Polianhidrit IL-1α Nanopartiküllerinin In vivo Antitümör Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Özet

HNSCC'nin sinjenik fare modelinde IL-1α'nın antitümör aktivitesini ve ilişkili toksisitesini incelemek için standart bir protokol tanımlanmıştır.

Özet

Sitokin tedavisi, kanser hastalarında sağlam antitümör immün yanıtları üretebilen umut verici bir immünoterapötik stratejidir. Proinflamatuar sitokin interlökin-1 alfa (IL-1α) birçok preklinik ve klinik çalışmada antikanser ajanı olarak değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, grip benzeri semptomlar ve hipotansiyon da dahil olmak üzere doz sınırlayıcı toksisiteler, bu terapötik stratejiye olan coşkuyu azaltmıştır. IL-1α'nın polianhidrit nanopartikül (NP) bazlı verilmesi, bu bağlamda etkili bir yaklaşımı temsil edecektir, çünkü bu, toksik yan etkileri azaltırken IL-1α'nın sistemik olarak yavaş ve kontrollü bir şekilde salınmasına izin verebilir. Burada, IL-1α yüklü polianhidrit NP'lerin baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom (HNSCC) sinjenik fare modelindeki antitümör aktivitesinin bir analizi açıklanmaktadır. HPV16 E6/E7'yi kararlı bir şekilde eksprese eden murin orofaringeal epitel hücreleri, hRAS ve lusiferaz (mEERL) hücreleri ile birlikte C57BL/6J farelerinin sağ kanadına deri altından enjekte edildi. Tümörler herhangi bir yönde 3-4 mm'ye ulaştığında, farelere intraperitoneal olarak %1,5 IL-1a - yüklü 20:80 1,8-bis (p-karboksifenoksi)-3,6-dioksaoktan:1,6-bis(p-karboksifenoksi)hekzan (CPTEG: CPH) nanopartikül (IL-1α-NP) formülasyonu uygulandı. Tümör boyutu ve vücut ağırlığı, tümör boyutu veya kilo kaybı ötenazi kriterlerine ulaşana kadar sürekli olarak ölçüldü. Submandibuler venipunktur ile antitümör immün yanıtları değerlendirmek için kan örnekleri alındı ve sitokin multipleks tahlilleri ile inflamatuar sitokinler ölçüldü. Tümör ve inguinal lenf nodları rezeke edildi ve çok renkli akış sitometrisi ile çeşitli immün hücreleri analiz etmek için tek hücreli bir süspansiyona homojenize edildi. Bu standart yöntemler, araştırmacıların antitümör immün yanıtını ve immünostimülatör NP'lerin ve kanser tedavisi için diğer immünoterapi ajanlarının potansiyel mekanizmasını incelemelerine izin verecektir.

Giriş

Kanser immünoterapisinin ortaya çıkan alanlarından biri, hastaların bağışıklık sistemini tümör hücrelerine karşı aktive etmek için enflamatuar sitokinlerin kullanılmasıdır. Birkaç proinflamatuar sitokin (yani, interferon-alfa (IFNa), interlökin-2 (IL-2) ve interlökin-1 (IL-1)), antitümör özelliklerin yanı sıra sitokin bazlı ilaçların güvenliğini keşfetmeye ilgi duyan önemli antitümör bağışıklığı oluşturabilir. Özellikle interlökin-1 alfa (IL-1α), inflamasyonun ana sitokini olarak bilinen proinflamatuar bir sitokindir¹. 1970'lerin sonlarında bu sitokinin keşfinden bu yana, kemoterapinin olumsuz etkilerini tedavi etmek için bir antikanser ajanı ve hematopoetik bir ilaç olarak araştırılmıştır². 1980'lerin sonlarında, IL-1α 3,4,5,6'nın antikanser etkilerini belirlemek için çeşitli klinik öncesi ve klinik çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalar, melanom, renal hücreli karsinom ve yumurtalık karsinomuna karşı rekombinant IL-1α'nın (rIL-1α) umut verici antitümör aktivitesini bulmuştur. Bununla birlikte, ateş, bulantı, kusma, grip benzeri semptomlar ve en ciddi doz sınırlayıcı hipotansiyon gibi toksisiteler yaygın olarak gözlenmiştir. Ne yazık ki, dozla ilişkili bu toksisiteler, rIL-1α'nın daha ileri klinik kullanımı için coşkuyu azaltmıştır.

