Bewertung der in vivo Antitumoraktivität von Polyanhydrid IL-1α Nanopartikeln

Zusammenfassung

Es wird ein Standardprotokoll beschrieben, um die Antitumoraktivität und die damit verbundene Toxizität von IL-1α in einem syngenen Mausmodell von HNSCC zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Zytokintherapie ist eine vielversprechende immuntherapeutische Strategie, die bei Krebspatienten eine robuste Antitumor-Immunantwort hervorrufen kann. Das proinflammatorische Zytokin Interleukin-1 alpha (IL-1α) wurde in mehreren präklinischen und klinischen Studien als krebshemmendes Mittel untersucht. Dosislimitierende Toxizitäten, einschließlich grippeähnlicher Symptome und Hypotonie, haben jedoch die Begeisterung für diese therapeutische Strategie gedämpft. Die auf Polyanhydrid-Nanopartikeln (NP) basierende Verabreichung von IL-1α wäre in diesem Zusammenhang ein wirksamer Ansatz, da dies eine langsame und kontrollierte Freisetzung von IL-1α systemisch ermöglichen und gleichzeitig toxische Nebenwirkungen reduzieren kann. Hier wird eine Analyse der Antitumoraktivität von IL-1α-beladenen Polyanhydrid-NPs in einem syngenen Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) syngenen Mausmodell beschrieben. In die rechte Flanke von C57BL/6J-Mäusen wurden murine oropharyngeale Epithelzellen, die HPV16 E6/E7 stabil exprimieren, zusammen mit hRAS- und Luciferase-Zellen (mEERL) injiziert. Sobald die Tumoren 3-4 mm in jede Richtung erreichten, wurde Mäusen intraperitoneal eine 1,5% IL-1a - beladene 20:80 1,8-Bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctan:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexan (CPTEG: CPH) Nanopartikel (IL-1α-NP) verabreicht. Tumorgröße und Körpergewicht wurden kontinuierlich gemessen, bis die Tumorgröße oder der Gewichtsverlust die Euthanasiekriterien erreichten. Blutproben wurden entnommen, um Antitumor-Immunantworten durch submandibuläre Venenpunktion zu bewerten, und inflammatorische Zytokine wurden durch Zytokin-Multiplex-Assays gemessen. Tumor- und Leistenlymphknoten wurden reseziert und zu einer Einzelzellsuspension homogenisiert, um verschiedene Immunzellen mittels Multicolor-Durchflusszytometrie zu analysieren. Diese Standardmethoden werden es den Forschern ermöglichen, die Antitumor-Immunantwort und den potenziellen Mechanismus von immunstimulierenden NPs und anderen Immuntherapeutika für die Krebsbehandlung zu untersuchen.

Einleitung

Einer der aufstrebenden Bereiche der Krebsimmuntherapie ist der Einsatz von inflammatorischen Zytokinen, um das Immunsystem der Patienten gegen ihre Tumorzellen zu aktivieren. Mehrere proinflammatorische Zytokine (z. B. Interferon-alpha (IFNα), Interleukin-2 (IL-2) und Interleukin-1 (IL-1)) können eine signifikante Antitumorimmunität aufbauen, was das Interesse an der Erforschung der Antitumoreigenschaften sowie der Sicherheit von Zytokin-basierten Medikamenten geweckt hat. Insbesondere Interleukin-1 alpha (IL-1α) ist ein proinflammatorisches Zytokin, das als Master-Zytokin der Entzündung¹ bekannt ist. Seit der Entdeckung dieses Zytokins in den späten 1970er Jahren wurde es sowohl als Krebsmittel als auch als hämatopoetisches Medikament zur Behandlung der negativen Auswirkungen der Chemotherapie^{untersucht 2}. In den späten 1980er Jahren wurden mehrere präklinische und klinische Studien durchgeführt, um die krebshemmende Wirkung von IL-1α 3,4,5,6 zu bestimmen. Diese Studien fanden eine vielversprechende Antitumoraktivität von rekombinantem IL-1α (rIL-1α) gegen Melanom, Nierenzellkarzinom und Ovarialkarzinom. Toxizitäten, einschließlich Fieber, Übelkeit, Erbrechen, grippeähnliche Symptome und am schwersten dosislimitierende Hypotonie, wurden jedoch häufig beobachtet. Leider dämpften diese dosisabhängigen Toxizitäten die Begeisterung für die weitere klinische Anwendung von rIL-1α.

