폴리안하이드라이드 IL-1α 나노입자의 생체 내 항종양 활성 평가

요약

표준 프로토콜은 HNSCC의 동종 마우스 모델에서 IL-1α의 항종양 활성 및 관련 독성을 연구하기 위해 설명된다.

초록

사이토카인 요법은 암 환자에서 강력한 항종양 면역 반응을 일으킬 수 있는 유망한 면역요법 전략입니다. 전염증성 사이토카인 인터루킨-1 알파(IL-1α)는 여러 전임상 및 임상 연구에서 항암제로 평가되었습니다. 그러나 독감과 유사한 증상 및 저혈압을 포함한 용량 제한 독성은이 치료 전략에 대한 열정을 약화 시켰습니다. IL-1α의 폴리안하이드라이드 나노입자(NP)기반 전달은 독성 부작용을 줄이면서 전신적으로 IL-1α의 느리고 제어된 방출을 허용할 수 있기 때문에 이러한 맥락에서 효과적인 접근 방식을 나타냅니다. 여기에 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 동종 마우스 모델에서 IL-1α-로딩 폴리안하이드라이드 NPs의 항종양 활성의 분석이 설명된다. hRAS 및 루시퍼라아제(mEERL) 세포와 함께 HPV16 E6/E7을 안정적으로 발현하는 뮤린 구인두 상피 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 임의의 방향으로 3-4 mm에 도달하면 1.5% IL-1a-로딩 20:80 1,8-비스(p-카르복시페녹시)-3,6-디옥사옥탄:1,6-비스(p-카르복시페녹시)헥산(CPTEG: CPH) 나노입자 (IL-1α-NP) 제형을 마우스에 복강내 투여하였다. 종양 크기 및 체중은 종양 크기 또는 체중 감소가 안락사 기준에 도달할 때까지 연속적으로 측정하였다. 턱밑 정맥 천자에 의한 항 종양 면역 반응을 평가하기 위해 혈액 샘플을 채취하고, 염증성 사이토 카인을 사이토 카인 다중 분석을 통해 측정했다. 종양 및 사타구니 림프절을 절제하고 단세포 현탁액으로 균질화하여 다색 유세포 분석을 통해 다양한 면역 세포를 분석했습니다. 이러한 표준 방법을 통해 조사자는 암 치료를 위한 면역자극성 NP 및 기타 면역요법제의 항종양 면역 반응 및 잠재적 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

서문

암 면역 요법의 새로운 영역 중 하나는 염증성 사이토 카인을 사용하여 종양 세포에 대한 환자의 면역 체계를 활성화하는 것입니다. 몇몇 전염증성 사이토카인(즉, 인터페론-알파(IFNα), 인터루킨-2(IL-2) 및 인터루킨-1(IL-1))은 상당한 항종양 면역을 탑재할 수 있으며, 이는 사이토카인 기반 약물의 안전성뿐만 아니라 항종양 특성을 탐구하는 데 관심을 불러일으켰습니다. 인터루킨-1 알파(IL-1α)는 특히, 염증¹의 마스터 사이토카인으로 알려진 전염증성 사이토카인이다. 1970년대 후반에 이러한 사이토카인이 발견된 이래, 항암제뿐만 아니라 항암제로서 화학요법의 부작용을 치료하는 조혈제로 연구되어^왔다2. 1980년대 후반에는 IL-1α ^3,4,5,6의 항암 효과를 확인하기 위해 여러 전임상 및 임상 연구가 수행되었습니다. 이 연구는 흑색 종, 신장 세포 암종 및 난소 암종에 대한 재조합 IL-1α (rIL-1α)의 유망한 항 종양 활성을 발견했습니다. 그러나 발열, 메스꺼움, 구토, 독감 유사 증상 및 가장 심각한 용량 제한 저혈압을 포함한 독성이 일반적으로 관찰되었습니다. 불행히도, 이러한 용량 관련 독성은 rIL-1α의 추가 임상 사용에 대한 열정을 약화시켰다.