IL-1α aracılı toksisitelerin kritik sorununu ele almaya çalışmak için, IL-1α'nın yüzey erozyon kinetiği ile kontrollü salınımına izin veren polianhidrit nanopartikül (NP) formülasyonları araştırılacaktır. Bu NP formülasyonları, IL-1α'nın antitümör özelliklerinin faydalarını elde etmeyi ve doz sınırlayıcı yan etkileri azaltmayı amaçlamaktadır⁷. Polianhidritler, yüzey erozyonu yoluyla parçalanan ve kapsüllenmiş ajanların 8,9,10,11,12 oranında neredeyse sıfır dereceli salınımına neden olan FDA onaylı polimerlerdir. 1,8-bis-(p-karboksifenoksi)-3,6-dioksaoktan (CPTEG) ve 1,6-bis-(p-karboksifenoksi) hekzan (CPH) içeren amfifilik polianhidrit kopolimerlerinin, onkoloji ve immünoloji temelli araştırmalarda çeşitli yükler için mükemmel dağıtım sistemleri olduğu bildirilmiştir ^8,12. Aşağıdaki protokolde 20:80 CPTEG:Ağırlıkça% 1.5 rIL-1α (IL-1α-NP'ler) ile yüklü CPH NP'ler, HNSCC'nin bir fare modelinde bu sitokinin antitümör aktivitesini ve toksisitesini incelemek için kullanılacaktır.

Aşağıdaki prosedürlerin genel amacı, IL-1α-NP'lerin HNSCC'ler üzerindeki antitümör aktivitesini değerlendirmektir. Tümör büyümesinin ve sağkalımının değerlendirilmesi de dahil olmak üzere tarif edilen prosedürler, ilgilenilen herhangi bir immün modülatör ajana uygulanabilir. Bu prosedürler, klinik alaka düzeyini en üst düzeye çıkarmak için sağlam bir bağışıklık sistemi¹³ olan sinjenik bir fare modelinde yapılmalıdır. IL-1α-NP toksisitesi, dolaşımdaki proinflamatuar sitokin seviyelerindeki ve hayvan ağırlığındaki değişiklikleri ölçerek de değerlendirilecektir. İn vivo ilaç toksisitesini belirlemek için birçok yöntem vardır; Bununla birlikte, en yaygın kullanılan yöntemler, serum enzimlerinin organ toksisitesi ve bu organlardaki histolojik değişiklikler açısından ölçülmesini içerir. Bununla birlikte, histolojik analizler yapmak için, hayvanın kurban edilmesi gerekir, bu da deneyin hayatta kalma eğrilerini etkileyecektir. Bu nedenle, bu protokol, serum örneklerinde sitokinlerin ölçümü için canlı farelerden kan toplanması için bir protokol içerecektir. Toplanan serum, organ toksisitesi için istenen serum analitlerinin ölçümü için kullanılabilir. Çok renkli akım sitometrisi, tümör mikroortamındaki immün hücre popülasyonundaki değişiklikleri ve lenf noduna immün hücre göçünü anlamak için kullanılacaktır. İmmün hücreleri tanımlamak için, korunmuş bölüm^14'ün immünohistokimyası ve / veya immünofloresansı dahil olmak üzere diğer yöntemler kullanılabilir. Bununla birlikte, bu teknikler çok sayıda hayvan üzerinde gerçekleştirmek için zaman alıcı ve sıkıcı olabilir. Genel olarak, aşağıdaki yöntemler araştırmacıların antitümör immün yanıtını ve kanser tedavisi için immünostimülatör ajanların potansiyel mekanizmalarını incelemelerine izin verecektir.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm in vivo prosedürler, Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. HNSCC hücre hattının hazırlanması ve bakımı

