JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Yetişkin sivrisinek tükürük bezi (SG), virüsler ve parazitler de dahil olmak üzere sivrisinek kaynaklı tüm patojenlerin insan konakçılarına iletilmesi için gereklidir. Bu video, SG'lerin larva (L4) evresi Anopheles gambiae sivrisineklerinden verimli bir şekilde izole edilmesini ve daha fazla analiz için L4 SG'lerin hazırlanmasını göstermektedir.

Özet

Sivrisinek tükürük bezleri (SG'ler), böcek kaynaklı patojenlerin iletimi için gerekli bir ağ geçidi organıdır. Virüsler ve sıtmaya neden olan Plazmodium parazitleri de dahil olmak üzere hastalık neden olan ajanlar, SG hücrelerinin salgı boşluklarında birikir. Burada, sonraki bir kan unu sırasında omurgalı konaklarına iletilmek üzere hazırlanırlar. Yetişkin bezleri, erken pupal SG histolizinin ötesinde devam eden larva SG kanal tomurcuk kalıntılarının bir detaylandırılması olarak oluştuğundan, larva SG, hastalık bulaşmasını sınırlayan müdahaleler için ideal bir hedeftir. Larva SG gelişimini anlamak, morfolojisinin ve fonksiyonel adaptasyonlarının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilir ve bu organı hedefleyen yeni müdahalelerin değerlendirilmesine yardımcı olabilir. Bu video protokolü, Anopheles gambiae sivrisineklerinden larva SG'lerini izole etmek, sabitlemek ve lekelemek için etkili bir teknik göstermektedir. % 25 etanol çözeltisinde larvalardan parçalanan bezler, metanol-buzul asetik asit karışımına sabitlenir ve ardından soğuk aseton yıkama. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde birkaç durulamadan sonra, SG'ler SG eksprese proteinlerine karşı çok çeşitli işaret boyaları ve / veya antisera ile boyanabilir. Larva SG izolasyonu için bu yöntem in situ hibridizasyon analizi, diğer transkriptomik uygulamalar ve proteomik çalışmalar için doku toplamak için de kullanılabilir.

Giriş

Sıtma, 2019'da yaklaşık 230 milyon enfeksiyona ve tahmini 409.000 ölüme neden olan büyük bir halk sağlığıtehdididir 1. Ölümlerin çoğunluğu Sahra altı Afrika'dadır ve parazit Plasmodium falciparumböcek vektörü Anopheles gambiae, bu video gösterisinin konusudur. Rakamlar yüzyılın başlarından bu yana yıllık ölüm oranında önemli bir düşüşe işaret etse de (>300.000 daha az yıllık ölüm), 2000'den 2015'e kadar gözlenen hastalık oranlarındaki umut verici düşüşler sivriliyor ve bu da hastalık bulaşmasını sınırlamak için yeni yaklaşımlara ihtiyaç olduğunu gösteriyor2. Sıtmayı kontrol etmek ve muhtemelen ortadan kaldırmak için umut verici ek stratejiler arasında CRISPR / Cas9 tabanlı gen düzenleme ve gentahriki 3,4,5kullanarak sivrisinek vektör kapasitesini hedeflemektir. Gerçekten de, hastalık bulaşmasını azaltmada en büyük etkiye sahip olan sivrisinek vektörün (uzun ömürlü insektisitle tedavi edilen yatak ağlarının genişletilmiş kullanımı yoluyla) hedeflenilmesidir6.

Dişi sivrisinekler, bir kan unu sırasında enfekte bir insandan Plasmodium gametositleri alır. Döllenme, olgunlaşma, midgut epitel geçişi, nüfus genişlemesi ve zorunlu sivrisinek konaklarında hemokoel navigasyonun ardından, yüz ila on binlerce Plasmodium sporozoit sivrisinek SG'lerini istila eder ve kurucu salgı hücrelerinin salgı boşluklarını doldurur. Salgı boşluklarının içine girdikten sonra, parazitler tükürük kanalına doğrudan erişebilir ve böylece bir sonraki kan yemeğinde yeni bir omurgalı konakçuya iletilmeye hazırdır. Çünkü SG'ler sıtmaya neden olan sporozoitlerin insan konakçılarına iletilmesi için kritik öneme sahiptir ve laboratuvar çalışmaları SG'lerin kan besleme, sivrisinek hayatta kalma veya doğurganlık 7 ,8,9için gerekli olmadığını göstermektedir, bulaşmayı engelleyen önlemler için ideal bir hedefi temsil ederler. Yetişkin sivrisinek SG'leri, erken pupal SG histolysis10'unötesinde devam eden larva SG'lerinde "kanal tomurcuk" kalıntılarının detaylandırılması olarak oluşur Larva SG'yi yetişkin evresi hastalık bulaşmasını sınırlamak için müdahaleler için ideal bir hedef haline getirir.

