 8'e getirmek için 25 μL artışlarla 10 N NaOH ekleyin.
4. 2,5 M'lik bir çözelti vermek için DMAP çözeltisini su ile 10 mL'ye getirin.
5. 2,5 M DMAP çözümünün pH'ını hassas bir şekilde ayarlayın.
   NOT: DMAP çözelti pH konsantrasyon ve iyonik mukavemet ile değişir. Bu alıştırma, 2,5 M DMAP stoğuna belirli bir pH'a ince ayar yapmaktır, böylece 10 hacim polisakkarit ile karıştırıldığında, elde elde eden çözelti aktivasyon için hedef pH'a yakındır.
   1. Polisakkarit çözeltisini hazırlamak için hangisi kullanıldısa, 1 mL su veya NaCl çözeltisi içeren bir dizi 1,5 mL tüp hazırlayın. Tüpleri buzda soğutun.
   2. Soğutulmuş bir tüpe 100 μL DMAP ekleyin. Girdap ve bir pH metre ile pH ölçmek. Ardından, ölçülen tüpü atın.
   3. Ölçülen pH hedef değere yakın değilse, DMAP stoğunun pH'ını uygun şekilde 1 M NaOH veya HCl ile ayarlayın. Ölçülen pH hedef pH'a yakın olana kadar 3.5.2 ve 3.5.3 adımlarını yineleyin.

4. 100 mg/mL CDAP stok çözeltisi hazırlayın

NOT: CDAP tozu sıkıca kapalı tutulmalı ve -20 °C'de saklanmalı ve açılmadan önce oda sıcaklığına gelmesine izin verilmelidir. İşlemi yaparken nitril eldiven giyin.

1. Analitik bir dengede 1,5 mL snap-cap mikrosantrifüj tüpünü dara. Küçük bir spatula kullanarak, tüpe 10-140 mg CDAP ağırlığındadır. CDAP'nin gerçek ağırlığına dikkat edin.
2. 100 mg/mL CDAP hazırlamak için gereken asetonitril hacmini belirleyin. Duman kapüşonlu asetonitrile açın.
3. Uygun hacimli bir pipet kullanarak, boru ucundaki buharını aşındırmak için asetonitrili çizin ve serbest bırakın. Çözücünün birkaç saniye sonra pipet ucundan damlamasını bekleyin ve doğrudan CDAP tüpüne aktarmaya hazır olun. Hesaplanan asetonitril hacmini çizin ve doğrudan CDAP tüpüne aktarın. Kapağı kapat.
   NOT: Asetonitril, Bir Hamilton şırıngı veya uygun boyut eşdeğeri kullanılarak CDAP tüpüne de aktarılabilir.
4. CDAP'yi tamamen yatıştırmak için girdap. CDAP tüpünü bir buz kovasına yerleştirin.
   NOT: CDAP soğukta asetonitrilde stabildir. Çözünür stoklar >1 hafta boyunca -20 °C'de tutulabilir. Ancak, taze CDAP çözümleri hazırlamak tercih edilir.