NOT: Bu çalışmada, hRas ve lusiferaz (mEERL) ile birlikte HPV E6 ve E7 ile stabil olarak dönüştürülmüş murin orofaringeal epitel hücre hattı kullanılacaktır. Bu hücre hattı C57BL / 6J fare suşundan geliştirilmiştir ve Dr. Paola D. Vermeer'in (Güney Dakota Üniversitesi Sanford Tıp Fakültesi, Güney Dakota, ABD) Cerrahi Bölümü'nün bir hediyesiydi.

1. Önceden ısıtılmış (37 °C) bir su banyosunda dondurulmuş bir mEERL hücresi şişesini çözün ve daha sonra ılık kültür ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı [DMEM]% 40.5 1: 1 DMEM / Hams F12,% 10 Fetal Sığır Serumu [FBS],% 0.1 gentamisin,% 0.005 hidrokortizon,% 0.05 transferrin,% 0.05 insülin,% 0.0014 tri-iyodotironin ve% 0.005 epidermal büyüme faktörü ile desteklenmiştir).
2. Ortamı çıkarmak için konik tüpü 277 x g'de 25 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Daha sonra, hücre peletini 3-5 mL taze ortamda yeniden askıya alın ve bir T-25 hücre kültürü şişesine aktarın. Dondurulmuş depolamadan optimum geri kazanım için, yüksek yoğunlukta plaka hücreleri.
   NOT: T-25 şişeleri daha küçük boyutlarından dolayı kullanılmıştır, bu da hücreler T-75 şişelerine kıyasla yakın olduğunda donmuş depolamadan daha hızlı iyileşme süreleri ile sonuçlanır.
3. Hücrelerin nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C ve% 5 CO_2'de büyümesine, daha büyük şişelere (yani T-75 veya T-150) genişlemesine ve her 3 günde bir geçmesine izin verin. Tüm farelere istenen implantasyon için yeterli hücre olduğunda, şişeleri çıkarın, ortamı atın ve hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe durulayın. Daha sonra,% 0.25 tripsin-EDTA'dan 4 mL (T150 şişeleri kullanılıyorsa) ekleyin ve 2 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kullanılan çanak / şişe boyutuna bağlı olarak tripsin miktarını yukarı veya aşağı ölçeklendirin.
   NOT: Hücre çizgisinin tipi ve akıcılık derecesi tripsinizasyon sürelerini etkileyebilir. Uzun tripsinizasyon süreleri hücrelere zarar verebilir ve düşük canlılığa neden olabilir. Tripsinizasyon için gereken minimum süreyi kullanın.
4. Mikroskop altında, tripsinizasyondaki ayrılan hücreler serbestçe hareket eder. Bazı hücreler hala bağlıysa, kalan yapışkan hücreleri harekete geçirmek için şişeye çok nazikçe dokunun. Tripsin reaksiyonunu durdurmak için taze ortam ekleyin (istediğiniz kadar ortam miktarını ölçeklendirin) ve hücre süspansiyonunu 50 mL konik tüplerde toplayın. Ortamı çıkarmak için 25 °C'de 5 dakika boyunca 277 x g'de santrifüj yapın.
5. Hücreleri taze ortamda yeniden askıya alın ve hücreleri sayın. Bir kez daha santrifüj yapın (yukarıda açıklandığı gibi) ve daha sonra 10 × 10⁶ hücre / mL'lik bir son konsantrasyon yapmak için hücrelere soğuk PBS ekleyin. Farelere enjeksiyondan önce hücre süspansiyonlarını buz üzerinde tutun.