SG gelişiminin larva aşamasını karakterize etmek, sadece morfolojisini ve fonksiyonel adaptasyonlarını daha iyi anlamakla kalmaz, aynı zamanda anahtar SG düzenleyicilerinin gen düzenlemesi yoluyla bu organı hedefleyen yeni müdahalelerin değerlendirilmesine de yardımcı olabilir. Larva tükürük bezi mimarisinin önceki tüm çalışmaları immünostaining ve modern görüntüleme tekniklerindenönce 10,11, tükürük bezlerini çeşitli antikorlar ve hücre belirteçleri ile izole etmek ve boyamak için bir protokol geliştirdik12. Bu video, konfokal görüntüleme için Anopheles gambiae L4 larvalarından larva SG'lerinin çıkarılması, sabitlenmesi ve lekelenmesine yönelik bu yaklaşımı göstermektedir.

Protokol

1. Çözümlerin ve araçların hazırlanması

  1. Diseksiyon çözeltisinin hazırlanması
    1. Diseksiyon çözeltisi hazırlamak için, 15 plastik bir tüpte 7,5 mL damıtılmış H2O'ya% 100 etanol 2,5 mL ekleyin. Karıştırmak için tüpü 3 kez ters çevirin.
      NOT: Bu çözelti birkaç hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
  2. 10x fosfat tamponlu salin (PBS) stoğunun hazırlanması
    1. 10x PBS stoğu hazırlamak için 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4, 80 g NaCl ve 2 g KCl ila 800 mL deiyonize su ekleyin. Katı maddeler tamamen çözünene kadar bir karıştırma plakası üzerinde bir karıştırma çubuğu ile karıştırın. Arıtılmış su ile son ses seviyesini 1 L'ye ayarlayın.
      NOT: Bu çözelti birkaç ay boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
  3. 1x PBS hazırlanması
    1. Steril bir cam şişeye 90 mL H2O'ya 10 mL 10x PBS ekleyin. Kapağı sıkıca kapatın ve karıştırmak için 3x ters çevirin.
      NOT: Çözelti birkaç hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir.
  4. Fiksatif hazırlanması.
    1. 200 μL buzul asetik aside 600 μL metanol ekleyin. Çözümü her seferinde taze yapın.
  5. Macun plakasının yapımı (silikon kauçukla dolu bir doku kültürü yemeği)
    1. Epoksi (1 g) ve su (50 mL) bileşenlerini (1:50) karıştırın ve karışımı bir Petri kabına dökün. Kullanmadan önce bileşenlerin kurumasını bekleyin.
      NOT: Bir kez inşa edildikten sonra, macun plakası yıllarca kullanılabilir.

