İnsan Hücrelerinde Endojen Fosforile STAT Proteinlerinin Ölçümü için Zaman Çözülmüş Förster Rezonans Enerji Transfer Testleri

Özet

Zaman çözümlü Förster rezonans enerji transfer hücresi tabanlı tahlil protokolleri, endojen fosforile sinyal dönüştürücüsünün ve transkripsiyon aktivatörü (STAT) 1/3/4/5/6 proteinlerinin 384 kuyucuklu bir formatta basit, spesifik, hassas ve sağlam bir şekilde ölçülmesi için tanımlanmıştır.

Özet

Janus kinaz (JAK) / sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü (STAT) sinyal yolu, sitokinlere ve büyüme faktörlerine hücresel yanıtlara aracılık etmede çok önemli bir rol oynar. STAT proteinleri, esas olarak JAK'ların aracılık ettiği tirozin fosforilasyonu ile aktive edilir. STAT sinyal yolaklarının anormal aktivasyonu, birçok insan hastalığında, özellikle kanser ve bağışıklık ile ilgili koşullarda rol oynar. Bu nedenle, doğal hücre sinyal ortamında STAT protein fosforilasyonunu izleme yeteneği hem akademik hem de ilaç keşif araştırmaları için önemlidir. Fosforile STAT proteinlerini ölçmek için mevcut geleneksel tahlil formatları arasında batı lekelenmesi ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) bulunur. Bu heterojen yöntemler emek yoğun, düşük verimlidir ve batı lekelenmesi durumunda genellikle güvenilir (spesifik) değildir. Homojen (yıkamasız) yöntemler mevcuttur ancak pahalı olmaya devam etmektedir.

Burada, fosforile edilmiş STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) ve STAT6'nın (Y641) endojen seviyelerinin 384 kuyucuklu bir formatında, yeni THUNDER zaman çözümlü Förster rezonans enerji transferi (TR-FRET) platformu kullanılarak yapışkan veya süspansiyon hücrelerinden hücre lizatlarında hassas, sağlam ve uygun maliyetli ölçüm için ayrıntılı protokoller sağlanmaktadır. Hücresel tahlil için iş akışı basit, hızlı ve yüksek verimli tarama (HTS) için tasarlanmıştır. Tahlil protokolü esnektir, düşük hacimli bir numune (15 μL) kullanır, yalnızca bir reaktif ekleme adımı gerektirir ve düşük verimli ve yüksek verimli uygulamalara uyarlanabilir. Her fosfo-STAT sandviç immünoassay, bilinen agonistler ve inhibitörler ile optimize edilmiş koşullar altında doğrulanır ve beklenen farmakoloji ve Z'-faktör değerlerini üretir. TR-FRET testleri orantılı olduğundan ve yıkama adımı gerektirmediğinden, geleneksel yaklaşımlardan çok daha iyi tekrarlanabilirlik sağlarlar. Birlikte, bu tahlil paketi, hücre tedavisini takiben spesifik fosforile STAT proteinlerinin daha kapsamlı bir analizi ve JAK / STAT sinyal yolunun spesifik ve seçici modülatörlerinin taranması ve karakterizasyonu için yeni uygun maliyetli araçlar sunmaktadır.

Giriş

JAK/STAT sinyal yolu, çeşitli sitokinlere, interferonlara, büyüme faktörlerine ve ilgili moleküllere hücresel yanıtlara aracılık etmede önemli bir rol ^oynar1,2. Bu ligandların spesifik hücre yüzeyi reseptörlerine bağlanması, JAK'ların aktivasyonu ile sonuçlanır ve bu da spesifik tirozin kalıntılarının fosforilasyonu ile STAT proteinlerini aktive eder. STAT fosforilasyonu, dimerizasyonları ve çekirdeğe translokasyonları ile sonuçlanır, burada düzenlenmiş hedef genlerin transkripsiyonu üzerindeki etkilerini gösterirler. STAT ailesi yedi üyeden oluşur: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b ve STAT6. Üyeler, ....

Protokol

1. Hücre kültürü

1. Hücreleri nemlendirilmiş 37 °C / % 5 _CO2 inkübatöründe ve kültüründe,% 10 fetal sığır serumu (FBS) (HeLa ve A431 hücreleri) ile desteklenmiş DMEM veya% 15 FBS (U266B1 hücreleri) ile desteklenmiş RPMI ile koruyun. Hücreleri% 70-80 birleşime ulaşana kadar kültürleyin, daha sonra onları tripsinize edin ve tahliller için geçirin veya kullanın.
   NOT: Kültür ortamı fenol kırmızısı içeriyordu. Tahliller yapılmadan önce herhangi bir hücre hattı için serum açlığı yapılmadı.

2. Yapışkan hücrelerle iki plakalı tahlil protokolünü kullanarak uyarıcı veya inhibitör titrasyonu

NOT: Bu....

Sonuçlar

Her THUNDER TR-FRET testi, yapışkan (HeLa veya A431) veya süspansiyon hücrelerinin (U266B1) JAK / STAT yoluna özgü aktivatörler veya inhibitörlerle muamele edilmesi ve daha sonra uygulanabilir olduğunda spesifik fosforile ve toplam STAT'ların seviyelerinin ölçülmesiyle farmakolojik olarak doğrulanmıştır. Tahliller, iki plakalı transfer protokolü ve önceden optimize edilmiş tahlil koşulları kullanılarak 384 kuyucuklu formatta gerçekleştirildi. Şekil 3, Şekil 4, Şe.......

Tartışmalar

Batı lekelenmesi ve ELISA tabanlı yöntemler gibi fosfoprotein analizi için geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, THUNDER TR-FRET hücresel tahlili için iş akışı basit ve hızlıdır, düşük hacimli bir numune (15 μL) kullanır, HTS için 384 kuyucuklu bir formatta tasarlanmıştır ve otomasyona oldukça uygundur. Tahlil protokolü esnektir ve hem orta hem de yüksek verimli uygulamalara kolayca uyarlanabilir. Tahliller, iki plakalı bir aktarım protokolü veya bir adet 384 kuyucuklu plaka pr.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile	Corning	3595	This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used
384-well microplate, white, low-volume	PerkinElmer	6007290	This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used
A431 cell line	ATCC	CRL-1555
Adhesive microplate seal	PerkinElmer	6050185
DMSO	Fisher	D159-4
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Wisent	319-005-CL	THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red
EnVision Xcite Multilabel plate reader	PerkinElmer	2104-0020A	The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option
Erlotinib hydrochloride	Sigma	CDS022564
Falcon tissue culture treated flasks	Fisher	13-680-65
Fetal bovine serum (FBS)	Wisent	098-150
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
JAK Inhibitor 1	Cayman Chemical	15146
Orbital plate shaker	Many options available	Not applicable
Recombinant human EGF	PeproTech	AF-100-15
Recombinant human IFNα2b	ProSpec	CYT-460
Recombinant human IL-4	R&D Systems	204-IL
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)	Wisent	350-007-CL	THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red
THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT1PT-500
THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT3PT-500
THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT4PT-500
THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT5PT-500
THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT6PT-500
Trypsin/EDTA 0.05%	Wisent	325-542-CL
U266B1 cell line	ATCC	TIB-196
Ultrapure water	NA	NA	Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer