Dissecção e Imunostaining de Glândulas Salivares Larvais de Anopheles gambiae Mosquitos

Resumo

A glândula salivar de mosquito adulto (SG) é necessária para a transmissão de todos os patógenos transmitidos por mosquitos para seus hospedeiros humanos, incluindo vírus e parasitas. Este vídeo demonstra o isolamento eficiente das OGs do estágio larval (L4) dos mosquitos Anopheles gambiae e a preparação dos SGs L4 para análise posterior.

Resumo

As glândulas salivares de mosquitos (OG) são um órgão de entrada necessário para a transmissão de patógenos transmitidos por insetos. Agentes causadores de doenças, incluindo vírus e parasitas do Plasmodium que causam malária, se acumulam nas cavidades secretas das células SG. Aqui, eles estão prontos para transmissão para seus hospedeiros vertebrados durante uma refeição sanguínea subsequente. À medida que as glândulas adultas se formam como uma elaboração de restos de brotos de sg larval que persistem além da histolise da SG pupal precoce, a SG larval é um alvo ideal para intervenções que limitam a transmissão da doença. Compreender o desenvolvimento de SG larval pode ajudar a desenvolver uma melhor compreensão de sua morfologia e adaptações funcionais e auxiliar na avaliação de novas intervenções que visam esse órgão. Este protocolo de vídeo demonstra uma técnica eficiente para isolar, fixar e colorir os GGs larvais dos mosquitos Anopheles gambiae. As glândulas dissecadas de larvas em uma solução de 25% de etanol são fixadas em uma mistura de ácido acético metanol-glacial, seguida por uma lavagem de acetona fria. Depois de algumas enxaguadas em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), as SGs podem ser manchadas com uma ampla gama de corantes marcadores e/ou antisera contra proteínas expressas por SG. Este método para o isolamento de SG larval também poderia ser usado para coletar tecidos para análise de hibridização in situ, outras aplicações transcriômicas e estudos proteômicos.

Introdução

A malária é uma grande ameaça à saúde pública que causa quase 230 milhões de infecções e cerca de 409 mil mortes em 2019¹. A maioria das mortes está na África subsaariana e são causadas pelo parasita Plasmodium falciparum, cujo vetor de insetos é Anopheles gambiae, o tema desta demonstração de vídeo. Embora os números indiquem uma queda significativa na taxa anual de mortalidade desde a virada do século (>300.000 mortes anuais a menos), as reduções promissoras nas taxas de doença observadas de 2000 a 2015 estão diminuindo, sugerindo a necessidade de novas abordagens para limitar a transmissão da doença². Entre as estratégias adicionais promissoras para controlar e possivelmente eliminar a malária está a capacidade de vetores de mosquitos usando a edição de genes baseada em CRISPR/Cas9 e unidade genética^3,4,5. De fato, é o direcionamento do vetor de mosquitos (através do uso expandido de redes de cama tratadas com inseticida de longa duração) que teve o maior impacto na redução da transmissão da doença⁶.

Mosquitos fêmeas adquirem gametocitos de Plasmodium de um humano infectado durante uma refeição de sangue. Após fertilização, maturação, travessia de epitélio médio, expansão populacional e navegação de hemocoel em seus obrigatórios hospedeiros de mosquitos, centenas a dezenas de milhares de esporozoitas plasmodium invadem os mosquitos SGs e preenchem as cavidades secretas das células secretas constituintes. Uma vez dentro das cavidades secretas, os parasitas têm acesso direto ao ducto salivar e, portanto, estão preparados para a transmissão para um novo hospedeiro vertebrado na próxima refeição sanguínea. Como os OG são fundamentais para a transmissão de esporozoitas causadores da malária para seus hospedeiros humanos, e estudos laboratoriais sugerem que os GGs não são essenciais para a alimentação sanguínea, sobrevivência de mosquitos ou fecundidade^7,8,9, representam um alvo ideal para medidas de bloqueio de transmissão. Os SGs do mosquito adulto formam-se como uma elaboração de remanescentes de "brotos de ducto" nos GGs larvais que persistem além da histolise pupal^10,tornando a SG larval um alvo ideal para intervenções para limitar a transmissão da doença em estágio adulto.

Caracterizar o estágio larval do desenvolvimento de SG pode ajudar a desenvolver não apenas uma melhor compreensão de suas morfologia e adaptações funcionais, mas também pode ajudar na avaliação de novas intervenções que visam esse órgão através da edição de genes dos principais reguladores de SG. Como todos os estudos anteriores da arquitetura das glândulas salivares larvais antecedem as técnicas modernas de imunossuagem e de imagem moderna^10,11, desenvolvemos um protocolo para isolar e manchar glândulas salivares com uma variedade de anticorpos e marcadores celulares¹². Este vídeo demonstra essa abordagem para a extração, fixação e coloração de GGs larvas de larvas de Anopheles gambiae L4 larvas para imagens confocal.

Protocolo

1. Elaboração de soluções e ferramentas

1. Elaboração da solução de dissecção
   1. Para preparar a solução de dissecação, adicione 2,5 mL de 100% de etanol a 7,5 mL de H₂O destilado em um tubo plástico de 15. Inverta o tubo 3 vezes para misturar.
      NOTA: Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente por várias semanas.
2. Preparação de estoque salino tampão de fosfato de 10x (PBS)
   1. Para preparar 10x de estoque PBS, adicione 17,8 g Na₂HPO₄• 2H₂O, 2,4 g KH₂PO_4,80 g NaCl e 2 g KCl a 800 mL de água desionizada. Misture com uma barra de mexida em uma placa de mexida até que os sólidos tenham totalmente dissolvido. Ajuste o volume final para 1 L com água purificada.
      NOTA: Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente por vários meses.
3. Preparação de 1x PBS
   1. Adicione 10 mL de 10x PBS a 90 mL de H₂O em uma garrafa de vidro estéril. Feche bem a tampa e inverta 3x para misturar.
      NOTA: A solução pode ser armazenada a 4 °C por várias semanas.
4. Preparação de fixação.
   1. Adicione 600 μL de metanol a 200 μL de ácido acético glacial. Faça a solução fresca a cada vez.
5. Construção de placa de massa (um prato de cultura de tecido cheio de borracha de silicone)
   1. Misture os componentes (1:50) de epóxi (1 g) e água (50 mL) e despeje a mistura em uma placa de Petri. Aguarde que os componentes sequem antes de usar.
      NOTA: Uma vez construído, a placa de massa pode ser usada por anos.

2. Dissecção da glândula (Figura 1A)

1. Coletar larvas L4 em estágio final (~10 dias de pós-eclosão; Figura 2) de bandejas de alimentação usando uma pipeta de transferência de plástico.
   NOTA: Veja este manual on-line útil para a criação padrão de mosquitos e cultura larval¹³.
   1. Coloque uma placa de massa no palco de um microscópio dissecando e transfira larvas para a placa de massa.
      NOTA: Ao aliquoras larvas para dissecção inicial, é útil transferir ~10 larvas para o slide ao mesmo tempo usando uma pipeta de transferência de plástico.
2. Coloque uma gota de solução de dissecção (1:3 EtOH:H₂O) na placa de massa, separada das 10 larvas.
3. Use uma pipeta de transferência de plástico ou pipeta de vidro descartável para colocar uma larva L4 na gota de 25% de EtOH.
4. Pegue fórceps (#5), um em cada mão, e com a mão não dominante, segure a cabeça da larva. Usando a mão dominante, segure a larva com fórceps logo abaixo da cabeça e puxe suavemente com força constante mínima, de tal forma que a cabeça se desprende do resto do corpo e as glândulas permaneçam presas à cabeça. Descarte a porção do corpo da carcaça da larva.
   NOTA: Ao dissecar, coloque uma toalha de papel nas proximidades para coletar as carcaças das larvas.
5. Colete a cabeça/glândulas em 1 mL de 1x PBS em um tubo de microcentrifus de 1,5 mL. Use 1 mL de PBS para ~40 glândulas dissecadas com suas cabeças anexadas. Aguarde que as cabeças/SGs afundem no fundo do buffer.

3. Fixação para coloração de anticorpos (Figura 1B)

1. Escorra o PBS a partir do topo do tubo de microcentrifuuge usando uma pipeta de transferência de vidro, evitando os tecidos pegajosos do mosquito e removendo o máximo possível da solução PBS sem danificar os tecidos. Substitua a solução por 800 μL de uma mistura de 3:1 de metanol ao ácido acético glacial. Coloque o tubo a 4 °C durante a noite (12-24 h recomendado; 19 h preferido).
2. No dia seguinte, drene a solução e substitua-a por 1 mL de acetona fria 100%. Vá para os anos 90.
3. Remova a acetona e enxágue suavemente os tecidos três vezes com 1 mL de 1x PBS cada vez.
   NOTA: As amostras devem flutuar lentamente com o fluxo e, em seguida, cair de volta para o fundo do tubo quando cada adição de PBS estiver completa.

4. Imunostaining (Figura 1B)

1. Adicione anticorpo primário (por exemplo, Rab11) na diluição apropriada (1:100) em 200 μL do volume total de 1x PBS. Gire o conteúdo do tubo suavemente com uma ponta de pipeta. Incubar durante a noite a 4 °C.
2. Remova a solução de anticorpos primários e lave três vezes com 1 mL de 1x PBS (tubos suavemente para dentro e para fora da pipeta).
3. Adicione anticorpo secundário (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) na diluição apropriada (1:200) em 200 μL de volume total. Gire o conteúdo do tubo suavemente com uma ponta de pipeta. Incubar em temperatura ambiente por 90 minutos.
4. Adicione corantes, como o Vermelho Nilo (lipídios, 5 μL de 1 μg/μL) e/ou Hoechst (DNA, 3 μL de 1 μg/μL), em 200 μL de PBS nesta fase. Incubar em temperatura ambiente por mais 60 minutos. Lave suavemente três vezes com 1x PBS.

5. Montagem de glândulas manchadas para microscopia (Figura 1C)

1. Pipeta 200 μL de 100% glicerol em um slide de microscópio.
   NOTA: Como o glicerol é viscoso, deixe a ponta da pipeta no líquido até atingir o volume apropriado. Não foi observado encolhimento tecidual ao ir direto para 100% glicerol. No entanto, os pesquisadores podem passar por lavagens de 30% e 50% de glicerol nos tubos antes de mover as amostras para 100% glicerol.
2. Transfira as cabeças manchadas (até 20 por slide) com as glândulas anexadas (juntamente com outras estruturas internas) para o slide do microscópio usando uma escova macia(Figura 3A). Espalhe as amostras para que elas sejam distribuídas uniformemente ao longo do escorregador de vidro.
   NOTA: Ao depositar glândulas em um slide de cobertura com um pincel, fórceps podem ser usados para orientar suavemente os OGs para que todos sejam orientados na mesma direção.
3. Visualizando sob um microscópio dissecando, separe a cabeça larval das glândulas usando dois pares de fórceps e puxando cuidadosamente os dois tecidos em direções opostas.
   NOTA: Como é desafiador isolar completamente os SGs, basta remover as cabeças, deixando os SGs e estruturas internas associadas. Mesmo que os OGs permaneçam associados a outros tecidos, eles são facilmente reconhecidos quando manchados com Hoechst e outros marcadores(Figura 3B,C).
4. Remova e descarte as cabeças e repita o processo de separação de cada SG.
   NOTA: Ao remover cabeças, coloque uma toalha de papel nas proximidades para recolhê-las.
5. Coloque delicadamente uma tampa de 1,5 mm de espessura na parte superior (evitando bolhas de ar) e sele com esmalte claro.
6. Armazene a 4 °C em um recipiente à prova de luz.
   NOTA: Os slides preparados das glândulas manchadas podem ser mantidos a 4 °C no escuro por até seis meses a um ano sem quaisquer mudanças notáveis na qualidade. Se o glicerol começar a vazar com o passar dos meses, levante suavemente a mancha de cobertura e a pipeta em mais glicerol para preencher os orifícios.

Resultados

Glândulas salivares são relativamente fáceis de dissecar de todas as larvas estágio 4. Larvas masculinas e femininas podem ser distinguidas no estágio larval L4 tardio por uma listra vermelha ao longo do tórax dorsal das fêmeas, mas não dos machos(Figura 2). Observamos também que a morfologia antenal é muito mais elaborada no masculino do que nas larvas L4 fêmeas (Figura 2),semelhante às diferenças observadas nesta estrutura em mosquitos adultos. Ju...

Discussão

O protocolo aqui descrito foi adaptado a partir de um protocolo de dissecção Drosophila SG e um protocolo de dissecção de mosquitos^{adultos 14,15,16}. No entanto, a maioria dos marcadores não penetrou na membrana do porão (dados não mostrados) ao utilizar os métodos de dissecção adulta e coloração de SG. As adaptações do protocolo adulto incluíram dissecar as glândulas em uma solução de 25% etoh, lavar as glându...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
KH2PO4	Millipore Sigma	P9791
Na2HPO4 • 2H2O	Millipore Sigma	71643
NaCl	Millipore Sigma	S7653
Acetone	Millipore Sigma	179124
Brush with soft bristles	Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set	B08LH63D89
Cover slips (22 x 50 mm)	VWR	48393-195
DAPI (DNA)	ThermoFisher Scientific	D1306
Ethyl alcohol 200 proof	Millipore Sigma	EX0276
Gilson Pipetman P200 Pipette	Gilson	P200
Glacial Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Jewelers forceps, Dumont No. 5	Millipore Sigma	F6521
KCl	Millipore Sigma	58221
Methanol	Millipore Sigma	1414209
Nail polish	Amazon (Sally Hansen)	B08148YH9M
Nile Red (lipid)	ThermoFisher Scientific	N1142
Paper towels/wipes	ULINE	S-7128
Petri plate (to make putty plate)	ThermoFisher Scientific	FB0875712
Pipette Tips	Gilson	Tips E200ST
Plastic Transfer Pipette	Fisher Scientific	S304671
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab	Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)	ThermoFisher Scientific	A11008
Silicone resin and curing agent for putty plate	Dow Chemicals - Ximeter Silicone	PMX-200
Slides, frosted on one end for labelling	VWR  20 X 50 mm	48393-195
Wheat Germ Agglutinin	ThermoFisher Scientific	W834