5. Polisakkarit aktivasyonu ve hidrazit fonksiyonelleştirme

1. Aktivasyona başlamadan önce aşağıdaki öğelerin tümünün hazır olduğundan ve çözeltilerin buz üzerinde soğutulduğundan emin olun: manyetik bir karıştırıcının üzerine yerleştirilmiş, bir karıştırma çubuğu içeren düz tabanlı, geniş ağızlı bir kapta 5 mg / mL polisakkarit çözeltisinin 2 mL'si; 100 mg/mL CDAP stok çözümü; 2.5 M DMAP stok çözümü; üreticinin talimatlarına göre 0 °C için kalibre edilmiş 6 mm çapında prob gibi yarı mikro pH probuna sahip bir pH ölçer; kullanıma hazır 100 μL pipet; zamanlayıcı temizlendi ve kullanıma hazır; bir ototitrator dağıtıcı kafası yerleştirilmiş veya kullanıma hazır 10 μL pipet; 0,5 M ADH çözümü.
2. DMAP kullanarak polisakkaritin pH'ını hedef pH'a önceden ayarlayın.
   1. pH probunu polisakkarit çözeltisine yerleştirin ve tüm aktivasyon prosedürü sırasında çözeltide bırakın.
   2. DMAP stok çözeltisinin 200 μL'lik kısmını karıştırma altında damla damla ilave ile polisakkarit çözeltisine aktarın. Çözümün pH'ını hedef aktivasyon pH'ına ayarlayın. pH'ı düşürmek için 0,1 M HCl ve pH'ı artırmak için 0,1 M NaOH ekleyin. Hedef pH'ı 0,1 pH'dan fazla aşmaktan kaçının ve aktivasyon süresince reaksiyonu buzlu su banyosunda soğutun.
3. CDAP etkinleştirmesi
   1. Pipet ucundaki buharı aşındırmak için pipet 100 μL CDAP yukarı ve aşağı. 100 μL CDAP'yi karıştırma ile polisakkarit çözeltisine aktarın.
      NOT: Bu aktivasyon başlangıç oranı olarak 1 mg polisakkarit için 1 mg CDAP kullanır. Etkinleştirme en iyi duruma getirilirken oran artırılabilir veya azaltılabilir.
   2. Zamanlayıcıyı başlatın ve tüm etkinleştirme sırasında pH değişimini izleyin. Bir ototitratör dağıtıcısı (veya pipet) yardımıyla reaksiyona derhal 0,1 M NaOH 10 μL artış ekleyerek hedef pH'daki reaksiyonu koruyun.
      NOT: Bir pH probu ile hafifçe karıştırmak için pH tepki süresini azaltmaya yardımcı olabilir. pH başlangıçta daha hızlı düşer ve 0.1 M NaOH'yi daha sık eklemek gerekebilir. Reaksiyon ilerledikçe, pH düşüşü yavaşlar ve ekleme daha az sıklaşır. pH 9 aktivasyonu için 10-15 dakika olan en uygun aktivasyon süresine yaklaşırken pH esasen değişmeden kalmalıdır.
4. ADH işlevselleştirme
   1. En uygun aktivasyon süresine ulaşıldığında, karıştırma altında aktif polisakkaride aynı anda 0,5 M ADH'nin 2 mL'lik kısmını ekleyin. pH'ın hedef aralıkta olup olmadığını kontrol edin (ADH için pH 8-9).
      NOT: Hızlı karıştırmalı bir ekleme, dihidrazitin her iki ucunun da aktif polisakkarit ile reaksiyona girme olasılığını en aza indirir ve polisakkarit çapraz bağlantısını önler.
   2. Reaksiyon karışımını en az 1 saat karıştırmaya devam edin. Reaksiyon karışımını 4 °C'ye aktarın, ancak 0-20 °C kabul edilebilir.
      NOT: ADH fonksiyonelleştirme reaksiyonu sıcaklığa güçlü bir şekilde bağlı değildir. Dihidrazit'in büyük fazlalığı söndürme reaktifi olarak işlev görür, aktif polisakkaritin daha fazla söndürülmesi gerekmez. Bununla birlikte, proteinleri doğrudan konjugat ederken, reaksiyon tipik olarak 1 M glisinin, pH 8-9 ile söndürülmelidir.

6. ADH fonksiyonelleştirilmiş polisakkaritin diyaliz ile saflaştırılması

NOT: ADH fonksiyonelleştirme reaksiyonundan elde edilen ham ürün, kapsamlı diyaliz ile en verimli şekilde çıkarılabilen yüksek konsantrasyonda BIR ADH (0,5 M) içerir. Jel filtrasyonu, bir sütun veya spin tuzdan arındırma cihazı ile, özellikle artık ADH kirleticisini çıkarmak gerektiğinde o kadar verimli değildir.

