Disección e inmunotinción de glándulas salivales larvales de mosquitos Anopheles gambiae

Resumen

La glándula salival del mosquito adulto (SG) es necesaria para la transmisión de todos los patógenos transmitidos por mosquitos a sus huéspedes humanos, incluidos los virus y parásitos. Este video demuestra el aislamiento eficiente de los SG de los mosquitos Anopheles gambiae en etapa larval (L4) y la preparación de los SG L4 para su posterior análisis.

Resumen

Las glándulas salivales de los mosquitos (SG) son un órgano de entrada necesario para la transmisión de patógenos transmitidos por insectos. Los agentes causantes de enfermedades, incluidos los virus y los parásitos Plasmodium que causan la malaria, se acumulan en las cavidades secretoras de las células SG. Aquí, están preparados para la transmisión a sus huéspedes vertebrados durante una comida de sangre posterior. A medida que las glándulas adultas se forman como una elaboración de restos de brotes larvales del conducto SG que persisten más allá de la histólisis temprana del SG pupal, el SG larvario es un objetivo ideal para las intervenciones que limitan la transmisión de la enfermedad. Comprender el desarrollo larvario de SG puede ayudar a desarrollar una mejor comprensión de su morfología y adaptaciones funcionales y ayudar en la evaluación de nuevas intervenciones que se dirigen a este órgano. Este protocolo de video demuestra una técnica eficiente para aislar, fijar y teñir larvales de mosquitos Anopheles gambiae. Las glándulas diseccionadas de larvas en una solución de etanol al 25% se fijan en una mezcla de metanol y ácido acético glacial, seguida de un lavado de acetona en frío. Después de algunos enjuagues en solución salina tamponada con fosfato (PBS), los SG se pueden teñir con una amplia gama de colorantes marcadores y / o antisueros contra las proteínas expresadas en SG. Este método para el aislamiento de LARVAS SG también podría usarse para recolectar tejido para análisis de hibridación in situ, otras aplicaciones transcriptómicas y estudios proteómicos.

Introducción

La malaria es una importante amenaza para la salud pública que causa casi 230 millones de infecciones y un estimado de 409,000 muertes en 2019¹. La mayoría de las muertes se producen en el África subsahariana y son causadas por el parásito Plasmodium falciparum,cuyo insecto vector es Anopheles gambiae,objeto de esta demostración en vídeo. Aunque las cifras indican una caída significativa en la tasa de mortalidad anual desde el cambio de siglo (>300.000 muertes anuales menos), las disminuciones prometedoras en las tasas de enfermedad observadas de 2000 a 2015 están disminuyendo, lo que sugiere la necesidad de nuevos enfoques para limitar la transmisión de enfermedades². Entre las estrategias adicionales prometedoras para controlar y posiblemente eliminar la malaria se encuentra apuntar a la capacidad de los mosquitos vectores utilizando la edición de genes basada en CRISPR / Cas9 y el impulso^{genético 3,4,5}. De hecho, es la focalización del mosquito vector (a través del uso ampliado de mosquiteros tratados con insecticida de larga duración) lo que ha tenido el mayor impacto en la reducción de la transmisión de enfermedades⁶.

Los mosquitos hembra adquieren gametocitos Plasmodium de un humano infectado durante una comida de sangre. Después de la fertilización, la maduración, el recorrido del epitelio del intestino medio, la expansión de la población y la navegación del hemocoel en sus huéspedes mosquitos obligados, cientos a decenas de miles de esporozoítos de Plasmodium invaden los SG del mosquito y llenan las cavidades secretoras de las células secretoras constituyentes. Una vez dentro de las cavidades secretoras, los parásitos tienen acceso directo al conducto salival y, por lo tanto, están preparados para la transmisión a un nuevo huésped vertebrado en la próxima comida de sangre. Debido a que los SG son críticos para la transmisión de esporozoítos causantes de malaria a sus huéspedes humanos, y los estudios de laboratorio sugieren que los SG no son esenciales para la alimentación de la sangre, la supervivencia de los mosquitos o la fecundidad^7,8,9,representan un objetivo ideal para las medidas de bloqueo de la transmisión. Los SG de mosquitos adultos se forman como una elaboración de restos de "brotes de conducto" en los SG larvales que persisten más allá de la histólisis temprana de SG pupal^10,lo que hace que el SG larvario sea un objetivo ideal para las intervenciones para limitar la transmisión de enfermedades en etapa adulta.

Caracterizar la etapa larvaria del desarrollo de SG puede ayudar a desarrollar no solo una mejor comprensión de su morfología y adaptaciones funcionales, sino que también puede ayudar a evaluar nuevas intervenciones que se dirijan a este órgano a través de la edición de genes de reguladores clave de SG. Debido a que todos los estudios previos de arquitectura de las glándulas salivales larvales son anteriores a la inmunotinción y a las técnicas modernas de imagen^10,11,hemos desarrollado un protocolo para aislar y teñir las glándulas salivales con una variedad de anticuerpos y marcadores celulares¹². Este video demuestra este enfoque para la extracción, fijación y tinción de larvas de SG de larvas de larvas de Anopheles gambiae L4 larvas para imágenes confocales.

Protocolo

1. Preparación de soluciones y herramientas

1. Preparación de la solución de disección
   1. Para preparar la solución de disección, agregue 2.5 ml de etanol al 100% a 7.5 ml de H₂O destilado en un tubo de plástico de 15. Invierta el tubo 3 veces para mezclar.
      NOTA: Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente durante varias semanas.
2. Preparación de 10 cepas de solución salina tamponada con fosfato (PBS)
   1. Para preparar 10x PBS stock, agregue 17.8 g Na₂HPO₄• 2H₂O, 2.4 g KH₂PO₄, 80 g NaCl y 2 g KCl a 800 mL de agua desionizada. Mezcle con una barra de agitación en una placa de agitación hasta que los sólidos se hayan disuelto por completo. Ajuste el volumen final a 1 L con agua purificada.
      NOTA: Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente durante varios meses.
3. Preparación de 1x PBS
   1. Agregue 10 ml de 10 pbs a 90 ml de H₂O en una botella de vidrio estéril. Cierre bien la tapa e invierta 3x para mezclar.
      NOTA: La solución se puede almacenar a 4 °C durante varias semanas.
4. Preparación de fijador.
   1. Añadir 600 μL de metanol a 200 μL de ácido acético glacial. Haga que la solución sea fresca cada vez.
5. Construcción de una placa de masilla (un plato de cultivo de tejidos lleno de caucho de silicona)
   1. Mezclar los componentes (1:50) de epoxi (1 g) y agua (50 ml) y verter la mezcla en una placa de Petri. Espere a que los componentes se sequen antes de usar.
      NOTA: Una vez construida, la placa de masilla se puede utilizar durante años.

2. Disección de glándulas (Figura 1A)

1. Recolectar larvas L4 en etapa tardía (~ 10 días después de la eclosión; Figura 2) de bandejas de alimentación utilizando una pipeta de transferencia de plástico.
   NOTA: Consulte este útil manual en línea para la cría estándar de mosquitos y el cultivo^{larvario 13}.
   1. Coloque una placa de masilla en el escenario de un microscopio de disección y transfiera las larvas a la placa de masilla.
      NOTA: Al alícuotas larvas para la disección inicial, es útil transferir ~ 10 larvas al portaobjetos a la vez usando una pipeta de transferencia de plástico.
2. Coloque una gota de solución de disección (1:3 EtOH:H₂O) sobre la placa de masilla, separada de las 10 larvas.
3. Use una pipeta de transferencia de plástico o una pipeta de vidrio desechable para colocar una larva L4 en la gota de EtOH al 25%.
4. Tome fórceps (# 5), uno en cada mano, y con la mano no dominante, agarre la cabeza de la larva. Usando la mano dominante, agarre la larva con fórceps justo debajo de la cabeza y tire suavemente con una fuerza constante mínima, de modo que la cabeza se separe del resto del cuerpo y las glándulas permanezcan unidas a la cabeza. Deseche la porción del cuerpo de la carcasa de la larva.
   NOTA: Al diseccionar, coloque una toalla de papel cerca para recoger los cadáveres de las larvas.
5. Recoja la cabeza/glándulas en 1 ml de 1x PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Use 1 ml de PBS para ~ 40 glándulas disecadas con sus cabezas unidas. Espere a que los cabezales/SG se hundan en el fondo del búfer.