IL-1α 매개 독성의 중요한 문제를 해결하기 위해 표면 침식 동역학에 의한 IL-1α의 제어 방출을 허용하는 폴리안하이드라이드 나노입자(NP) 제형을 조사합니다. 이러한 NP 제형은 용량 제한 부작용을 줄이면서 IL-1α의 항종양 특성의 이점을 얻기 위한^{것입니다7.} 폴리안하이드라이드는 표면 침식을 통해 분해되어 캡슐화된 제제 8,9,10,11,12의 거의 0차 방출을 초래하는 FDA 승인 폴리머입니다. 1,8-비스-(p-카르복시페녹시)-3,6-디옥사옥탄(CPTEG) 및 1,6-비스-(p-카르복시페녹시)헥산(CPH)을 함유하는 양친매성 폴리안하이드라이드 공중합체는 종양학 및 면역학 기반 연구 ^8,12에서 다양한 페이로드에 대한 우수한 전달 시스템으로 보고되었습니다. 다음 프로토콜 20:80 CPTEG:CPH NP에는 1.5중량% rIL-1α(IL-1α-NP)가 로딩되어 HNSCC의 마우스 모델에서 이 사이토카인의 항종양 활성 및 독성을 연구하는 데 사용됩니다.

다음 절차의 전반적인 목표는 HNSCC에서 IL-1α-NP의 항 종양 활성을 평가하는 것입니다. 종양 성장 및 생존 평가를 포함하여, 기술된 절차는 임의의 관심있는 면역-조절제에 적용될 수 있다. 이러한 절차는 임상적 관련성을 최대화하기 위해 온전한 면역계⁽¹³ )를 갖는 동종 마우스 모델에서 수행되어야 한다. IL-1α-NP 독성은 또한 전염증성 사이토카인의 순환 수준 및 동물 체중의 변화를 측정함으로써 평가될 것이다. 생체 내 약물 독성을 결정하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 그러나 가장 널리 사용되는 방법은 장기 독성 및 해당 기관의 조직 학적 변화에 대한 혈청 효소의 측정을 포함합니다. 그러나 조직 학적 분석을 수행하려면 동물을 희생해야하며 이는 실험의 생존 곡선에 영향을 미칩니다. 따라서, 이 프로토콜은 혈청 샘플에서 사이토카인의 측정을 위해 살아있는 마우스로부터 혈액을 수집하기 위한 프로토콜을 포함할 것이다. 수집된 혈청은 장기 독성에 대한 임의의 원하는 혈청 분석물의 측정에 사용될 수 있다. 다색 유세포 분석은 종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 변화와 림프절로의 면역 세포 이동을 이해하는 데 사용됩니다. 면역조직화학 및/또는 보존된 섹션¹⁴의 면역형광을 포함하는 면역 세포를 확인하기 위해 다른 방법이 활용될 수 있다. 그러나 이러한 기술은 많은 수의 동물에서 수행하는 데 시간이 많이 걸리고 지루할 수 있습니다. 전반적으로, 다음 방법을 통해 조사자는 암 치료를위한 항 종양 면역 반응 및 면역 자극제의 잠재적 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구에 사용 된 모든 생체 내 절차는 아이오와 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. HNSCC 세포주의 제조 및 유지

참고: 이 연구에서는 hRas 및 루시페라아제(mEERL)와 함께 HPV E6 및 E7로 안정적으로 형질전환된 쥐 구인두 상피 세포주를 사용합니다. 이 세포주는 C57BL/6J 마우스 균주에서 개발되었으며 Paola D. Vermeer 박사(미국 사우스다코타주 사우스다코타주 사우스다코타 대학교 샌포드 의과대학 외과)의 선물이었습니다.