1. Diyaliz zarının MWCO'sını belirleyin. Daha küçük polisakkaritler için 3 kDa kesme kullanın.
   NOT: Diyaliz zarının MWCO'su, polisakkarit MW'sinden ideal olarak 5-10 kat daha küçüktür.
2. İstediğiniz diyaliz formatını (kasetler veya borular) ve doğru cihaz kapasitesini seçin. Cihaz kapasitesinin örnek ses biriminden 2 kat daha büyük olduğundan emin olun. Cihazı kullanmak için üreticilerin talimatlarına bakın.
3. Kullanmadan önce diyaliz zarını suya nemlendirin. Ham türetilmiş polisakkarit çözeltisini üreticilerin talimatlarına göre diyaliz cihazına aktarın.
   NOT: DMAP ile teması önlemek için nitril eldiven giyin.
4. Dialyze, 2-4 L 1 M NaCl ve bir karıştırma çubuğu ile dolu bir kapta. Kabı soğuk bir odada veya buzdolabının içine bir karıştırma tabağına yerleştirin. Diyaliz sırasında kadranı hafifçe ve sürekli karıştırın.
5. En az 4 saat diyalze ettikten sonra, taze 1 M NaCl'ye değiştirin ve en az 12 saat boyunca dialyze edin. Her biri en az 12 saat boyunca 0,15 M salin 2 değişikliğe karşı dialyze. İstenirse, 2 su değişikliğine karşı dialyze edin.
6. Hızlı bir TNBS testi kullanarak gecelik kadranı test ederek tüm ADH'nin kaldırılıp kaldırıldığını doğrulayın.
   1. Sırasıyla 3 borosilikat tüp alın, negatif kontrol (ctrl), pozitif ctrl ve örnek olarak etiketlenin.
   2. Negatif ctrl tüpüne 0,1 M borat, pH 9'un 975 μL'sini ekleyin.
   3. Pozitif ctrl tüpüne 100 μL 0,05 mM ADH (0,1 mM hidrazit) ve 875 μL 0,1 M borat, pH 9 ekleyin.
   4. Numune tüpüne, gecelik kadranda 500 μL ve 0,1 M borat 475 μL, pH 9 ekleyin.
   5. Her üç tüpe de 25 μL% 1 TNBS ekleyin. İyice karıştırın. 1 saat boyunca karanlıkta yerleştirin.
   6. 3 tüpün renk yoğunluğunu 1 saat içinde karşılaştırın. Örnek tüp renk yoğunluğunun, ADH kirleticisinin 0,01 mM veya altına düştüğünü gösteren pozitif ctrl ile negatif ctrl arasında olduğundan emin olun. Dialyze bir kez daha.
      NOT: ADH hidrazürün saflaştırılmış hidrazür-polisakkaritteki toplam hidrazürün% 1'inden daha azını oluşturabilmesi için ADH kirletici seviyesini mümkün olduğunca azaltmak ihtiyatlıdır.
   7. Türetilmiş polisakkaritleri diyalizden kurtarın. Polisakkaritlerin ve hidrazitlerin konsantrasyonunu belirleyin. Hidrazür/polisakkarit oranını hesaplayın (bkz. bölüm 7). Diyalze polisakkarit 5-10 mg/mL'ye konsantre edilmesi gerekiyorsa, bölüm 1.2'ye bakın.

7. Hidrazit türevi polisakkaritlerin analizi

NOT: Burada açıklanan analizin amacı, hidraskarit konsantrasyonunu, hidrazit konsantrasyonunu ve hidrazit/polisakkarit oranı açısından hidrazit derivazizasyon seviyesini belirlemektir.

1. Numune hazırlama
   NOT: Test edilecek polisakkaritlerin düşük moleküler ağırlıklı karbonhidrat, amin veya hidrazür safsızlıklarından arındırılması gerekir. Doğru ağırlık ölçümü sağlamak için liyofilize numuneler kuru ve tuzsuz olmalıdır. Genellikle, 1-2 mg/mL'lik bir çözeltinin ~1 mL'si tahliller için yeterlidir.
   1. Statik olmayan bir spatula veya statik bir ortadan kaldırıcı kullanarak analitik bir dengede en az 10 mg liyofilize polisakkarit örneği tartın. Polisakkaritleri su veya salin içinde bir konsantrasyonda (örneğin, 2 mg/mL) çözün, böylece test sinyalleri standart eğrinin doğrusal aralığına girer.
   2. Uç-uç karıştırın ve numunenin tamamen çözünmesi için yeterli zaman bırakın. Polisakkarit moleküler ağırlığına bağlı olarak gece hidrasyon gerçekleştirin.
2. Polisakkarit tahlil: resorcinol/sülfürik asit yöntemi
   NOT: Polisakkaritler için uygun test, polimerlerin karbonhidrat bileşimine bağlı olacaktır. Orijinal resorsinol/sülfürik asit tahlili heksoz şekerleri için tasarlanmıştır.¹⁰. Test burada ısıtma adımının sıcaklığını 90 °C'den 140 °C'ye yükselterek değiştirildi. Bu yüksek sıcaklıkta, test bazı özgüllük kaybeder, ancak birçok şekeri test etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, tahlilin belirli bir polisakkarit için uygunluğunu belirlemek hala gereklidir. Her nokta için triplicates tavsiye edilir, ancak ısıtma bloğunun kapasitesi nedeniyle bazı konaklamalar gerekebilir.
   1. %75 sülfürik asit hazırlayın
      NOT: Konsantre sülfürik asit son derece aşındırıcıdır ve ciddi yanıklara neden olabilir. Bu işlemi kimyasal duman kaputunda gerçekleştirin. Konsantre asidi her zaman suya dökün, tam tersideğil!
      1. 200 mL'lik bir cam şişeye 50 mL su ekleyin. Şişeyi soğuk bir su banyosuna yerleştirin. Yavaşça 150 mL sülfürik asit ekleyin. Şişeyi havalandırılana kadar kaplayın.
      2. Çözeltinin oda sıcaklığına eşdeğer olmasını izin verin. Çözeltiyi 3 ay içinde kullanın.
   2. Karbonhidrat standartlarını hazırlayın
      1. Değiştirilmemiş polisakkarit çözeltisini standart olarak kullanılmak üzere 1 mg/mL'de hazırlayın. Alternatif olarak, standart olarak, toplam şeker konsantrasyonunun 1 mg / mL'sinde, polisakkaritin tekrar ünitesinde bulunan oranda tek tek şekerlerin bir karışımını kullanın.
         NOT: Şeker karışımı genellikle aynı şeker bileşiminin karbonhidrat polimeri ile aynı sonucu verecek olsa da, bu deneysel olarak doğrulanmalıdır.
   3. 13 x 100 borosilikat test tüpleri için tüp tutuculu ısıtma bloğunun çalıştığından emin olun. Asit dökülmesi durumunda ısıtma bloğunun altında ve çevresinde koruyucu bir ped kullanın. Kullanılan tüm bloklar aracılığıyla istikrarlı, düzgün sıcaklık elde etmek için ısıtma bloğunu en az 1 saat boyunca 140 °C'ye önceden ısıtın.
   4. Etiket 13 x 100 borosilikat test tüpleri, her standart ve her örnek için üç taraflı. İlgili etiketli standart tüplere 1 mg/mL karbonhidrat standardının 0, 2,5, 5, 7,5, 10 μg (veya μL) ekleyin. Hacmi 100 μL'ye getirmek için her tüpe su ekleyin.
      NOT: Üretilen renk belirli şekerlere bağlıdır. Bazı şekerler tam absorbans aralığını oluşturmak için daha fazla kütle gerektirdiğinden, standart eğri için kullanılan gerçek miktarlar değişebilir.
   5. Üç numune tüpüne ~5 μg türetilmiş polisakkarit içeren bir hacim ekleyerek numune tahlilleri ayarlayın ve toplam hacmi su ile 100 μL'ye getirin. Alternatif olarak, numunedeki polisakkarit konsantrasyonu bilinmiyorsa, bir dizi 4 kat seyreltme gerçekleştirin. Üç taraflı her seyreltmenin 100 μL'sini test edin.
   6. Kullanmadan hemen önce deiyonize (dI) suda 6 mg/mL'de taze resorcinol hazırlayın. Resorcinol çözüme gelene kadar girdap. Her tüpe 100 μL 6 mg/mL resorcinol ekleyin.
   7. Tahmini% 75 sülfürik asit miktarını dikkatlice küçük bir kabın içine dökün.
      NOT: Laboratuvar önlüğü, nitril eldiven ve güvenlik gözlüğü takın. Damlamalara, dökülmelere ve sıçramalara dikkat edin. Damlaları silmek için ıslak kağıt havluları elinizin altında tutun. Sülfürik asidin aktivitesi havaya uzun süre maruz kalmada değiştiğinden, tüm test için tekdüze bir sülfürik asit karışımı kullanın.
   8. Tekrar pipettör kullanarak, her tüpe 300 μL% 75 sülfürik asit ekleyin. Vortexs iyi karıştırmak için tüpleri kuvvetlice, girdap sırasında tüpü uzağa yönlendirin. Tüpleri sıralı olarak sabit bir hızda bir ısıtıcı bloğuna yerleştirin. Tüm tüpler girdikten sonra, zamanlayıcıyı hemen 3 dakika ayarlayın.
   9. 3 dakikada, tüpleri aynı sırayla sabit bir hızda çıkarın ve doğrudan buzlu su banyosundaki bir rafa yerleştirin. Tüpleri buz gibi olana kadar bırakın. Tüpleri çıkarın ve okuma sırasında cuvette yoğunlaşmayı önlemek için ~ 5 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmelerine izin verin.
   10. 10 mm'lik bir patlength cuvette kullanarak absorbansı 430 nm'de okumak için bir UV/VIS spektrofotometre ayarlayın. Sıfır standart tüple boş. 430 nm'deki tüm tüplerin emiciliğini okuyun.
       NOT: Tek kullanımlık plastik cuvettes kullanımı uygundur.
   11. A_430'akarşı μg karbonhidrat standardı çizerek standart bir eğri oluşturun. Referans standart olarak glikoz kullanan tipik bir standart eğri için Şekil 4'e bakın.
   12. Standart eğrinin doğrusal aralığına düşen_{A 430} değerlerine sahip örnek test tüplerini kullanın, standart eğri denkleminden örnek tahlil tüplerindeki bilinmeyen polisakkarit miktarını hesaplayın. Bilinmeyen polisakkarit konsantrasyonu bilinmeyen eklenen hacminden, seyreltmeler için muhasebe belirlemek. Konsantrasyonu gerektiği gibi mg/mL veya μM tekrar ünitelerine dönüştürün.
3. Trinitrobenzen sülfik asit (TNBS) kullanılarak hidrazid tahlil
   1. DI H 2 O'da 9 g NaCl ve 200 mg sodyum azid çözünerek%0,02 sodyum azit (Örnek tampon) içeren_%0,9NaCl'yi 1 L'lik son hacme hazırlayın.
   2. 0,1 M sodyum borat, pH 9 (Test tamponu), 100 mL 0,5 M sodyum borat, pH 9, 400 mL dI H₂O karıştırarak hazırlayı ±n. gerekirse ayarlayın.
   3. 200 μL%2,4,6-trinitrobenzen sülfikonik asit çözeltisini dI H 2 O ile 1 mL'ye seyrelterek %₁TNBS hazırlayın.
   4. 50 mM ADH stoğu hazırlayın (100 mM hidrazide eşdeğer).
      1. Analitik bir denge kullanarak 871 mg adipik dihidrazür (ADH) tozu tartın. Üst yükleyici dengesi yardımıyla 100 mL'ye Numune tamponu ekleyerek tozu bir reaktif şişesinde çözün.
      2. Şişeyi 100 mM hidrazit/50 mM ADH olarak etiketleyin. Şişeyi sıkıca kaplayın ve 1 yıl boyunca 4 °C'de saklayın.
   5. Hidrazit standartlarını hazırlayın (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 ve 0.6 mM hidrazit).
      1. 100 mM hidrazit stoğunu numune tamponu ile üst yükleyici dengesi yardımıyla seyrelterek 6 hidrazit standardını hazırlayın. Konsantrasyon hatasını en aza indirmek için her standardın 100 mL'sini hazırlayın. Şişeleri sıkıca kapatın ve 1 yıl boyunca 4 °C'de saklayın.
   6. Tahlil reaksiyonları ayarlama
      NOT: TNBS tahlili 1 mL reaksiyon hacminde çalıştırılır. Her test tüpü 100 μL numune (veya standart), 875 μL Tahlil tamponu ve 25 μL% 1 TNBS çözeltiden oluşur. Tüm tahlil reaksiyonları (hem numuneler hem de standartlar için) üç taraflı olarak ayarlanır.
      1. Etiket 3 borosilikat cam tüpler (12 x 75 mm) sıfır standart dahil her standart için. Standart tüpleri artan konsantrasyon sırasına göre tüp rafında sıralayın ve düzenleyin. İlgili her tüpe standartlardan 100 μL'yi doğru bir şekilde eklemek için kalibre edilmiş 100 μL veya 200 μL mikropipette kullanın. Sıfır standart için 100 μL Numune tamponu kullanın.
      2. Etiket 3 borosilikat cam tüpler (12 x 75 mm) her seyreltilmiş numune için test edilecek. Tüp rafındaki numune tüplerini sıralayın ve buna göre düzenleyin. İlgili her numune tüpüne numunenin 100 μL'lik kısmını doğru bir şekilde eklemek için kalibre edilmiş 100 μL veya 200 μL mikropipette kullanın.
      3. Tüm test tüplerine doğru bir şekilde 875 μL Test tamponu eklemek için kalibre edilmiş 1000 μL mikropipette kullanın: standartlar ve numuneler.
   7. Test reaksiyonuna başlamak için, her test tüpüne% 1 TNBS'nin 25 μL'sini doğru bir şekilde eklemek için kalibre edilmiş 100 μL mikropipette kullanın. Sıfır standart tüplerden başlayın, artan konsantrasyon sırasına göre standart tüplere, daha sonra önceden belirlenen sıraya göre numune tüplerine geçin. Yeni bir standart veya yeni bir örnek başlatırken ipuçlarını değiştirin ve tüm tüplere TNBS eklemek için harcanan zamanı 5 dakika içinde tutun.
      1. Vortex tüm test tüpleri için 2 s yüksek hızda veya bir hız ayarında test tüpünün içindeki sıvının yukarı doğru dönerek tüp açıklığından 1/2 inç yüksekliğe ulaşmasını sağlar.
      2. Test başlangıç saatini kaydedin ve zamanlayıcıyı 2 saat olarak ayarlayın. Test tüpü rafını 2 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta yerleştirin. Zaman bittiğinde, tüm tüpleri bir kez daha girdapla ve veri toplamaya devam edin.
   8. Veri toplama
      1. UV/VIS spektrofotometrenin ısınmasını ve taban çizgisinin sabitlenmesine izin verin. Hidrazid tahlili için algılama dalga boyunu 500 nm olarak ayarlayın. Tüm test için tüm absorbans ölçümleri için 1 cm pathlength'lik 1 mL kuvars cuvette kullanın.
      2. Cuvette sıfır standart test aktararak veri toplamayı başlatın; cihazı boşlayın (emiciliği sıfıra ayarlayın).
      3. Her tüpte tek bir okuma gerçekleştirin ve absorbans değerlerini bir veri tablosuna kaydedin. Yeni bir örnek okumadan önce cuvette'den kalan sıvıyı çıkarın. Sıfır standarttan başlayın, artan konsantrasyon standartlarına ve ardından örneklere geçin. Başladıktan sonra, tüm adımları durmadan verimli bir şekilde gerçekleştirin ve tüm tüpleri 10 dakika içinde okuyun.
   9. Örnek verileri çözümleme
      1. MM hidrazide standard ve A_500'içizerek standart bir eğri oluşturun. Standart eğri denklemini y = ax + b biçiminde bulun, burada y mM hidrazidini ve x A₅₀₀'ü temsil eder. Tipik bir standart eğri için Şekil 4'e bakın.
      2. Seyreltme faktörlerine göre ayar yaparak standart eğri denklemini kullanarak numunelerdeki mM hidrazidini hesaplayın. Hesaplama için standart eğrinin doğrusal aralığına düşen_{A 500} değerlerine sahip örnek test tüplerini seçin.
      3. Denklemi kullanarak hidrazit/polisakkarit molar oranını hesaplayın (1).
         Hidrazit/polisakkarit = h / c × MW (1)
         Burada h mM hidrazit, c polisakkarit mg / mL konsantrasyonudur ve MW kDa'daki polisakkarit moleküler ağırlığıdır.
      4. Denklemi kullanarak 100 kDa polisakkarit başına hidrazit etiketleme yoğunluğunu hesaplayın (2).
         100 kDa polisakkarit başına etiketleme yoğunluğu = h / c × 100 (2)
         Burada h mM hidrazit, ve c polisakkarit mg / mL konsantrasyonudur.
         NOT: Kolaylık sağlamak için, polisakkaritlerin 100.000 dalton moleküler ağırlığa sahip olduğu düşünülebilir. Bu, çeşitli polisakkaritlerin türetme seviyesini karşılaştırırken bir "etiketleme yoğunluğunu" göz önünde bulundurmaya izin verir.
      5. Hidrazid etiketleme yoğunluğunu ağırlık yüzdesi ADH olarak hesaplayın.
         1. Denklem (3) kullanarak ADH'nin etkili mg/mL konsantrasyonunun belirlenmesi.
            mg/mL ADH = (mM hidrazit / 1000) × 174 (3)
            burada 174, ADH'nin MW'ıdır.
         2. Denklemi (4)kullanarak % ADH ağırlığını hesaplayın.
            ağırlık % ADH = (mg/mL ADH) / (mg/mL polisakkarit) × 100 (4)

Sonuçlar

CDAP kimyası kullanılarak bir polisakkaritin aktivasyonunu ve türetilmesini göstermek için, dektran 0.25 ve 0.5 mg CDAP/ mg dektranda aktive edildi. Her reaksiyon için, sudaki 10 mg/mL dektran çözeltisi buz üzerinde soğutuldu ve 2,5 M DMAP stoğunun 1/10'uncu hacmi (bölüm 3'te açıklandığı gibi hazırlandı) eklendi. Nihai çözelti, 10 μL aliquots'ta 0,1 M NaOH ilavesi ile pH 9'a getirildi. Çözelti soğutuldu ve karıştırıldı, CDAP eklendi ve pH 9'da 15 dakika boyunca 0,1 M NaOH'luk 10 μL aliquots eklenerek muhafaza edildi.

Etiketli dektran daha sonra bölüm 6'da açıklandığı gibi 1 M NaCl, 0.15 M NaCl ve suya karşı sırayla çaprazlandı. Daha sonra resorcinol/sülfürik asit tahlili kullanılarak dektran için ADH-dektran test edildi (bölüm 7.2). Şeker standardı olarak glikoz kullanan tipik bir standart eğri Şekil 4A'dagösterilmiştir. Hidrazit içeriği bölüm 7.3'te açıklanan TNBS tahlili kullanılarak belirlenmiştir. Standart olarak ADH kullanan tipik bir hidrazit standart eğrisi Şekil 4B'de verilmiştir.

Dektranın iki aktivasyon düzeyinde aktivasyonundan elde edilen temsili hesaplamalar Şekil 4A,B'de gösterilmiştir. Veriler, Şekil 4C'desırasıyla 7.9.3.4 ve 7.9.3.5 bölümlerinde açıklandığı gibi, 100 kDa dektran polimer başına hem hidrazitler hem de dextran'a ADH'nin ağırlık yüzdesi olarak sunulmaktadır. CDAP oranı iki katına çıktıkça türetme derecesi yaklaşık iki katına çıktı.

Şekil 1: CDAP'ın kimyasal yapısı. CDAP = 1-cyano-4-dimetilamiopyridine tetrafluoroborat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CDAP aktivasyon ve konjugasyon süreci. İşlem kavramsal olarak iki aşamaya ayrılır ve aktif polisakkarit her ikisinde de ortaktır. Temel koşullar altında CDAP, polisakkarit hidroksilleri aktive ederek DMAP'ı serbest bırakır (reaksiyon 1). CDAP hidrolizi ayrıca DMAP salgılar (reaksiyon 3). Bir cyano-ester gösterilse de, bu gerçek ara olmayabilir. Bu nedenle ara, (CDAP) "aktif" polisakkarit olarak adlandırılır. İlk aktivasyon aşamasında, aktif polisakkarit hidrolize (reaksiyon 4) veya yan reaksiyonlara maruz (reaksiyon 5) olabilir. İkinci konjugasyon aşamasında (reaksiyon 2), aktif polisakkarit, reaksiyon 4 ve 5'e ek olarak kararlı bir isourea bağı oluşturmak için bir amin ile reaksiyona girer. Kısaltmalar: CDAP = 1-cyano-4-dimetilamiopyridine tetrafluoroborate; DMAP = 4-dimetilamiminopyridin; R-NH₂ = amin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: CDAP aktivasyonu ve konjugasyonu. İşlem, CDAP reaktivitesinin polisakkarit ile dengelenmesini, CDAP'nin ve aktif polisakkaritin stabilitesinin yanı sıra aktif polisakkaritin amin ile reaktivitesini gerektirir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Dektranın CDAP aktivasyonu için temsili sonuçlar. (A) resorcinol/ sülfürik asit ve (B) TNBS tahlilleri için tipik standart eğriler. 0.25 ve 0.5 mg CDAP/mg dektran ile aktive edilen dektran için tahlil sonuçları gösterilmiştir. Glikoz resorcinol tahlil için standart olarak kullanılmıştır. Dektran, mg / mL olarak, azı dişi konsantrasyonu vermek için 100 kDa'ya bölünür. Hidrazit konsantrasyonu standart olarak ADH kullanılarak belirlenir ve sonuçlar μM Hz. (C) Hidrazit hesaplaması olarak ifade edilir: dektran oranları. Derivatizasyon seviyesi, farklı ortalama moleküler ağırlıklardaki polimerler arasındaki karşılaştırmayı kolaylaştırmak için 100 kDa dektran başına hidrazitler olarak hesaplandı. g ADH/g dektran%ının ağırlık oranı, ADH için 174 g/mole MW kullanılarak hesaplandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

CDAP, polisakkaritleri türetmek ve konjuge etmek için uygun bir reaktiftir. Bu makalede, hidrazitlerle (PS-ADH) polisakkaritleri türetmek için CDAP'yi kullanmanın genel yöntemi açıklanmaktadır ve yakın zamanda yayınlanan iyileştirmeleri içerir⁸. İlk olarak, teknik aktivasyon sürecini kontrol etmek için hedef pH'ı korumanın önemini vurgular. Birçok yaygın arabellek CDAP aktivasyon reaksiyonunu müdahale ederken, DMAP'ın pH⁸'i yönetmek için arabellek olarak başarıyla kullanılabileceğini bulduk. Ayrıca, DMAP zaten CDAP etkinleştirmesinin bir reaksiyon yan ürünüdür. Son olarak, CDAP'yi eklemeden önce polisakkarit çözeltisinin DMAP ile tamponlaştırılması, reaksiyon pH'ının hassas bir şekilde hedeflenerek bakımını kolaylaştırır. Tarif ettiğimiz gibi, konsantre DMAP stok çözeltisinin pH'ını seyreltildiğinde hedeflenen pH'a ulaşacak şekilde ayarlamak yararlıdır. İkincisi, işlemi soğukta gerçekleştirmek reaksiyon süresini yavaşlattı, aktivasyon sürecini daha az çılgın ve daha bağışlayıcı hale getirdi. Daha düşük sıcaklık CDAP hidroliz oranını azalttı ve pH 9'daki optimum aktivasyon süresi ~3 dakikadan ~15 dakikaya yükseldi. Ek olarak, aynı aktivasyon seviyesini elde etmek için oda sıcaklığında yapılandan daha az CDAP gereklidir.