2. Tümör implantasyonu, ilaç tedavisi ve ölçümü

NOT: Deney hayvanları Iowa Üniversitesi'ndeki Hayvan Bakım Tesisi'nde tutuldu ve bunları işlemek için uygun aseptik prosedürler izlendi.

1. C57Bl / 6J farelerini ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) karışımı ile anestezize edin. Yandaki alanı veya istenen enjeksiyon bölgesini elektrikli tıraş bıçağı ile dikkatlice tıraş edin.
   NOT: Kurumsal (veya diğer) kural ve düzenlemelerin gerektirdiği şekilde kontrol edilen maddelerin kullanımını belgelemeyi unutmayın.
2. Yandaki alanı bir etanol pedi ile dezenfekte edin ve 25-28 G'lik bir şırınga kullanarak hücre süspansiyonunun 100 μL'sini (1 x 10⁶ hücre içeren) deri altından yavaşça enjekte edin. Ani hareketleri ve hücre kaybını önlemek için enjeksiyondan önce fareleri anestezi altına alın. Her enjeksiyondan önce, hücrelerin şişe veya konik tüpün dibine yerleşmesini önlemek için hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın.
3. Hücre süspansiyonunu şırıngaya aldıktan sonra, tüm kabarcıkları ve ölü alanı üstten çıkarın. Hücre süspansiyonunu yavaş ve sabit bir şekilde enjekte edin. Aynı iğneyi birden fazla farede kullanmayın. Kazara kaybı hesaba katmak için her zaman ekstra hücre süspansiyonları yapın.
4. Hayvanı kendi kafeslerine yerleştirin ve anesteziden kurtulana kadar izleyin. Anestezi sırasında hayvanlar hipotermi riski altındadır; bu nedenle, ek ısı sağlayın veya fareleri sıcak tutmak için birbirine yakın yerleştirin (aynı kafese yerleştirilmişse).
5. Tümörler herhangi bir yönde 3 mm'ye ulaştığında, tedavi gruplarındaki fareleri (tümör boyutuna ve / veya ağırlığına göre) randomize edin ve ardından ilaç tedavisine başlayın. Farelere intraperitoneal olarak (i.p.) 4. ve 9. günlerde^3.75 μg rIL-1α / fare içeren NPs 15 enjekte edin. Tümör boyutunu veya fareler ötenazi kriterlerine ulaşana kadar tümör^{hacmini (}uzunluk x genişlik 2) / 2) ve fare ağırlığını günlük veya her gün ölçün ve kaydedin.
   NOT: Deneyimli bir araştırmacı ile bile, aynı büyüklükteki tümörü tüm farelere implante etmek zordur. Hayvanları tümör boyutuna ve fare ağırlığına göre deney gruplarına randomize edin.

3. Kan alımı ve serum ayrımı

NOT: Submandibuler venden kan alımı, bilinçli hayvanlardan veya anestezi altındaki hayvanlardan kan alınmasını sağlayan kolay ve etkili bir tekniktir. Bu çalışma için, anestezi altındayken hayvanlardan kan toplandı.

1. Yukarıda belirtildiği gibi fareleri ketamin / ksilazin karışımı enjeksiyonu ile anestezi yapın.
2. Baskın olmayan eli kullanarak omuz üzerindeki gevşek cildi kavrayın ve submandibuler damarı, mandibulanın biraz arkasında (o bölgede beyaz bir nokta) 18 G'lik bir iğne veya neşter ile delin.
3. Hemen kan akışını sağlamak için damarı delin. 200-300 μL kan (fare ağırlığına bağlı olarak) 1,5 mL'lik bir polipropilen mikrosantrifüj tüpüne veya serum ayırıcı tüpüne toplayın. Kan toplandıktan sonra, kanama durana kadar delinme bölgesine hafif bir basınç uygulayın. Fareleri kendi kafeslerine geri döndürün ve anesteziden iyileşene kadar gözlemleyin.
   NOT: Bir koleksiyonda veya 24 saatlik bir süre boyunca fare vücut ağırlığının %1'inden fazlasını toplama.
4. Toplanan kan pıhtısını oda sıcaklığında 20-30 dakika bekletin. Tüpleri santrifüj edilmeye hazır olana kadar buzun üzerine yerleştirin.
5. Pıhtılaşmış kanı 4 ° C'de 15 dakika boyunca 1540 x g'de santrifüj edin.
6. Kırmızı kan hücrelerini rahatsız etmeden üst tabakayı (serum) toplayın. Kullanana kadar -80 °C'de saklayın.

4. Toplanan serumun çoklanması

1. Serum veya plazma örneklerini buz üzerinde tutarken çözün.
2. Herhangi bir hücre kalıntısını çökeltmek için numuneleri 1540 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve serum tabakasını üstten dikkatlice toplayın.
3. Multipleks kiti oda sıcaklığında ortaya çıkarın.
   NOT: Belirli sitokinler, kemokinler veya büyüme faktörleri için tasarlanmış, piyasada satılan birkaç multipleks kit vardır. Ayrıca, kiti ilgilenilen proteine göre özelleştirmek mümkündür.
4. Sitokinleri tespit etmek için tahlili üreticinin protokolüne göre yapın.
   NOT: Multipleks kitlerin çoğu, yakalanan antikoru bağlamak için manyetik boncuklar kullanır. Bu nedenle, yıkama sırasında otomatik veya elde taşınan bir manyetik yıkayıcı kullanmak önemlidir. Aksi takdirde, manyetik boncuklar plakadan yıkanacak ve birinin okumayı almak için yeterli olayı olmayacaktır.

5. Tümör ve inguinal lenf nodunun toplanması ve tek hücreli süspansiyonun hazırlanması

1. Fareleri ketamin / ksilazin karışımı ile anestezikleştirin. Tam sedasyon sağlamak için, pedal refleksini kullanın (sıkı ayak parmağı sıkışması). Fareler yanıt vermezse, fareleri servikal çıkık ile ötenazileştirin.
2. Her fareyi sırtına koyun ve karın bölgesi cildine% 70 etanol püskürtün. Tümörü farelerin sol tarafından ve lenf nodunu sağ taraftan kesmek için forseps ve makas kullanın. Tümör büyükse, küçük parçalara bölün ve 500-600 mg doku alın. Lenf nodu için tüm organı toplayın.
   NOT: Kasık bölgesinin her iki tarafında iki lenf nodu vardır. Deneysel hedeflere bağlı olarak, lenf nodu ve tümör aynı taraftan izole edilebilir. Bununla birlikte, tümör çok büyürse, lenf nodunu aynı taraftan toplamak kolay olmayacaktır.
3. Dokuları 3-5 mL RPMI ortamı içeren ilgili ayrışıcı tüplere yerleştirin. Otomatik bir ayrıştırıcı kullanarak dokuyu homojenize edin.
   NOT: Diğer otomatik veya el tipi homojenizatörler kullanılabilir.
4. Homojenizasyondan sonra, hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir filtreden 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Ortamı çıkarmak için 25 °C'de 5 dakika boyunca 277 x g'de santrifüj yapın. Hücreleri 1-2 mL soğuk PBS içinde yıkayın ve yeniden askıya alın.