Um das kritische Problem der IL-1α-vermittelten Toxizitäten anzugehen, werden Polyanhydrid-Nanopartikel (NP)-Formulierungen untersucht, die eine kontrollierte Freisetzung von IL-1α durch Oberflächenerosionskinetik ermöglichen. Diese NP-Formulierungen sollen die Vorteile der Antitumoreigenschaften von IL-1α nutzen und gleichzeitig dosislimitierende Nebenwirkungen reduzieren⁷. Polyanhydride sind von der FDA zugelassene Polymere, die durch Oberflächenerosion abgebaut werden, was zu einer nahezu Null-Ordnungs-Freisetzung von verkapselten Wirkstoffen 8,9,10,11,12 führt. Amphiphile Polyanhydrid-Copolymere, die 1,8-Bis-(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctan (CPTEG) und 1,6-Bis-(p-carboxyphenoxy)hexan (CPH) enthalten, haben sich als ausgezeichnete Verabreichungssysteme für verschiedene Nutzlasten in der onkologischen und immunologischen Forschung erwiesen ^8,12. Im folgenden Protokoll 20:80 werden CPTEG:CPH NPs, die mit 1,5 Gew.% rIL-1α (IL-1α-NPs) beladen sind, verwendet, um die Antitumoraktivität und Toxizität dieses Zytokins in einem Mausmodell von HNSCC zu untersuchen.

Das übergeordnete Ziel der folgenden Verfahren ist es, die Antitumoraktivität von IL-1α-NPs auf HNSCCs zu bewerten. Die beschriebenen Verfahren, einschließlich der Beurteilung des Tumorwachstums und des Überlebens, können auf jedes immunmodulatorische Mittel von Interesse angewendet werden. Diese Verfahren sollten in einem syngenen Mausmodell mit einem intakten Immunsystem¹³ durchgeführt werden, um die klinische Relevanz zu maximieren. Die IL-1α-NP-Toxizität wird auch durch Messung von Veränderungen der zirkulierenden Konzentrationen von proinflammatorischen Zytokinen und des Tiergewichts bewertet. Es gibt viele Methoden, um die In-vivo-Toxizität von Arzneimitteln zu bestimmen. Die am weitesten verbreiteten Methoden umfassen jedoch die Messung von Serumenzymen auf Organtoxizität und histologische Veränderungen in diesen Organen. Um histologische Analysen durchführen zu können, muss das Tier jedoch getötet werden, was sich auf die Überlebenskurven des Experiments auswirkt. Daher wird dieses Protokoll ein Protokoll für die Entnahme von Blut von lebenden Mäusen zur Messung von Zytokinen in Serumproben enthalten. Das gesammelte Serum kann für die Messung beliebiger Serumanalyten auf Organtoxizität verwendet werden. Die Multicolor-Durchflusszytometrie wird verwendet, um die Veränderungen in der Immunzellpopulation in der Tumormikroumgebung und die Migration von Immunzellen in den Lymphknoten zu verstehen. Andere Methoden können verwendet werden, um Immunzellen zu identifizieren, einschließlich Immunhistochemie und/oder Immunfluoreszenz von konservierten Abschnitten¹⁴. Diese Techniken können jedoch zeitaufwendig und mühsam sein, um sie bei einer großen Anzahl von Tieren durchzuführen. Insgesamt werden die folgenden Methoden es den Forschern ermöglichen, die Antitumor-Immunantwort und mögliche Mechanismen von Immunstimulanzien für die Krebsbehandlung zu untersuchen.

Protokoll

Alle in dieser Studie verwendeten In-vivo-Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Iowa genehmigt.