ADH türevli polisakkaritler karbodiimidler (örneğin, EDAC)⁷kullanılarak proteinlere eşlenebilir. Örneğin, birkaç lisanslı Hemofili influenzae b (Hib) aşısı, EDAC kullanarak tetanoz toksoidine eşlenerek ADH ile türetilen poliribosylribitolphosphate 'yi (PRP) kullanır. CNBr başlangıçta kullanıldı, ancak CDAP bu amaç için kullanımı çok daha kolay bir reaktiftir. Deneyimlerimize göre, ADH derivatizasyonu için iyi bir hedef aralığı, 100 kDa polisakkarit başına 10-30 hidrazit veya ağırlıkça ~% 1-3 ADH'dir.

Aynı işlem, ADH'yi bir diamin için ikame larak birincil aminlere sahip polisakkaritleri türetmek için de kullanılabilir. Polisakkaritleri amin⁸ile türetmek için heksan diamin kullanılması önerilir. Amine polisakkarit (PS-NH_2),protein konjugasyonu¹¹için geliştirilen reaktifler kullanılarak eşlenebilir. Tipik olarak, PS-NH₂ bir maleimid ile türetilir (örn. succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-karboksilat (SMCC) veya N-γ-maleimidobutyryl -oxysuccinimide ester (GMBS)) ve protein tiyoz edilir (örneğin, süksinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propiyonat (SP ile)DP)). Tiyol-maleimid kimyası çok etkilidir.

Proteinler ayrıca lizinler üzerindeki ɛ-amin yoluyla CDAP ile aktive polisakkaritlerle doğrudan birleşebilir. Kullanılan aktivasyon protokolü genellikle burada açıklanana benzer olsa da, aktivasyon seviyesini, polisakkarit ve protein konsantrasyonunu ve protein:polisakkarit oranı⁵, 6^,8'ioptimize etmek gerekir.

Dektran, nispeten yüksek hidroksil grubu yoğunluğu nedeniyle CDAP ile aktive edilmesi en kolay polisakkaritlerden biridir, ancak Vi antijeni gibi bazı polisakkaritler zor olabilir. Sonuç olarak, CDAP konjugasyonu için doğrudan proteinlere tek bir "en iyi" protokol yoktur. Öncelikle hidrazür türetme kapsamına göre belirlenen uygun aktivasyon seviyelerine ulaşmak için bir protokol geliştirmeyi ve daha sonra protein konjugasyonunu CDAP ile aktive edilmiş polisakkaride yönlendirmeyi öneriyoruz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Sigma	34851
Adipic acid dihydrazide	Sigma	A0638	MW 174
Amicon Ultra 15 10 kDa	Millipore	UFC901008	MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS
Analytical balance
Autotitrator or electronic pipet
Beaker  2-4 L
CDAP	SAFC	RES1458C	Sigma
DMAP	Sigma	107700	MW 122.2
Flake ice
HCl 1 M	VWR	BDH7202-1
Micro stir bar	VWR	76001-878
Microfuge tube (for CDAP)	VWR	87003-294
NaCl	VWR	BDH9286
NaOH 1 M	Sigma	1099130001
NaOH 10 M	Sigma	SX0607N-6
pH meter
pH probe	Cole Parmer	55510-22	6 mm x 110 mm Epoxy single junction
pH temperature probe
Pipets & tips
Saline or PBS
Small beaker 5-20 mL	VWR	10754-696	A 10 mL beaker allows room for pH probe & pipet
Small ice bucket
Small spatula
Stir plate
Resorcinol assay
Combitip	Eppendorf	10 ml
DI water
Dialysis tubing	Repligen	132650T	Spectra/Por 6-8kDa
Dialysis tubing clips	Repligen	142150
Heating block
Nitrile gloves	VWR
Repeat pipettor	Eppendorf	M4
Resorcinol	Sigma	398047
Sugar standard		As appropriate
Sulfuric acid 75%	VWR	BT126355-1L
Timer
TNBS assay
Adipic dihydrazide	Sigma	A0638	MW 174
Borosilcate test tubes 12 x 75	VWR	47729-570
Sodium borate, 0.5 M pH 9	Boston Biologicals	BB-160
TNBS 5% w/v	Sigma	P2297	MW 293.17