6. Tek hücreli süspansiyonun FACS boyaması

1. Bir hemositometredeki canlı hücreleri saymak için% 0.4 tripan mavisi boyama kullanın. 2-3 milyon hücre elde etmek ve bunları ilgili FACS tüpüne aktarmak için gereken hacmi hesaplayın.
2. Canlı hücrelere geçiş yapmak için canlılık boyası kullanın; aksi takdirde, antikorun ölü hücrelerle spesifik olmayan bir şekilde bağlanması meydana gelebilir ve bu da yanlış pozitif sonuç verebilir.
   NOT: Bu deneyde canlı ve ölü hücre boyama için zombi boyası kullanılmıştır. Birkaç sabitlenebilir ve sabitlenemeyen boya (örneğin, propidium iyodür) ticari olarak temin edilebilir.
3. Santrifüj (25 ° C'de 5 dakika boyunca 277 x g) sayılan hücreler. Süpernatantı boşaltın ve hücreleri 300 μL PBS'ye yeniden askıya alın. 0,5-1 μL zombi boyası/tüpü ekleyin. Karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
4. Santrifüj (25 ° C'de 5 dakika boyunca 277 x g) ve hücreleri 1-2 mL FACS tamponu ile yıkayın ve 200 μL FACS tamponuna yeniden askıya alın.
5. Fc-reseptör blokeri ekleyin (200 μL başına 2 μL veya üreticinin protokolüne göre) ve hücreleri 10 dakika boyunca inkübe edin.
6. Santrifüj (25 °C'de 5 dakika boyunca 277 x g) ve hücreleri 1-2 mL FACS tamponu ile yıkayın. Antikor kokteylini ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
7. Kuluçkadan sonra, santrifüj yapın (25 ° C'de 5 dakika boyunca 277 x g) ve hücreleri 1-2 mL FACS tamponu ile yıkayın. 300-400 μL% 2 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve fiksasyon için yeniden askıya alın. Bu adımdaki hücreleri 4 ° C'de birkaç gün saklayın veya çok renkli akış sitometresi ile hemen analiz edin.

Sonuçlar

Bu çalışmada, HNSCC'nin sinjenik fare modelinde polianhidrit IL-1α'nın antitümör aktivitesi araştırılmıştır. Rekombinant IL-1α (rIL-1α), mEERL tümör büyümesini önemli ölçüde yavaşlattı (Şekil 1A), ancak tedavi edilen farelerde kilo kaybı gözlendi, bu da tedavinin kesilmesinden sonra restore edildi (Şekil 1B). IL-1α-NP'ler, salin veya boş-NP'lere kıyasla anlamlı bir antitümör etki yaratmadı (Şekil 1A

Tartışmalar

Bu protokol, herhangi bir araştırmacının antitümör aktivitesini ve immünomodülatör ilaçların altta yatan mekanizmalarından bazılarını in vivo tümör fare modeli sisteminde incelemesine izin verecektir. Burada, teknik olarak basit protokolü, tümör büyümesinin kolay izlenmesi, daha az hayvan morbiditesi ve daha yüksek üretilebilirlik dahil olmak üzere ortotopik modellere göre çeşitli avantajları olan sinjenik bir subkutan tümör modeli kullanılmıştır. Subkutan tümör modelleri, he...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Plex 200 Systems	Bio-Rad		The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay	Bio-Rad	M60009RDPD
C57BL/6J Mice	Jakson Labs	664	4 to 6 weeks old
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific	11965092
DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	11320033
EGF	Millipore Sigma	SRP3196-500UG
Fetal Bovine Serum	Millipore Sigma	12103C-500ML
Gentamycin sulfate solution	IBI Scientific	IB02030
gentleMACS Dissociator	Miltenyi biotec
Hand-Held Magnetic Plate Washer	Thermo Fisher Scientific	EPX-55555-000
Hydrocortisone	Millipore Sigma	H6909-10ML
Insulin	Millipore Sigma	I0516-5ML
Ketamine/xylazine			Injectable anesthesia
MEERL cell line			Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells
Portable Balances	Ohaus
Scienceware Digi-Max slide caliper	Millipore Sigma	Z503576-1EA
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol)	Cardinal	COV5110.PMP
Transferrin Human	Millipore Sigma	T8158-100MG
Tri-iodothyronin	Millipore Sigma	T5516-1MG