2. Bez diseksiyonu (Şekil 1A)

  1. Geç aşama L4 larvalarını toplayın (~ 10 gün sonra kapak; Şekil 2) plastik transfer pipet kullanarak besleme tepsilerinden.
    NOT: Standart sivrisinek hayvancılığı ve larva kültürü için bu yararlı çevrimiçi kılavuza bakın13.
    1. Bir parçalama mikroskobu aşamasına bir macun plakası yerleştirin ve larvaları macun plakasına aktarın.
      NOT: larvaları ilk diseksiyon için aliquoting yaparken, plastik bir transfer pipet kullanarak bir kerede slayta ~10 larva transfer etmek yararlıdır.
  2. 10 larvadan ayrı olarak macun plakasına bir damla diseksiyon çözeltisi(1:3EtOH:H 2 O) yerleştirin.
  3. % 25 EtOH damlasına bir L4 larva yerleştirmek için plastik transfer pipet veya tek kullanımlık cam pipet kullanın.
  4. Her elde bir tane olan kümesleri (#5) alın ve baskın olmayan el ile larva başını tutun. Baskın eli kullanarak, larvayı başın hemen altındaki kümeslerle kavrayın ve başın vücudun geri kalanından kopmasını ve bezlerin kafaya bağlı kalmasını sağlamak için minimum sabit kuvvetle hafifçe çekin. Larva karkasının vücut kısmını atın.
    NOT: Parçalara ayırırken, larva leşlerini toplamak için yakınlarda bir kağıt havlu ayarlayın.
  5. Kafa/bezleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 1 mL 1x PBS'de toplayın. Bağlı kafalarıyla ~40 parçalanmış bez için 1 mL PBS kullanın. Kafaların/SG'lerin arabelleğin altına batmasını bekleyin.

3. Antikor boyama için fiksasyon (Şekil 1B)

  1. Mikrosantrifüj tüpünün tepesinden başlayarak PBS'yi bir cam transfer pipeti kullanarak boşaltın, yapışkan sivrisinek dokularından kaçının ve dokulara zarar vermeden PBS çözeltisinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Çözeltiyi 800 μL'lik 3:1 metanol karışımı ile buzul asetik aside değiştirin. Tüpü gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin (12-24 saat önerilir; 19 saat tercih edilir).
  2. Ertesi gün çözeltiyi boşaltın ve 1 mL soğuk% 100 aseton ile değiştirin. 90'lara bırak.
  3. Asetonu çıkarın ve dokuları her seferinde 1 mL 1x PBS ile üç kez hafifçe durulayın.
    NOT: Numuneler akışla birlikte yavaşça yüzdürülmeli, ardından her PBS ilavesi tamamlandığında tüpün altına geri düşmelidir.

4. İmmünasyon (Şekil 1B)

  1. Toplam 1x PBS hacminin 200 μL'sinde uygun seyreltmede (1:100) birincil antikoru (örneğin Rab11) ekleyin. Boru içeriğini bir pipet ucuyla hafifçe döndürün. 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yaslanın.
  2. Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve 1 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın (çözeltiyi pipet içine ve dışına hafifçe pipetleme).
  3. Toplam hacmin 200 μL'sinde uygun seyreltmede (1:200) ikincil antikor (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) ekleyin. Boru içeriğini bir pipet ucuyla hafifçe döndürün. Oda sıcaklığında 90 dakika kuluçkaya yatır.
  4. Bu aşamada 200 μL PBS'ye Nil Kırmızısı (lipitler, 5 μL 1 μg/μL) ve/veya Hoechst (DNA, 3 μL 1 μg/μL) gibi boyalar ekleyin. Oda sıcaklığında 60 dakika daha kuluçkaya yatır. 1x PBS ile üç kez hafifçe yıkayın.

5. Mikroskopi için lekeli bezlerin montajı (Şekil 1C)

  1. Pipet 200 μL% 100 gliserol bir mikroskop slayt üzerine.
    NOT: Gliserol viskoz olduğundan, pipet ucunu uygun hacme ulaşana kadar sıvının içinde bırakın. %100 gliseol içine inildiğinde doku küçülmesi gözlenmedi. Bununla birlikte, araştırmacılar örnekleri% 100 gliserol içine taşımadan önce tüplerde% 30 ve% 50 gliserol yıkamalarından geçebilirler.
  2. Lekeli kafaları (slayt başına 20'ye kadar) ekli bezlerle (diğer iç yapılarla birlikte) yumuşak bir fırça kullanarak mikroskop kaydırağı(Şekil 3A) aktarın. Numuneleri cam slayt boyunca eşit olarak dağıtılacak şekilde yayın.
    NOT: Bezleri fırçayla bir kapak kaydırağında biriktirirken, SG'leri hafifçe yönlendirmek için tokmaklar kullanılabilir, böylece hepsi aynı yöne yönlendirilir.
  3. Bir diseksiyon mikroskobu altında görüntüleme, larva başını iki çift kümes gücü kullanarak bezlerden ayırın ve iki dokuyu dikkatlice zıt yönlere çekin.
    NOT: SG'leri tamamen izole etmek zor olduğundan, SG'leri ve ilgili iç yapıları bırakarak kafaları çıkarmanız yeterlidir. SG'ler diğer dokularla ilişkili kalsalar bile, Hoechst ve diğer belirteçlerle lekelendiğinde kolayca tanınırlar (Şekil 3B,C).
  4. Kafaları çıkarın ve atın ve her SG için ayırma işlemini tekrarlayın.
    NOT: Kafaları çıkarırken, toplamak için yakınlarda bir kağıt havlu ayarlayın.
  5. Üzerine 1,5 mm kalınlığında bir kapak kılıfı hafifçe yerleştirin (hava kabarcıklarından kaçının) ve şeffaf oje ile kapatın.
  6. 4 °C'de ışık geçirmez bir kapta saklayın.
    NOT: Boyalı bezlerin hazırlanan slaytları, kalitede önemli bir değişiklik olmadan altı aydan bir yıla kadar karanlıkta 4 °C'de tutulabilir. Aylar geçerken gliserol sızmaya başlarsa, delikleri doldurmak için kapak kapağını ve pipeti daha gliserol içinde hafifçe kaldırın.

