Valutazione dell'attività antitumorale in vivo di nanoparticelle di polianidride IL-1α

Riepilogo

Viene descritto un protocollo standard per studiare l'attività antitumorale e la tossicità associata di IL-1α in un modello murino singeneico di HNSCC.

Abstract

La terapia con citochine è una strategia immunoterapeutica promettente in grado di produrre robuste risposte immunitarie antitumorali nei pazienti oncologici. La citochina proinfiammatoria interleuchina-1 alfa (IL-1α) è stata valutata come agente antitumorale in diversi studi preclinici e clinici. Tuttavia, le tossicità dose-limitanti, compresi i sintomi simil-influenzali e l'ipotensione, hanno smorzato l'entusiasmo per questa strategia terapeutica. La somministrazione di IL-1α basata su nanoparticelle di polianidride (NP) rappresenterebbe un approccio efficace in questo contesto poiché ciò potrebbe consentire un rilascio lento e controllato di IL-1α a livello sistemico, riducendo al contempo gli effetti collaterali tossici. Qui viene descritta un'analisi dell'attività antitumorale delle NP di polianidride caricate con IL-1α in un modello murino singeneico di carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC). Le cellule epiteliali orofaringee murine che esprimono stabilmente HPV16 E6/E7 insieme alle cellule hRAS e luciferasi (mEERL) sono state iniettate per via sottocutanea nel fianco destro dei topi C57BL/6J. Una volta che i tumori hanno raggiunto 3-4 mm in qualsiasi direzione, una formulazione di nanoparticelle 1,8-bis(p-carbossifenossi)-3,6-dioxaottane:1,6-bis(p-carbossifenossi)esano (CPTEG: CPH) caricata 20:80 è stata somministrata ai topi per via intraperitoneale. Le dimensioni del tumore e il peso corporeo sono stati continuamente misurati fino a quando le dimensioni del tumore o la perdita di peso hanno raggiunto i criteri di eutanasia. Sono stati prelevati campioni di sangue per valutare le risposte immunitarie antitumorali mediante venipuntura sottomandibolare e le citochine infiammatorie sono state misurate attraverso saggi multiplex di citochine. I linfonodi tumorali e inguinali sono stati resecati e omogeneizzati in una sospensione unicellulare per analizzare varie cellule immunitarie attraverso la citometria a flusso multicolore. Questi metodi standard consentiranno ai ricercatori di studiare la risposta immunitaria antitumorale e il potenziale meccanismo delle NP immunostimolatorie e di altri agenti immunoterapici per il trattamento del cancro.

Introduzione

Una delle aree emergenti dell'immunoterapia del cancro è l'uso di citochine infiammatorie per attivare il sistema immunitario dei pazienti contro le loro cellule tumorali. Diverse citochine proinfiammatorie (cioè interferone-alfa (IFNα), interleuchina-2 (IL-2) e interleuchina-1 (IL-1)) possono montare una significativa immunità antitumorale, che ha generato interesse nell'esplorare le proprietà antitumorali e la sicurezza dei farmaci a base di citochine. L'interleuchina-1 alfa (IL-1α), in particolare, è una citochina proinfiammatoria nota come citochina principale dell'infiammazione¹. Dalla scoperta di questa citochina alla fine del 1970, è stato studiato come agente antitumorale e un farmaco ematopoietico per trattare gli effetti negativi della chemioterapia². Durante la fine del 1980, diversi studi preclinici e clinici sono stati condotti per determinare gli effetti antitumorali di IL-1α 3,4,5,6. Questi studi hanno trovato una promettente attività antitumorale di IL-1α ricombinante (rIL-1α) contro il melanoma, il carcinoma a cellule renali e il carcinoma ovarico. Tuttavia, sono state comunemente osservate tossicità, tra cui febbre, nausea, vomito, sintomi simil-influenzali e ipotensione più gravemente dose-limitante. Sfortunatamente, queste tossicità correlate alla dose hanno smorzato l'entusiasmo per un ulteriore uso clinico di rIL-1α.

Per tentare di affrontare il problema critico delle tossicità mediate da IL-1α, verranno studiate formulazioni di nanoparticelle di polianidride (NP) che consentano il rilascio controllato di IL-1α da parte della cinetica di erosione superficiale. Queste formulazioni NP hanno lo scopo di raccogliere i benefici delle proprietà antitumorali di IL-1α riducendo gli effetti collaterali dose-limitanti⁷. Le polianidridi sono polimeri approvati dalla FDA che si degradano attraverso l'erosione superficiale con conseguente rilascio quasi nullo di agenti incapsulati 8,9,10,11,12. I copolimeri anfifilici di polianidride contenenti 1,8-bis-(p-carbossifenerossi)-3,6-diossaottano (CPTEG) e 1,6-bis-(p-carbossifensilene) esano (CPH) sono risultati eccellenti sistemi di rilascio per vari carichi utili nella ricerca oncologica e immunologica ^8,12. Nel seguente protocollo 20:80 CPTEG:CPH NPs caricati con 1,5% wt.% rIL-1α (IL-1α-NPs) saranno utilizzati per studiare l'attività antitumorale e la tossicità di questa citochina in un modello murino di HNSCC.

L'obiettivo generale delle seguenti procedure è valutare l'attività antitumorale di IL-1α-NPs sugli HNSCC. Le procedure descritte, compresa la valutazione della crescita e della sopravvivenza del tumore, possono essere applicate a qualsiasi agente immunomodulatore di interesse. Queste procedure devono essere eseguite in un modello murino singeneico con un sistema immunitario intatto¹³ per massimizzare la rilevanza clinica. La tossicità di IL-1α-NP sarà valutata anche misurando le variazioni dei livelli circolanti di citochine proinfiammatorie e del peso animale. Esistono molti metodi per determinare la tossicità dei farmaci in vivo ; Tuttavia, i metodi più utilizzati comportano la misurazione degli enzimi sierici per la tossicità degli organi e i cambiamenti istologici in tali organi. Tuttavia, per eseguire analisi istologiche, l'animale deve essere sacrificato, il che influenzerà le curve di sopravvivenza dell'esperimento. Pertanto, questo protocollo includerà un protocollo per la raccolta di sangue da topi vivi per la misurazione delle citochine nei campioni di siero. Il siero raccolto può essere utilizzato per la misurazione di qualsiasi analita sierico desiderato per la tossicità d'organo. La citometria a flusso multicolore sarà utilizzata per comprendere i cambiamenti nella popolazione di cellule immunitarie nel microambiente tumorale e la migrazione delle cellule immunitarie al linfonodo. Altri metodi possono essere utilizzati per identificare le cellule immunitarie, tra cui l'immunoistochimica e/o l'immunofluorescenza delle sezioni conservate¹⁴. Tuttavia, queste tecniche possono richiedere molto tempo e noiose da eseguire su un gran numero di animali. Nel complesso, i seguenti metodi consentiranno ai ricercatori di studiare la risposta immunitaria antitumorale e i potenziali meccanismi degli agenti immunostimolatori per il trattamento del cancro.

Protocollo

Tutte le procedure in vivo utilizzate in questo studio sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dell'Iowa.

1. Preparazione e manutenzione della linea cellulare HNSCC

NOTA: In questo studio, verrà utilizzata la linea cellulare epiteliale orofaringea murina trasformata stabilmente con HPV E6 ed E7 insieme a hRas e luciferasi (mEERL). Questa linea cellulare è stata sviluppata dal ceppo murino C57BL/6J ed è stata un dono della Dr. Paola D. Vermeer (Dipartimento di Chirurgia, University of South Dakota Sanford School of Medicine, South Dakota, USA).

1. Scongelare una fiala congelata di cellule mEERL in un bagno d'acqua preriscaldato (37 °C) e quindi trasferire in un tubo conico da 15 mL contenente terreni di coltura caldi (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] integrato con 40,5% 1:1 DMEM/Hams F12, 10% Fetal Bovine Serum [FBS], 0,1% gentamicina, 0,005% idrocortisone, 0,05% transferrina, 0,05% insulina, 0,0014% tri-iodotironina e 0,005% fattore di crescita epidermico).
2. Centrifugare il tubo conico a 277 x g per 5 minuti a 25 °C per rimuovere il fluido. Quindi, risospendere il pellet cellulare in 3-5 ml di terreno fresco e trasferirlo in un pallone di coltura cellulare T-25. Per un recupero ottimale dallo stoccaggio congelato, celle a piastre ad alta densità.
   NOTA: i palloni T-25 sono stati utilizzati a causa delle loro dimensioni più ridotte, con tempi di recupero più rapidi dallo stoccaggio congelato quando le celle sono in prossimità rispetto ai palloni T-75.
3. Lasciare che le cellule crescano in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO₂, espandersi in palloni più grandi (cioè T-75 o T-150) e passare ogni 3 giorni. Quando ci sono abbastanza cellule per l'impianto desiderato in tutti i topi, rimuovere i palloni, scartare i mezzi e sciacquare delicatamente le cellule con soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Quindi, aggiungere 4 ml (se si utilizzano matraccio T150) di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare a 37 °C per 2 minuti. Aumentare o diminuire la quantità di tripsina a seconda delle dimensioni del piatto/pallone utilizzato.
   NOTA: Il tipo di linea cellulare e il grado di confluenza possono influire sui tempi di tripsinizzazione. Lunghi periodi di tripsinizzazione possono danneggiare le cellule con conseguente bassa vitalità. Utilizzare la quantità minima di tempo necessaria per la tripsinizzazione.
4. Sotto il microscopio, le cellule staccate sulla tripsinizzazione si muovono liberamente. Se alcune cellule sono ancora attaccate, picchiettare molto delicatamente il pallone per mobilitare le cellule aderenti rimanenti. Aggiungere mezzi freschi (scala la quantità di media come desiderato) per fermare la reazione della tripsina e raccogliere la sospensione cellulare in tubi conici da 50 ml. Centrifugare a 277 x g per 5 minuti a 25 °C per rimuovere il fluido.
5. Risospendere le celle in nuovi mezzi e contare le celle. Centrifugare ancora una volta (come descritto sopra), quindi aggiungere PBS freddo alle cellule per ottenere una concentrazione finale di 10 × 10⁶ cellule / ml. Tenere la sospensione o le sospensioni cellulari sul ghiaccio prima dell'iniezione ai topi.

2. Impianto del tumore, trattamento farmacologico e misurazione

NOTA: Gli animali da esperimento sono stati tenuti nella struttura di cura degli animali presso l'Università dell'Iowa e hanno seguito procedure asettiche appropriate per gestirli.

1. Anestetizzare topi C57Bl/6J con ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) miscela. Rasare con cura l'area del fianco o il sito di iniezione desiderato con un rasoio elettrico.
   NOTA: Ricordarsi di documentare l'uso di sostanze controllate come richiesto da norme e regolamenti istituzionali (o di altro tipo).
2. Disinfettare l'area del fianco con un tampone di etanolo e iniettare lentamente 100 μL (contenenti 1 x 10⁶ cellule) della sospensione cellulare per via sottocutanea utilizzando una siringa da 25-28 G. Anestetizzare i topi prima dell'iniezione per prevenire movimenti improvvisi e perdita di cellule. Prima di ogni iniezione, mescolare delicatamente la sospensione cellulare per evitare che le cellule si depositino sul fondo del flaconcino o del tubo conico.
3. Dopo aver preso la sospensione cellulare nella siringa, rimuovere tutte le bolle e lo spazio morto dalla parte superiore. Iniettare la sospensione cellulare in modo lento e costante. Non usare lo stesso ago su più topi. Effettuare sempre sospensioni di celle aggiuntive per tenere conto della perdita accidentale.
4. Metti l'animale nelle rispettive gabbie e monitorali fino a quando non si riprendono dall'anestesia. Durante l'anestesia, gli animali sono a rischio di ipotermia; Pertanto, fornire calore supplementare o posizionare i topi vicini l'uno all'altro per tenerli al caldo (se alloggiati nella stessa gabbia).
5. Quando i tumori raggiungono 3 mm in qualsiasi direzione, randomizzare i topi (per dimensioni del tumore e / o peso) nei gruppi di trattamento e quindi iniziare il trattamento farmacologico. Iniettare i topi per via intraperitoneale (i.p.) con NPs¹⁵ contenenti 3,75 μg di rIL-1α/topo nei giorni 4 e 9. Misurare e registrare il volume del tumore ((lunghezza x larghezza 2) /²) e il peso del topo ogni giorno o a giorni alterni fino a quando le dimensioni del tumore o i topi raggiungono i criteri di eutanasia.
   NOTA: Anche con un ricercatore esperto, è difficile impiantare il tumore delle stesse dimensioni in tutti i topi. Randomizzare gli animali in gruppi sperimentali in base alle dimensioni del tumore e al peso del topo.

3. Raccolta del sangue e separazione del siero

NOTA: La raccolta del sangue da una vena sottomandibolare è una tecnica facile ed efficace che consente la raccolta di sangue da animali coscienti o animali sotto anestesia. Per questo studio, il sangue è stato raccolto dagli animali quando erano sotto anestesia.

1. Anestetizzare i topi con un'iniezione di miscela ketamina / xilazina come menzionato sopra.
2. Afferrare la pelle flaccida sopra la spalla usando la mano non dominante e perforare la vena sottomandibolare con un ago o una lancetta da 18 G, leggermente dietro la mandibola (una macchia bianca in quella zona).
3. Forare la vena per garantire immediatamente il flusso sanguigno. Raccogliere 200-300 μL di sangue (a seconda del peso del topo) in una provetta da 1,5 mL di microcentrifuga in polipropilene o in una provetta per separatore di siero. Dopo la raccolta del sangue, applicare una leggera pressione sul sito di puntura fino a quando l'emorragia non si è fermata. Riportare i topi nelle rispettive gabbie e osservare fino a quando non si riprendono dall'anestesia.
   NOTA: Non raccogliere più dell'1% del peso corporeo del mouse in una raccolta o per un periodo di 24 ore.
4. Lasciare coagulare il sangue raccolto a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Posizionare i tubi sul ghiaccio fino a quando non sono pronti per essere centrifugati.
5. Centrifugare il sangue coagulato a 1540 x g per 15 minuti a 4 °C.
6. Raccogliere lo strato superiore (siero) senza disturbare i globuli rossi. Conservare a -80 °C fino all'uso.

4. Multiplexing del siero raccolto

1. Scongelare i campioni di siero o plasma mantenendoli sul ghiaccio.
2. Centrifugare i campioni a 1540 x g per 5 minuti a 4 °C per sedimentare eventuali detriti cellulari e raccogliere con cura lo strato di siero dall'alto.
3. Tirare fuori il kit multiplex a temperatura ambiente.
   NOTA: Esistono diversi kit multiplex disponibili in commercio progettati per citochine, chemochine o fattori di crescita specifici. Inoltre, è possibile personalizzare il kit in base alla proteina di interesse.
4. Eseguire il test secondo il protocollo del produttore per rilevare le citochine.
   NOTA: La maggior parte dei kit multiplex utilizza perline magnetiche per legare l'anticorpo catturato. Pertanto, è essenziale utilizzare una rondella magnetica automatica o portatile durante il lavaggio. Altrimenti, le perle magnetiche si laveranno via dal piatto e non si avranno abbastanza eventi per prendere la lettura.

5. Raccolta del tumore e del linfonodo inguinale e preparazione della sospensione unicellulare

1. Anestetizzare i topi con miscela ketamina/xilazina. Per garantire una sedazione completa, utilizzare il riflesso del pedale (pizzico fermo della punta). Se i topi non reagiscono, eutanasia i topi per lussazione cervicale.
2. Appoggiare ogni topo sulla schiena e spruzzare etanolo al 70% sulla pelle della zona addominale. Utilizzare pinze e forbici per tagliare il tumore dal lato sinistro dei topi e il linfonodo dal lato destro. Se il tumore è grande, tagliarlo a pezzetti e prendere 500-600 mg di tessuto. Per il linfonodo, raccogliere l'intero organo.
   NOTA: Ci sono due linfonodi su entrambi i lati della regione inguinale. A seconda degli obiettivi sperimentali, il linfonodo e il tumore possono essere isolati dallo stesso lato. Tuttavia, se il tumore diventa molto grande, non sarà facile raccogliere il linfonodo dallo stesso lato.
3. Posizionare i tessuti sui rispettivi tubi dissociatori contenenti 3-5 ml di fluido RPMI. Omogeneizzare il tessuto utilizzando un dissociatore automatico.
   NOTA: è possibile utilizzare altri omogeneizzatori automatici o portatili.
4. Dopo l'omogeneizzazione, trasferire la sospensione cellulare attraverso un filtro da 70 μm in un tubo conico da 50 ml. Centrifugare a 277 x g per 5 minuti a 25 °C per rimuovere il fluido. Lavare e risospendere le cellule in 1-2 ml di PBS freddo.

6. Colorazione FACS della sospensione monocellulare

1. Utilizzare la colorazione blu trypan allo 0,4% per contare le cellule vitali in un emocitometro. Calcola il volume necessario per ottenere 2-3 milioni di celle e trasferiscile al rispettivo tubo FACS.
2. Utilizzare il colorante di vitalità per il cancello sulle cellule vive; In caso contrario, può verificarsi un legame non specifico dell'anticorpo con cellule morte che può produrre un risultato falso positivo.
   NOTA: Il colorante zombie è stato utilizzato per la colorazione di cellule vive e morte in questo esperimento. Diversi coloranti fissabili e non fissabili (ad esempio, ioduro di propidio) sono disponibili in commercio.
3. Centrifugare (277 x g per 5 minuti a 25 °C) le celle contate. Decantare il surnatante e risospendere le cellule in 300 μL di PBS. Aggiungere 0,5-1 μL di colorante/tubo zombie. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti al buio.
4. Centrifugare (277 x g per 5 minuti a 25 °C) e lavare le celle con 1-2 ml di tampone FACS e risospenderle in 200 μL di tampone FACS.
5. Aggiungere il bloccante del recettore FC (2 μL per 200 μL o secondo il protocollo del produttore) e incubare le cellule per 10 minuti.
6. Centrifugare (277 x g per 5 minuti a 25 °C) e lavare le celle con 1-2 ml di tampone FACS. Aggiungere il cocktail anticorpale e incubare per 30 minuti a 4 °C al buio.
7. Dopo l'incubazione, centrifugare (277 x g per 5 minuti a 25 °C) e lavare le cellule con 1-2 mL di tampone FACS. Aggiungere 300-400 μL di soluzione di paraformaldeide al 2% e risospendere per la fissazione. Conservare le cellule in questa fase per un paio di giorni a 4 °C o analizzarle immediatamente mediante citometro a flusso multicolore.

Risultati

In questo studio, è stata studiata l'attività antitumorale della polianidride IL-1α in un modello murino singeneico di HNSCC. IL-1α ricombinante (rIL-1α) ha rallentato significativamente la crescita del tumore mEERL (Figura 1A), sebbene sia stata osservata una perdita di peso nei topi trattati, che è stata ripristinata dopo la sospensione del trattamento (Figura 1B). IL-1α-NPs non ha indotto un effetto antitumorale significativo rispetto alle NP saline o ...

Discussione

Questo protocollo consentirà a qualsiasi ricercatore di studiare l'attività antitumorale e alcuni dei meccanismi alla base dei farmaci immunomodulatori in un sistema modello di topo tumorale in vivo . Qui è stato utilizzato un modello tumorale sottocutaneo singeneico, che presenta diversi vantaggi rispetto ai modelli ortotopici, tra cui il suo protocollo tecnicamente semplice, un facile monitoraggio della crescita tumorale, una minore morbilità animale e una maggiore producibilità. I modelli tumorali sottoc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Plex 200 Systems	Bio-Rad		The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay	Bio-Rad	M60009RDPD
C57BL/6J Mice	Jakson Labs	664	4 to 6 weeks old
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific	11965092
DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	11320033
EGF	Millipore Sigma	SRP3196-500UG
Fetal Bovine Serum	Millipore Sigma	12103C-500ML
Gentamycin sulfate solution	IBI Scientific	IB02030
gentleMACS Dissociator	Miltenyi biotec
Hand-Held Magnetic Plate Washer	Thermo Fisher Scientific	EPX-55555-000
Hydrocortisone	Millipore Sigma	H6909-10ML
Insulin	Millipore Sigma	I0516-5ML
Ketamine/xylazine			Injectable anesthesia
MEERL cell line			Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells
Portable Balances	Ohaus
Scienceware Digi-Max slide caliper	Millipore Sigma	Z503576-1EA
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol)	Cardinal	COV5110.PMP
Transferrin Human	Millipore Sigma	T8158-100MG
Tri-iodothyronin	Millipore Sigma	T5516-1MG