1. Herstellung und Pflege der HNSCC-Zelllinie

HINWEIS: In dieser Studie wird die murine oropharyngeale Epithelzelllinie, die stabil mit HPV E6 und E7 zusammen mit hRas und Luciferase (mEERL) transformiert wurde, verwendet. Diese Zelllinie wurde aus dem C57BL/6J-Mausstamm entwickelt und war ein Geschenk von Dr. Paola D. Vermeer (Klinik für Chirurgie, Sanford School of Medicine der University of South Dakota, South Dakota, USA).

1. Eine gefrorene Durchstechflasche mit mEERL-Zellen in einem vorgewärmten (37 °C) Wasserbad auftauen und dann in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit warmen Nährmedien überführen (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], ergänzt mit 40,5 % 1:1 DMEM/Hams F12, 10 % fetalem Rinderserum [FBS], 0,1 % Gentamicin, 0,005 % Hydrocortison, 0,05 % Transferrin, 0,05 % Insulin, 0,0014 % Trijodthyronin und 0,005 % epidermaler Wachstumsfaktor).
2. Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 277 x g für 5 min bei 25 °C, um das Medium zu entfernen. Anschließend wird das Zellpellet in 3-5 ml frischem Medium resuspendiert und in einen T-25-Zellkulturkolben überführt. Für eine optimale Rückgewinnung aus gefrorener Lagerung Plattenzellen mit hoher Dichte.
   ANMERKUNG: T-25-Kolben wurden aufgrund ihrer geringeren Größe verwendet, was zu schnelleren Erholungszeiten aus gefrorener Lagerung führt, wenn sich Zellen in unmittelbarer Nähe befinden, im Vergleich zu T-75-Kolben.
3. Lassen Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5%_CO2 wachsen, expandieren Sie zu größeren Kolben (z. B. T-75 oder T-150) und passieren Sie alle 3 Tage. Wenn genügend Zellen für die gewünschte Implantation in alle Mäuse vorhanden sind, entfernen Sie die Kolben, entsorgen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab. Anschließend werden 4 ml (bei Verwendung von T150-Kolben) 0,25 % Trypsin-EDTA zugegeben und bei 37 °C für 2 min inkubiert. Skalieren Sie die Trypsinmenge je nach verwendeter Schalen-/Kolbengröße nach oben oder unten.
   HINWEIS: Die Art der Zelllinie und der Grad der Konfluenz können die Trypsinisierungszeiten beeinflussen. Lange Trypsinisierungszeiten können Zellen schädigen, was zu einer geringen Lebensfähigkeit führt. Verwenden Sie die minimale Zeit, die für die Trypsinisierung benötigt wird.
4. Unter dem Mikroskop bewegen sich die abgelösten Zellen bei der Trypsinisierung frei. Wenn einige Zellen noch anhaften, klopfen Sie sehr vorsichtig auf den Kolben, um die verbleibenden adhärenten Zellen zu mobilisieren. Fügen Sie frisches Medium hinzu (skalieren Sie die Menge des Mediums nach Wunsch), um die Trypsinreaktion zu stoppen, und sammeln Sie die Zellsuspension in konischen 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 277 x g für 5 min bei 25 °C, um das Medium zu entfernen.
5. Resuspendieren Sie die Zellen in frischem Medium und zählen Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie noch einmal (wie oben beschrieben) und fügen Sie dann den Zellen kaltes PBS hinzu, um eine Endkonzentration von 10 × 10⁶ Zellen / ml zu erhalten. Bewahren Sie die Zellsuspension(en) vor der Injektion an Mäuse auf Eis auf.

2. Tumorimplantation, medikamentöse Behandlung und Messung

HINWEIS: Die Versuchstiere wurden in der Tierpflegeeinrichtung der Universität von Iowa gehalten und befolgten geeignete aseptische Verfahren, um sie zu behandeln.

1. Anästhesieren Sie C57Bl / 6J-Mäuse mit Ketamin (80 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) Mischung. Rasieren Sie den Flankenbereich oder die gewünschte Injektionsstelle vorsichtig mit einem Elektrorasierer.
   HINWEIS: Denken Sie daran, die Verwendung von kontrollierten Substanzen gemäß den gesetzlichen (oder anderen) Regeln und Vorschriften zu dokumentieren.
2. Desinfizieren Sie den Flankenbereich mit einem Ethanol-Pad und injizieren Sie langsam 100 μL (mit 1 x 10⁶ Zellen) der Zellsuspension subkutan mit einer 25-28 G-Spritze. Betäuben Sie die Mäuse vor der Injektion, um plötzliche Bewegungen und Zellverlust zu verhindern. Mischen Sie die Zellsuspension vor jeder Injektion vorsichtig, um zu verhindern, dass sich Zellen am Boden der Durchstechflasche oder des konischen Röhrchens absetzen.
3. Nachdem Sie die Zellsuspension in die Spritze aufgenommen haben, entfernen Sie alle Blasen und Toträume von oben. Injizieren Sie die Zellsuspension langsam und gleichmäßig. Verwenden Sie dieselbe Nadel nicht bei mehreren Mäusen. Stellen Sie immer zusätzliche Zellsuspensionen her, um versehentlichen Verlust Rechnung zu tragen.
4. Setzen Sie das Tier in seine jeweiligen Käfige und überwachen Sie es, bis es sich von der Narkose erholt hat. Während der Anästhesie besteht bei den Tieren das Risiko einer Unterkühlung. Stellen Sie daher zusätzliche Wärme zur Verfügung oder stellen Sie die Mäuse nahe beieinander, um sich warm zu halten (wenn sie im selben Käfig untergebracht sind).
5. Wenn Tumore 3 mm in jede Richtung erreichen, randomisieren Sie die Mäuse (nach Tumorgröße und / oder Gewicht) in den Behandlungsgruppen und beginnen Sie dann mit der medikamentösen Behandlung. An den Tagen 4 und 9 wird den Mäusen intraperitoneal (i.p.) NP¹⁵ mit 3,75 μg rIL-1α/Maus injiziert. Messen und erfassen Sie das Tumorvolumen ((Länge x Breite 2) /²) und das Mausgewicht täglich oder jeden zweiten Tag, bis die Tumorgröße oder die Mäuse die Euthanasiekriterien erreichen.
   HINWEIS: Selbst mit einem erfahrenen Forscher ist es schwierig, allen Mäusen den gleich großen Tumor zu implantieren. Randomisieren Sie die Tiere in Versuchsgruppen basierend auf der Tumorgröße und dem Gewicht der Maus.

3. Blutentnahme und Serumtrennung

HINWEIS: Die Blutentnahme aus einer Vena submandibularis ist eine einfache und effektive Technik, die die Blutentnahme von bewussten Tieren oder Tieren unter Narkose ermöglicht. Für diese Studie wurde Blut von den Tieren gesammelt, als sie unter Narkose waren.

1. Betäuben Sie die Mäuse mit einer Injektion von Ketamin / Xylazin-Mischung, wie oben erwähnt.
2. Fassen Sie die lose Haut über der Schulter mit der nicht dominanten Hand und punktieren Sie die Vena submandibularis mit einer 18 G Nadel oder Lanzette, etwas hinter dem Unterkiefer (ein weißer Fleck in diesem Bereich).
3. Punktieren Sie die Vene, um den Blutfluss sofort sicherzustellen. Sammeln Sie 200-300 μl Blut (abhängig vom Gewicht der Maus) in einem 1,5 ml Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen oder Serumseparatorglas. Üben Sie nach der Blutentnahme sanften Druck auf die Einstichstelle aus, bis die Blutung aufgehört hat. Bringen Sie die Mäuse in ihre jeweiligen Käfige zurück und beobachten Sie, bis sie sich von der Narkose erholt haben.
   HINWEIS: Sammeln Sie nicht mehr als 1% des Körpergewichts der Maus in einer Sammlung oder über einen Zeitraum von 24 Stunden.
4. Lassen Sie das gesammelte Blutgerinnsel bei Raumtemperatur für 20-30 Minuten einwirken. Legen Sie die Röhrchen auf Eis, bis sie zum Zentrifugieren bereit sind.
5. Das geronnene Blut wird bei 1540 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert.
6. Sammeln Sie die obere Schicht (Serum), ohne die roten Blutkörperchen zu stören. Bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.

4. Multiplexing des gesammelten Serums

1. Tauen Sie die Serum- oder Plasmaproben auf, während Sie sie auf Eis halten.
2. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1540 x g für 5 min bei 4 °C, um Zelltrümmer zu sedimentieren, und sammeln Sie die Serumschicht vorsichtig von oben.
3. Holen Sie das Multiplex-Kit bei Raumtemperatur heraus.
   HINWEIS: Es gibt mehrere kommerziell erhältliche Multiplex-Kits, die für bestimmte Zytokine, Chemokine oder Wachstumsfaktoren entwickelt wurden. Es ist auch möglich, das Kit basierend auf dem interessierenden Protein anzupassen.
4. Führen Sie den Assay gemäß dem Protokoll des Herstellers durch, um Zytokine nachzuweisen.
   HINWEIS: Die meisten Multiplex-Kits verwenden magnetische Perlen, um den eingefangenen Antikörper zu binden. Daher ist es wichtig, während des Waschens eine automatisierte oder handgeführte Magnetwaschmaschine zu verwenden. Andernfalls werden die magnetischen Perlen von der Platte abgewaschen, und man hat nicht genug Ereignisse, um die Ablesung durchzuführen.

5. Entnahme von Tumor und Leistenlymphknoten und Herstellung der Einzelzellsuspension

1. Betäuben Sie die Mäuse mit Ketamin / Xylazin-Mischung. Um eine vollständige Sedierung zu gewährleisten, verwenden Sie den Pedalreflex (festes Zehenkneifen). Wenn die Mäuse nicht ansprechbar sind, werden die Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation eingeschläfert.
2. Legen Sie jede Maus auf den Rücken und sprühen Sie 70% Ethanol auf die Haut im Bauchbereich. Verwenden Sie eine Pinzette und eine Schere, um den Tumor von der linken Seite der Mäuse und den Lymphknoten von der rechten Seite zu schneiden. Wenn der Tumor groß ist, schneiden Sie ihn in kleine Stücke und nehmen Sie 500-600 mg des Gewebes. Für den Lymphknoten sammeln Sie das ganze Organ.
   HINWEIS: Es gibt zwei Lymphknoten auf beiden Seiten der Leistengegend. Abhängig von den experimentellen Zielen können der Lymphknoten und der Tumor von derselben Seite isoliert werden. Wenn der Tumor jedoch sehr groß wird, ist es nicht einfach, den Lymphknoten von derselben Seite zu sammeln.
3. Legen Sie das Gewebe auf die entsprechenden Dissoziatorröhrchen, die 3-5 ml RPMI-Medien enthalten. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem automatisierten Dissoziator.
   HINWEIS: Es können auch andere automatisierte oder tragbare Homogenisatoren verwendet werden.
4. Nach der Homogenisierung wird die Zellsuspension durch einen 70-μm-Filter in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie bei 277 x g für 5 min bei 25 °C, um das Medium zu entfernen. Waschen und resuspendieren Sie die Zellen in 1-2 ml kaltem PBS.