1. 예열 된 (37 ° C) 수조에서 mEERL 세포의 냉동 바이알을 해동 한 다음 따뜻한 배양 배지 (40.5 % 1 : 1 DMEM / Hams F12, 10 % 태아 소 혈청 [FBS], 0.1 % 겐타 마이신, 0.005 % 하이드로 코르티손, 0.05 % 트랜스페린, 0.05 % 인슐린, 0.0014 % 트리 요오드 티로닌 및 0.005 % 표피 성장 인자).
2. 원뿔형 튜브를 277 x g 에서 25°C에서 5분 동안 원심분리하여 매체를 제거합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 3-5mL의 새 배지에 재현탁하고 T-25 세포 배양 플라스크로 옮깁니다. 냉동 보관에서 최적의 회수를 위해 세포를 고밀도로 플레이트하십시오.
   참고: T-25 플라스크는 크기가 작기 때문에 사용되었으며, T-75 플라스크에 비해 세포가 가까이 있을 때 냉동 보관에서 회수 시간이 더 빠릅니다.
3. 세포를 37°C 및 5%_CO2의 가습 인큐베이터에서 성장시키고, 더 큰 플라스크(즉, T-75 또는 T-150)로 확장시키고, 3일마다 계대배양한다. 모든 마우스에 원하는 이식을 하기에 충분한 세포가 있을 때, 플라스크를 제거하고, 배지를 버리고, 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 헹굽니다. 그런 다음 0.25% 트립신-EDTA 4mL(T150 플라스크를 사용하는 경우)를 추가하고 37°C에서 2분 동안 배양합니다. 사용되는 접시/플라스크 크기에 따라 트립신의 양을 늘리거나 줄입니다.
   참고: 세포주의 유형과 합류 정도는 트립신 화 시간에 영향을 미칠 수 있습니다. 긴 트립신 화 기간은 세포를 손상시켜 생존력을 낮출 수 있습니다. 트립신 화에 필요한 최소 시간을 사용하십시오.
4. 현미경으로 트립신 화시 분리 된 세포는 자유롭게 움직입니다. 일부 세포가 여전히 부착되어 있으면 플라스크를 매우 부드럽게 두드려 나머지 부착 세포를 동원합니다. 새로운 배지(원하는 만큼 배지의 양을 조정)를 추가하여 트립신 반응을 중지하고 50mL 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다. 25°C에서 5분 동안 277 x g 으로 원심분리하여 배지를 제거하였다.
5. 세포를 새로운 배지에 재현탁하고 세포를 세십시오. 한 번 더 원심분리하고(위에서 설명한 대로) 차가운 PBS를 세포에 첨가하여 최종 농도를 10 ×^{10 6} cells/mL로 만듭니다. 마우스에 주사하기 전에 세포 현탁액을 얼음에 보관하십시오.

2. 종양 이식, 약물 치료 및 측정

참고: 실험 동물은 아이오와 대학의 동물 관리 시설에 보관되었으며 적절한 무균 절차에 따라 처리했습니다.

1. C57Bl/6J 마우스를 케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg) 혼합물로 마취합니다. 전기 면도기로 측면 부위 또는 원하는 주사 부위를 조심스럽게 면도하십시오.
   알림: 기관(또는 기타) 규칙 및 규정에서 요구하는 규제 물질의 사용을 문서화하는 것을 잊지 마십시오.
2. 에탄올 패드로 옆구리 부위를 소독하고 25-28G 주사기를 사용하여 세포 현탁액 100μL (1 x 10⁶ 세포 포함)를 피하 주사합니다. 갑작스런 움직임과 세포 손실을 방지하기 위해 주사 전에 마우스를 마취하십시오. 각 주사 전에 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하여 세포가 바이알 또는 원추형 튜브의 바닥에 침전되는 것을 방지합니다.
3. 세포 현탁액을 주사기에 넣은 후 상단에서 모든 거품과 죽은 공간을 제거하십시오. 세포 현탁액을 천천히 그리고 꾸준한 방식으로 주입하십시오. 여러 마우스에 동일한 바늘을 사용하지 마십시오. 우발적 인 손실을 설명하기 위해 항상 여분의 세포 현탁액을 만드십시오.
4. 동물을 각각의 새장에 넣고 마취에서 회복 될 때까지 모니터링하십시오. 마취 중에 동물은 저체온증의 위험이 있습니다. 따라서 추가 열을 제공하거나 마우스를 서로 가깝게 배치하여 따뜻하게 유지하십시오 (동일한 케이지에있는 경우).
5. 종양이 임의의 방향으로 3mm에 도달하면 치료 그룹에서 마우스를 무작위 배정 (종양 크기 및 / 또는 무게에 따라) 약물 치료를 시작하십시오. 마우스를 4일 및 9일에 3.75μg rIL-1α/마우스를 함유하는 NP¹⁵ 를 복강내(i.p.)로 주사한다. 종양 부피((길이 x 폭 2)/²) 및 마우스 체중을 측정하고 종양 크기 또는 마우스가 안락사 기준에 도달할 때까지 매일 또는 격일로 기록한다.
   참고: 숙련된 연구원이 있더라도 모든 마우스에 동일한 크기의 종양을 이식하는 것은 어렵습니다. 동물을 종양 크기와 마우스 무게에 따라 실험 그룹으로 무작위 배정합니다.

3. 채혈 및 혈청 분리

알림: 턱밑 정맥에서 혈액 수집은 의식이있는 동물이나 마취중인 동물의 혈액 수집을 허용하는 쉽고 효과적인 기술입니다. 이 연구를 위해, 동물들이 마취 상태에있을 때 혈액을 채취 하였다.

1. 위에서 언급한 케타민/자일라진 혼합물을 주사하여 마우스를 마취합니다.
2. 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 어깨 너머의 느슨한 피부를 잡고 하악 (해당 부위의 흰색 점) 약간 뒤에있는 18G 바늘 또는 란셋으로 턱밑 정맥을 뚫습니다.
3. 즉시 혈류를 보장하기 위해 정맥에 구멍을 뚫습니다. 200-300 μL의 혈액(마우스 무게에 따라 다름)을 1.5mL 폴리프로필렌 미세 원심분리 튜브 또는 혈청 분리기 튜브에 수집합니다. 채혈 후 출혈이 멈출 때까지 천자 부위에 부드러운 압력을가하십시오. 마우스를 각각의 케이지로 되돌리고 마취에서 회복 될 때까지 관찰하십시오.
   참고: 한 번의 수집으로 또는 24시간 동안 마우스 체중의 1% 이상을 수집하지 마십시오.
4. 수집 된 혈전을 실온에서 20-30 분 동안 방치하십시오. 원심 분리 할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
5. 응고된 혈액을 1540 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
6. 적혈구를 방해하지 않고 상층 (혈청)을 수집하십시오. 사용할 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오.

4. 채취한 혈청의 증식

1. 혈청 또는 혈장 샘플을 얼음 위에 보관하면서 해동하십시오.
2. 샘플을 1540 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 침전시키고 상단에서 혈청 층을 조심스럽게 수집합니다.
3. 멀티플렉스 키트를 실온에서 꺼냅니다.
   참고: 특정 사이토카인, 케모카인 또는 성장 인자를 위해 설계된 상업적으로 이용 가능한 멀티플렉스 키트가 여러 개 있습니다. 또한 관심 단백질을 기반으로 키트를 사용자 정의 할 수 있습니다.
4. 사이토카인을 검출하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 분석을 수행합니다.
   참고: 대부분의 멀티플렉스 키트는 포획된 항체에 결합하기 위해 마그네틱 비드를 사용합니다. 따라서 세탁하는 동안 자동 또는 휴대용 마그네틱 와셔를 사용하는 것이 필수적입니다. 그렇지 않으면 자기 구슬이 플레이트에서 씻겨 나가고 판독하기에 충분한 이벤트가 없습니다.

5. 종양 및 사타구니 림프절의 수집 및 단세포 현탁액의 제조

1. 케타민/자일라진 혼합물로 마우스를 마취합니다. 완전한 진정을 보장하려면 페달 반사 (단단한 발가락 핀치)를 사용하십시오. 마우스가 반응하지 않으면 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킵니다.
2. 각 마우스를 등 뒤로 놓고 복부 피부에 70 % 에탄올을 뿌립니다. 집게와 가위를 사용하여 마우스의 왼쪽에서 종양을 잘라내고 오른쪽에서 림프절을 잘라냅니다. 종양이 크면 작은 조각으로 자르고 조직 500-600mg을 섭취하십시오. 림프절의 경우 전체 장기를 수집하십시오.
   참고: 사타구니 부위의 양쪽에 두 개의 림프절이 있습니다. 실험 목표에 따라 림프절과 종양을 같은면에서 분리 할 수 있습니다. 그러나 종양이 매우 커지면 같은쪽에서 림프절을 모으기가 쉽지 않습니다.
3. 3-5mL의 RPMI 배지가 들어 있는 각각의 해리 튜브에 조직을 놓습니다. 자동 해리기를 사용하여 조직을 균질화합니다.
   알림: 다른 자동 또는 휴대용 균질화를 사용할 수 있습니다.
4. 균질화 후 세포 현탁액을 70μm 필터를 통해 50mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 25°C에서 5분 동안 277 x g 으로 원심분리하여 배지를 제거하였다. 세포를 세척하고 1-2mL의 차가운 PBS에 재현탁시킵니다.

6. 단세포 현탁액의 FACS 염색

1. 0.4% 트리판 블루 염색을 사용하여 혈구분석기에서 생존 세포를 계수합니다. 2-3 백만 개의 세포를 얻는 데 필요한 부피를 계산하여 각 FACS 튜브로 옮깁니다.
2. 생존 염료를 사용하여 살아있는 세포를 게이트하십시오. 그렇지 않으면, 항체와 죽은 세포의 비특이적 결합이 발생하여 위양성 결과를 얻을 수 있습니다.
   참고: 좀비 염료는 이 실험에서 살아있는 세포 및 죽은 세포 염색에 사용되었습니다. 몇몇 고정 가능한 및 비고정 가능한 염료(예를 들어, 프로피듐 요오드화물)가 상업적으로 입수가능하다.
3. 계수된 세포를 원심분리(25°C에서 5분 동안 277 x g )하였다. 상청액을 따라 내고 세포를 300 μL의 PBS에 재현탁시킨다. 0.5-1 μL의 좀비 염료/튜브를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
4. 원심분리(25°C에서 5분 동안 277 x g )하고 세포를 1-2mL의 FACS 완충액으로 세척하고 200μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다.
5. Fc 수용체 차단제 (200 μL 당 또는 제조업체의 프로토콜에 따라 2 μL)를 추가하고 세포를 10 분 동안 배양합니다.
6. 원심분리(25°C에서 5분 동안 277 x g )하고 세포를 1-2 mL의 FACS 완충액으로 세척한다. 항체 칵테일을 첨가하고 암실에서 4°C에서 30분 동안 인큐베이션합니다.
7. 인큐베이션 후, 원심분리(25°C에서 5분 동안 277 x g )하고, 세포를 1-2 mL FACS 완충액으로 세척한다. 300-400 μL의 2 % 파라 포름 알데히드 용액을 추가하고 고정을 위해 다시 현탁하십시오. 이 단계에서 세포를 4°C에서 며칠 동안 보관하거나 다색 유세포분석기로 즉시 분석합니다.

결과

본 연구에서는 HNSCC의 동종 마우스 모델에서 폴리안하이드라이드 IL-1α의 항종양 활성을 조사하였다. 재조합 IL-1α (rIL-1α)는 mEERL 종양 성장을 상당히 늦추었지만 (그림 1A), 처리 된 마우스에서 체중 감소가 관찰되었지만 처리 중단 후 회복되었습니다 (그림 1B). IL-1α-NP는 식염수 또는 블랭크-NP에 비해 유의한 항종양 효과를 유도하지 않았으며(그림

토론

이 프로토콜은 모든 연구자가 생체 내 종양 마우스 모델 시스템에서 항종양 활성 및 면역조절 약물의 기본 메커니즘 중 일부를 연구할 수 있도록 합니다. 여기에서는 동종 피하 종양 모델이 사용되었으며, 이는 기술적으로 간단한 프로토콜, 종양 성장의 쉬운 모니터링, 적은 동물 이환율 및 더 높은 생산 가능성을 포함하여 동종 모델에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 피하 종양 모델은 또한...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Plex 200 Systems	Bio-Rad		The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay	Bio-Rad	M60009RDPD
C57BL/6J Mice	Jakson Labs	664	4 to 6 weeks old
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific	11965092
DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	11320033
EGF	Millipore Sigma	SRP3196-500UG
Fetal Bovine Serum	Millipore Sigma	12103C-500ML
Gentamycin sulfate solution	IBI Scientific	IB02030
gentleMACS Dissociator	Miltenyi biotec
Hand-Held Magnetic Plate Washer	Thermo Fisher Scientific	EPX-55555-000
Hydrocortisone	Millipore Sigma	H6909-10ML
Insulin	Millipore Sigma	I0516-5ML
Ketamine/xylazine			Injectable anesthesia
MEERL cell line			Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells
Portable Balances	Ohaus
Scienceware Digi-Max slide caliper	Millipore Sigma	Z503576-1EA
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol)	Cardinal	COV5110.PMP
Transferrin Human	Millipore Sigma	T8158-100MG
Tri-iodothyronin	Millipore Sigma	T5516-1MG