Sonuçlar

Tükürük bezlerinin tüm aşama 4 larvalardan parçalanmaları nispeten kolaydır. Erkek ve dişi larvalar geç L4 larva aşamasında dişilerin sırt toraksı boyunca kırmızı bir şeritle ayırt edilebilir, ancak erkeklerin değil (Şekil 2). Ayrıca, anten morfolojisinin erkekte dişi L4 larvalarına göre çok daha ayrıntılı olduğunu gözlemliyoruz (Şekil 2), yetişkin sivrisineklerde bu yapıda gözlenen farklılıklara benzer. L4 aşamasındaki ö...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol bir Drosophila SG diseksiyon protokolünden ve yetişkin sivrisinek diseksiyon protokolü14 , 15,16'dan uyarlanmıştır. Bununla birlikte, çoğu belirteç yetişkin diseksiyonu ve SG boyama yöntemlerini kullanırken bodrum zarını (gösterilmeyen veriler) nüfuz etmedi. Yetişkin protokolünün uyarlamaları arasında bezlerin% 25 EtOH çözeltisinde parçalanması, bezlerin MeOH ve buzul asetik a...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü'ne An. gambiae larvalarına erişip yetiştirdiği için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
 KH2PO4Millipore SigmaP9791
 Na2HPO4 • 2H2OMillipore Sigma71643
 NaClMillipore SigmaS7653
AcetoneMillipore Sigma179124
Brush with soft bristlesAmazon (SN NJDF) Detail Paint Brush SetB08LH63D89
Cover slips (22 x 50 mm)VWR48393-195
DAPI (DNA)ThermoFisher ScientificD1306
Ethyl alcohol 200 proofMillipore SigmaEX0276
Gilson Pipetman P200 PipetteGilsonP200
Glacial Acetic AcidSigma Aldrich695092
Jewelers forceps, Dumont No. 5Millipore SigmaF6521
KClMillipore Sigma58221
MethanolMillipore Sigma1414209
Nail polishAmazon (Sally Hansen)B08148YH9M
Nile Red (lipid)ThermoFisher ScientificN1142
Paper towels/wipesULINES-7128
Petri plate (to make putty plate)ThermoFisher ScientificFB0875712
Pipette TipsGilsonTips E200ST
Plastic Transfer PipetteFisher ScientificS304671
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew LabMouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)ThermoFisher ScientificA11008
Silicone resin and curing agent for putty plateDow Chemicals - Ximeter SiliconePMX-200
Slides, frosted on one end for labellingVWR  20 X 50 mm48393-195
Wheat Germ AgglutininThermoFisher ScientificW834

Referanslar

  1. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020)
  2. Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
  3. Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
  4. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  5. Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).
  6. Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672 (2015).
  7. Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).
  8. Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
  9. Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).
  10. Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
  11. Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).
  12. Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
  13. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ (2015)
  14. Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617 (2015).
  15. Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
  16. Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
  17. Clements, A. N. . The physiology of mosquitoes. , (1963).
  18. Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
  19. Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
  20. Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
  21. Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
  22. Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 175

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır