Оценка противоопухолевой активности полиангидридных наночастиц IL-1α in vivo

Резюме

Описан стандартный протокол для изучения противоопухолевой активности и связанной с ней токсичности IL-1α в сингенной мышиной модели HNSCC.

Аннотация

Цитокиновая терапия является многообещающей иммунотерапевтической стратегией, которая может вызывать надежные противоопухолевые иммунные реакции у больных раком. Провоспалительный цитокин интерлейкин-1 альфа (IL-1α) был оценен как противоопухолевое средство в нескольких доклинических и клинических исследованиях. Тем не менее, токсичность, ограничивающая дозу, включая гриппоподобные симптомы и гипотонию, ослабила энтузиазм в отношении этой терапевтической стратегии. Доставка IL-1α на основе полиангидридных наночастиц (NP) представляет собой эффективный подход в этом контексте, поскольку это может обеспечить медленное и контролируемое высвобождение IL-1α системно при одновременном снижении токсичных побочных эффектов. Здесь описан анализ противоопухолевой активности IL-1α-нагруженных полиангидридных НПз в модели сингенной мыши с плоскоклеточным раком головы и шеи (HNSCC). Мышиные ротоглоточные эпителиальные клетки, стабильно экспрессирующие HPV16 E6/E7 вместе с клетками hRAS и люциферазы (mEERL), вводили подкожно в правый фланг мышей C57BL/6J. Как только опухоли достигали 3-4 мм в любом направлении, 1,5% IL-1a - нагруженный 20:80 1,8-бис(p-карбоксифенокси)-3,6-диоксаоктан:1,6-бис(p-карбоксифенокси)гексан (CPTEG:CPH) препарат наночастиц (IL-1α-NP) вводили мышам внутрибрюшинно. Размер опухоли и масса тела непрерывно измерялись до тех пор, пока размер опухоли или потеря веса не достигли критериев эвтаназии. Образцы крови были взяты для оценки противоопухолевых иммунных реакций с помощью подчелюстной венипунктуры, а воспалительные цитокины были измерены с помощью мультиплексных анализов цитокинов. Опухолевые и паховые лимфатические узлы были резецированы и гомогенизированы в одноклеточную суспензию для анализа различных иммунных клеток с помощью многоцветной проточной цитометрии. Эти стандартные методы позволят исследователям изучить противоопухолевый иммунный ответ и потенциальный механизм иммуностимулирующих НП и других иммунотерапевтических агентов для лечения рака.

Введение

Одной из новых областей иммунотерапии рака является использование воспалительных цитокинов для активации иммунной системы пациентов против их опухолевых клеток. Некоторые провоспалительные цитокины (т.е. интерферон-альфа (IFNα), интерлейкин-2 (IL-2) и интерлейкин-1 (IL-1)) могут вызывать значительный противоопухолевый иммунитет, что вызвало интерес к изучению противоопухолевых свойств, а также безопасности препаратов на основе цитокинов. Интерлейкин-1 альфа (IL-1α), в частности, является провоспалительным цитокином, известным как главный цитокин воспаления¹. С момента открытия этого цитокина в конце 1970-х годов он был исследован в качестве противоопухолевого агента, а также кроветворного препарата для лечения негативных последствий химиотерапии². В конце 1980-х годов было проведено несколько доклинических и клинических исследований для определения противоопухолевых эффектов IL-1α 3,4,5,6. Эти исследования обнаружили многообещающую противоопухолевую активность рекомбинантного IL-1α (rIL-1α) в отношении меланомы, почечно-клеточной карциномы и карциномы яичников. Тем не менее, обычно наблюдались токсичности, включая лихорадку, тошноту, рвоту, гриппоподобные симптомы и наиболее серьезную гипотензию, ограничивающую дозу. К сожалению, эти токсичности, связанные с дозой, ослабили энтузиазм в отношении дальнейшего клинического использования rIL-1α.

Чтобы попытаться решить критическую проблему токсичности, опосредованной IL-1α, будут исследованы составы полиангидридных наночастиц (NP), которые допускают контролируемое высвобождение IL-1α кинетикой поверхностной эрозии. Эти NP-препараты предназначены для получения преимуществ противоопухолевых свойств IL-1α при одновременном снижении дозоограничивающих побочных эффектов⁷. Полиангидриды являются одобренными FDA полимерами, которые разлагаются в результате поверхностной эрозии, что приводит к почти нулевому высвобождению инкапсулированных агентов ^8,9,10,11,12. Сообщалось, что амфифильные полиангидридные сополимеры, содержащие 1,8-бис-(p-карбоксифенокси)-3,6-диоксаоктан (CPTEG) и 1,6-бис-(p-карбоксифенокси)гексан (CPH), являются отличными системами доставки для различных полезных нагрузок в онкологических и иммунологических исследованиях ^8,12. В следующем протоколе 20:80 CPTEG:CPH NPs, загруженные 1,5 мас.% rIL-1α (IL-1α-NPs), будут использоваться для изучения противоопухолевой активности и токсичности этого цитокина в мышиной модели HNSCC.

Общей целью следующих процедур является оценка противоопухолевой активности IL-1α-NPs на HNSCCs. Описанные процедуры, включая оценку роста и выживаемости опухоли, могут быть применены к любому иммуномодуляторному агенту, представляющему интерес. Эти процедуры должны выполняться на сингенной мышиной модели с интактной иммунной системой¹³ , чтобы максимизировать клиническую значимость. Токсичность IL-1α-NP также будет оцениваться путем измерения изменений в циркулирующих уровнях провоспалительных цитокинов и массе животных. Существует множество методов определения токсичности препарата in vivo ; однако наиболее широко используемые методы включают измерение сывороточных ферментов для токсичности органов и гистологических изменений в этих органах. Однако для выполнения гистологического анализа животное нужно принести в жертву, что повлияет на кривые выживаемости эксперимента. Поэтому этот протокол будет включать протокол сбора крови у живых мышей для измерения цитокинов в образцах сыворотки. Собранная сыворотка может быть использована для измерения любых желаемых сывороточных аналитов на токсичность для органов. Многоцветная проточная цитометрия будет использоваться для понимания изменений в популяции иммунных клеток в микроокружении опухоли и миграции иммунных клеток в лимфатический узел. Другие способы могут быть использованы для идентификации иммунных клеток, включая иммуногистохимию и/или иммунофлуоресценцию сохраненных участков¹⁴. Тем не менее, эти методы могут быть трудоемкими и утомительными для выполнения на большом количестве животных. В целом, следующие методы позволят исследователям изучить противоопухолевый иммунный ответ и потенциальные механизмы иммуностимулирующих агентов для лечения рака.

протокол

Все процедуры in vivo , используемые в этом исследовании, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Айовы.

1. Подготовка и обслуживание клеточной линии HNSCC

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании будет использоваться линия мышиных орофарингеальных эпителиальных клеток, стабильно трансформированная ВПЧ E6 и E7 вместе с hRas и люциферазой (mEERL). Эта клеточная линия была разработана из мышиного штамма C57BL / 6J и была подарком от доктора Паолы Д. Вермеер (отделение хирургии, Медицинская школа Сэнфорда Университета Южной Дакоты, Южная Дакота, США).

1. Разморозьте замороженный флакон клеток mEERL на предварительно нагретой (37 °C) водяной бане, а затем перенесите в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую теплую культуральную среду (модифицированная орлиная среда Dulbecco [DMEM], дополненная 40,5% 1:1 DMEM / Hams F12, 10% фетальной бычьей сывороткой [FBS], 0,1% гентамицином, 0,005% гидрокортизоном, 0,05% трансферрином, 0,05% инсулина, 0,0014% трийодтиронином и 0,005% эпидермальным фактором роста).
2. Центрифугируйте коническую трубку при 277 х г в течение 5 мин при 25 °C для удаления среды. Затем повторно суспендируют клеточную гранулу в свежей среде объемом 3-5 мл и переложат ее в колбу для культивирования клеток Т-25. Для оптимального извлечения из замороженного хранилища пластинчатые ячейки высокой плотности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Колбы T-25 были использованы из-за их меньшего размера, что приводит к более быстрому времени восстановления из замороженного хранилища, когда ячейки находятся в непосредственной близости по сравнению с колбами T-75.
3. Пусть клетки растут в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂, расширяются до более крупных колб (т. Е. T-75 или T-150) и проходят каждые 3 дня. Когда будет достаточно клеток для желаемой имплантации всем мышам, удалите колбы, выбросьте среду и осторожно промойте клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS). Затем добавляют 4 мл (при использовании колб T150) 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируют при 37 °C в течение 2 мин. Масштабируйте количество трипсина вверх или вниз в зависимости от размера используемого блюда / колбы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тип клеточной линии и степень слияния могут влиять на время трипсинизации. Длительные периоды трипсинизации могут повредить клетки, что приводит к низкой жизнеспособности. Используйте минимальное количество времени, необходимое для трипсинизации.
4. Под микроскопом отслоившиеся клетки при трипсинизации движутся свободно. Если некоторые клетки все еще прикреплены, очень осторожно постучите по колбе, чтобы мобилизовать оставшиеся адгезивные клетки. Добавьте свежую среду (масштабное количество среды по желанию), чтобы остановить реакцию трипсина и собрать клеточную суспензию в конические пробирки по 50 мл. Центрифуга при 277 х г в течение 5 мин при 25 °C для удаления среды.
5. Повторно суспендируйте клетки в свежих средах и подсчитайте клетки. Центрифугу еще раз (как описано выше), а затем добавьте холодный PBS к клеткам, чтобы получить конечную концентрацию 10 × 10⁶ клеток / мл. Держите клеточную суспензию (суспензии) на льду перед инъекцией мышам.

2. Имплантация опухоли, медикаментозное лечение и измерение

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные животные содержались в Учреждении по уходу за животными в Университете Айовы и следовали соответствующим асептическим процедурам для обращения с ними.

1. Обезболивайте мышей C57Bl/6J смесью кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Тщательно сбрите область бока или нужное место инъекции электрической бритвой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте документировать использование контролируемых веществ в соответствии с требованиями институциональных (или других) правил и положений.
2. Продезинфицируйте область бока с помощью этаноловой прокладки и медленно вводят 100 мкл (содержащих 1 х 10⁶ клеток) клеточной суспензии подкожно с помощью шприца 25-28 Г. Обезболивайте мышей перед инъекцией, чтобы предотвратить резкие движения и потерю клеток. Перед каждой инъекцией осторожно перемешайте клеточную суспензию, чтобы клетки не осели на дно флакона или конической трубки.
3. Взяв клеточную суспензию в шприц, удалите все пузырьки и мертвое пространство сверху. Вводите клеточную суспензию медленно и устойчиво. Не используйте одну и ту же иглу на нескольких мышах. Всегда делайте дополнительные клеточные суспензии, чтобы учесть случайную потерю.
4. Поместите животное в соответствующие клетки и следите за ними, пока они не восстановятся после анестезии. Во время анестезии животные подвергаются риску переохлаждения; поэтому обеспечьте дополнительное тепло или поместите мышей близко друг к другу, чтобы согреться (если они размещены в одной клетке).
5. Когда опухоли достигают 3 мм в любом направлении, рандомизируйте мышей (по размеру опухоли и / или весу) в группы лечения, а затем начните лечение препаратом. Вводите мышам внутрибрюшинно (т..) NP¹⁵ , содержащие 3,75 мкг rIL-1α/мышь на 4 и 9 день. Измеряйте и регистрируйте объем опухоли (длина х ширина²) / 2) и вес мыши ежедневно или через день, пока размер опухоли или мыши не достигнут критериев эвтаназии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Даже с опытным исследователем трудно имплантировать опухоль одинакового размера всем мышам. Рандомизируйте животных в экспериментальные группы на основе размера опухоли и веса мыши.

3. Забор крови и отделение сыворотки крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Забор крови из подчелюстной вены является простым и эффективным методом, который позволяет собирать кровь у сознательных животных или животных под наркозом. Для этого исследования кровь была собрана у животных, когда они находились под наркозом.

1. Обезболивайте мышей инъекцией смеси кетамин/ксилазин, как упоминалось выше.
2. Захватите дряблую кожу через плечо недоминирующей рукой и проколите подчелюстную вену иглой или ланцетом весом 18 Г, немного позади нижней челюсти (белое пятно в этой области).
3. Проколите вену, чтобы обеспечить немедленный кровоток. Соберите 200-300 мкл крови (в зависимости от веса мыши) в 1,5 мл полипропиленовой микроцентрифужной трубки или сывороточной сепараторной трубки. После забора крови нанесите мягкое давление на место прокола до тех пор, пока кровотечение не прекратится. Верните мышей в соответствующие клетки и наблюдайте, пока они не оправится от анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не собирайте более 1% от массы тела мыши в одном наборе или в течение 24 часов.
4. Дайте собранному сгустку крови при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Поместите трубки на лед до тех пор, пока они не будут готовы к центрифугированию.
5. Центрифугировать свернувшуюся кровь при 1540 х г в течение 15 мин при 4 °С.
6. Соберите верхний слой (сыворотку), не нарушая эритроциты. Хранить при температуре -80 °C до использования.

4. Мультиплексирование собранной сыворотки

1. Разморозьте образцы сыворотки или плазмы, удерживая их на льду.
2. Центрифугируйте образцы при 1540 х г в течение 5 мин при 4 °C для осаждения любого клеточного мусора и тщательно соберите слой сыворотки сверху.
3. Вытащите комплект мультиплекса при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько коммерчески доступных мультиплексных наборов, которые предназначены для конкретных цитокинов, хемокинов или факторов роста. Также есть возможность настроить комплект на основе интересующего белка.
4. Выполните анализ в соответствии с протоколом производителя для обнаружения цитокинов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство мультиплексных наборов используют магнитные шарики для связывания захваченного антитела. Таким образом, важно использовать автоматизированную или ручную магнитную шайбу во время стирки. В противном случае магнитные бусины смоются с пластины, и не хватит событий, чтобы взять показания.

5. Сбор опухоли и пахового лимфатического узла и получение одноклеточной суспензии

1. Обезболивайте мышей смесью кетамин/ксилазин. Чтобы обеспечить полную седацию, используйте педальный рефлекс (твердое защемление пальца ноги). Если мыши не реагируют, усыпьте мышей по вывиху шейки матки.
2. Положите каждую мышь на спину и распылите 70% этанола на кожу брюшной области. Используйте щипцы и ножницы, чтобы вырезать опухоль с левой стороны мышей и лимфатический узел с правой стороны. Если опухоль большая, разрезают на мелкие кусочки и берут 500-600 мг ткани. Для лимфатического узла соберите весь орган.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Есть два лимфатических узла по обе стороны паховой области. В зависимости от целей эксперимента лимфатический узел и опухоль могут быть выделены с одной стороны. Однако если опухоль станет очень большой, собрать лимфатический узел с той же стороны будет непросто.
3. Поместите ткани на соответствующие трубки диссоциатора, содержащие 3-5 мл среды RPMI. Гомогенизируйте ткань с помощью автоматизированного диссоциатора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другие автоматизированные или портативные гомогенизаторы.
4. После гомогенизации перенесите клеточную суспензию через фильтр 70 мкм в коническую трубку объемом 50 мл. Центрифуга при 277 х г в течение 5 мин при 25 °C для удаления среды. Промыть и повторно суспендировать клетки в 1-2 мл холодного ПБС.

6. Окрашивание FACS одноэлементной суспензии

1. Используйте 0,4% трипан синего окрашивания для подсчета жизнеспособных клеток в гемоцитометре. Рассчитайте объем, необходимый для получения 2-3 миллионов клеток и перенесите их в соответствующую трубку FACS.
2. Используйте краситель жизнеспособности для защиты живых клеток; в противном случае может произойти неспецифическое связывание антитела с мертвыми клетками, что может дать ложноположительный результат.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель зомби использовался для окрашивания живых и мертвых клеток в этом эксперименте. Несколько поправляемых и непоправимых красителей (например, йодид пропидия) являются коммерчески доступными.
3. Центрифуга (277 х г в течение 5 мин при 25 °С) подсчитывает ячейки. Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 300 мкл PBS. Добавьте 0,5-1 мкл зомби-красителя/тюбика. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 мин в темноте.
4. Центрифуга (277 х г в течение 5 мин при 25 °C) и промыть ячейки 1-2 мл буфера FACS и повторно суспендировать их в 200 мкл буфера FACS.
5. Добавляют блокатор Fc-рецепторов (2 мкл на 200 мкл или по протоколу производителя) и инкубируют клетки в течение 10 мин.
6. Центрифуга (277 х г в течение 5 мин при 25 °C) и промыть ячейки 1-2 мл буфера FACS. Добавьте коктейль антител и инкубируйте в течение 30 мин при 4 °C в темноте.
7. После инкубации центрифугируют (277 х г в течение 5 мин при 25 °C) и промывают клетки буфером FACS 1-2 мл. Добавляют 300-400 мкл 2% раствора параформальдегида и повторно суспендируют для фиксации. Храните клетки на этом этапе в течение нескольких дней при 4 °C или анализируйте сразу многоцветным проточным цитометром.

Результаты

В этом исследовании исследовали противоопухолевую активность полиангидрида IL-1α в сингенной мышиной модели HNSCC. Рекомбинантный IL-1α (rIL-1α) значительно замедлял рост опухоли mEERL (рисунок 1A), хотя у обработанных мышей наблюдалась потеря веса, которая восстанавливалась посл...

Обсуждение

Этот протокол позволит любому исследователю изучить противоопухолевую активность и некоторые из основных механизмов иммуномодулирующих препаратов в модельной системе опухоли in vivo . Здесь была использована модель сингенной подкожной опухоли, которая имеет несколько преимущест?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Plex 200 Systems	Bio-Rad		The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay	Bio-Rad	M60009RDPD
C57BL/6J Mice	Jakson Labs	664	4 to 6 weeks old
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific	11965092
DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	11320033
EGF	Millipore Sigma	SRP3196-500UG
Fetal Bovine Serum	Millipore Sigma	12103C-500ML
Gentamycin sulfate solution	IBI Scientific	IB02030
gentleMACS Dissociator	Miltenyi biotec
Hand-Held Magnetic Plate Washer	Thermo Fisher Scientific	EPX-55555-000
Hydrocortisone	Millipore Sigma	H6909-10ML
Insulin	Millipore Sigma	I0516-5ML
Ketamine/xylazine			Injectable anesthesia
MEERL cell line			Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells
Portable Balances	Ohaus
Scienceware Digi-Max slide caliper	Millipore Sigma	Z503576-1EA
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol)	Cardinal	COV5110.PMP
Transferrin Human	Millipore Sigma	T8158-100MG
Tri-iodothyronin	Millipore Sigma	T5516-1MG