6. FACS-Färbung einer einzelligen Suspension

1. Verwenden Sie 0,4% Trypanblau-Färbung, um die lebensfähigen Zellen in einem Hämozytometer zu zählen. Berechnen Sie das Volumen, das benötigt wird, um 2-3 Millionen Zellen zu erhalten, und übertragen Sie sie in die jeweilige FACS-Röhre.
2. Verwenden Sie Lebensfähigkeitsfarbstoff, um lebende Zellen zu schützen. Andernfalls kann es zu einer unspezifischen Bindung des Antikörpers an abgestorbene Zellen kommen, die zu einem falsch-positiven Ergebnis führen kann.
   HINWEIS: Zombie-Farbstoff wurde in diesem Experiment für die Färbung lebender und toter Zellen verwendet. Mehrere fixierbare und nicht fixierbare Farbstoffe (z. B. Propidiumiodid) sind kommerziell erhältlich.
3. Zentrifuge (277 x g für 5 min bei 25 °C) die gezählten Zellen. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 300 μL PBS. Fügen Sie 0,5-1 μL Zombie-Farbstoff/Röhrchen hinzu. Bei Raumtemperatur 20 min im Dunkeln inkubieren.
4. Zentrifuge (277 x g für 5 min bei 25 °C) und die Zellen mit 1-2 mL FACS-Puffer waschen und in 200 μL FACS-Puffer resuspendieren.
5. Fügen Sie einen Fc-Rezeptorblocker hinzu (2 μL pro 200 μL oder gemäß dem Protokoll des Herstellers) und inkubieren Sie die Zellen für 10 min.
6. Zentrifuge (277 x g für 5 min bei 25 °C) und die Zellen mit 1-2 mL FACS-Puffer waschen. Den Antikörper-Cocktail zugeben und 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
7. Nach der Inkubation zentrifugieren (277 x g für 5 min bei 25 °C) und die Zellen mit 1-2 mL FACS-Puffer waschen. Fügen Sie 300-400 μL 2% Paraformaldehydlösung hinzu und resuspendieren Sie zur Fixierung. Lagern Sie die Zellen in diesem Schritt für einige Tage bei 4 °C oder analysieren Sie sie sofort mit einem Multicolor-Durchflusszytometer.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde die Antitumoraktivität von Polyanhydrid IL-1α in einem syngenen Mausmodell von HNSCC untersucht. Rekombinantes IL-1α (rIL-1α) verlangsamte signifikant das Wachstum des mEERL-Tumors (Abbildung 1A), obwohl bei den behandelten Mäusen ein Gewichtsverlust beobachtet wurde, der nach Absetzen der Behandlung wiederhergestellt wurde (Abbildung 1B). IL-1α-NPs induzierten im Vergleich zu Kochsalzlösung oder Leer-NPs keinen signifikanten Antitu...

Diskussion

Dieses Protokoll wird es jedem Forscher ermöglichen, die Antitumoraktivität und einige der zugrunde liegenden Mechanismen von immunmodulatorischen Medikamenten in einem In-vivo-Tumor-Mausmodellsystem zu untersuchen. Hier wurde ein syngenes subkutanes Tumormodell verwendet, das mehrere Vorteile gegenüber Orthotopenmodellen aufweist, darunter ein technisch einfaches Protokoll, eine einfache Überwachung des Tumorwachstums, eine geringere Morbidität bei Tieren und eine höhere Produzierbarkeit. Subkutane Tumor...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Plex 200 Systems	Bio-Rad		The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay	Bio-Rad	M60009RDPD
C57BL/6J Mice	Jakson Labs	664	4 to 6 weeks old
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific	11965092
DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	11320033
EGF	Millipore Sigma	SRP3196-500UG
Fetal Bovine Serum	Millipore Sigma	12103C-500ML
Gentamycin sulfate solution	IBI Scientific	IB02030
gentleMACS Dissociator	Miltenyi biotec
Hand-Held Magnetic Plate Washer	Thermo Fisher Scientific	EPX-55555-000
Hydrocortisone	Millipore Sigma	H6909-10ML
Insulin	Millipore Sigma	I0516-5ML
Ketamine/xylazine			Injectable anesthesia
MEERL cell line			Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells
Portable Balances	Ohaus
Scienceware Digi-Max slide caliper	Millipore Sigma	Z503576-1EA
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol)	Cardinal	COV5110.PMP
Transferrin Human	Millipore Sigma	T8158-100MG
Tri-iodothyronin	Millipore Sigma	T5516-1MG