3. Fijación para la tinción de anticuerpos (Figura 1B)

1. Drene el PBS comenzando desde la parte superior del tubo de la microcentrífuga usando una pipeta de transferencia de vidrio, evitando los tejidos pegajosos del mosquito y eliminando la mayor cantidad posible de la solución de PBS sin dañar los tejidos. Reemplace la solución con 800 μL de una mezcla 3:1 de metanol a ácido acético glacial. Coloque el tubo a 4 °C durante la noche (se recomiendan 12-24 h; se prefieren 19 h).
2. Al día siguiente, escurrir la solución y reemplazarla con 1 ml de acetona fría al 100%. Dejar para 90 s.
3. Retire la acetona y enjuague suavemente los tejidos tres veces con 1 ml de 1x PBS cada vez.
   NOTA: Las muestras deben flotar lentamente hacia arriba con el flujo, luego caer de nuevo a la parte inferior del tubo para cuando se complete cada adición de PBS.

4. Inmunotinción (Figura 1B)

1. Añadir anticuerpo primario (p. ej., Rab11) en la dilución adecuada (1:100) en 200 μL del volumen total de 1x PBS. Gire el contenido del tubo suavemente con una punta de pipeta. Incubar durante la noche a 4 °C.
2. Retire la solución primaria de anticuerpos y lávela tres veces con 1 ml de 1 pbS (pipeteando suavemente la solución dentro y fuera de la pipeta).
3. Añadir anticuerpo secundario (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) a la dilución adecuada (1:200) en 200 μL de volumen total. Gire el contenido del tubo suavemente con una punta de pipeta. Incubar a temperatura ambiente durante 90 min.
4. Agregue colorantes, como rojo del Nilo (lípidos, 5 μL de 1 μg/μL) y/o Hoechst (ADN, 3 μL de 1 μg/μL), en 200 μL de PBS en esta etapa. Incubar a temperatura ambiente durante 60 min adicionales. Lavar suavemente tres veces con 1x PBS.

5. Montaje de glándulas teñidas para microscopía (Figura 1C)

1. Pipetear 200 μL de glicerol al 100% en un portaobjetos de microscopio.
   NOTA: Como el glicerol es viscoso, deje la punta de la pipeta en el líquido hasta que alcance el volumen apropiado. No se observó encogimiento del tejido al pasar directamente al glicerol al 100%. Sin embargo, los investigadores pueden pasar por lavados de glicerol al 30% y 50% en los tubos antes de mover las muestras al 100% de glicerol.
2. Transfiera las cabezas teñidas (hasta 20 por diapositiva) con las glándulas unidas (junto con otras estructuras internas) al portaobjetos del microscopio con un cepillo suave(Figura 3A). Extienda las muestras para que se distribuyan uniformemente a lo largo del portaobjetos de vidrio.
   NOTA: Al depositar glándulas en una cubierta deslizante con un cepillo, se pueden usar fórceps para orientar suavemente los SG para que todos estén orientados en la misma dirección.
3. Viendo bajo un microscopio de disección, separe la cabeza larval de las glándulas usando dos pares de fórceps y tirando cuidadosamente de los dos tejidos en direcciones opuestas.
   NOTA: Como es difícil aislar completamente los SG, simplemente retire las cabezas, dejando los SG y las estructuras internas asociadas. Incluso si los SG permanecen asociados con otros tejidos, se reconocen fácilmente cuando se tiñen con Hoechst y otros marcadores(Figura 3B,C).
4. Retire y deseche los cabezales y repita el proceso de separación para cada SG.
   NOTA: Al quitar cabezas, coloque una toalla de papel cerca para recogerlas.
5. Coloque suavemente una funda de 1,5 mm de grosor en la parte superior (evitando burbujas de aire) y selle con esmalte de uñas transparente.
6. Conservar a 4 °C en un recipiente a prueba de luz.
   NOTA: Las diapositivas preparadas de glándulas teñidas se pueden mantener a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de seis meses a un año sin ningún cambio notable en la calidad. Si el glicerol comienza a gotear a medida que pasan los meses, levante suavemente la cubierta y la pipeta en más glicerol para llenar los agujeros.

Resultados

Las glándulas salivales son relativamente fáciles de diseccionar de todas las larvas en etapa 4. Las larvas masculinas y femeninas se pueden distinguir en la etapa larvaria L4 tardía por una franja roja a lo largo del tórax dorsal de las hembras pero no de los machos (Figura 2). También observamos que la morfología antenal es mucho más elaborada en larvas L4 macho que en hembra(Figura 2),similar a las diferencias observadas en esta estructura en mosquitos...

Discusión

El protocolo descrito aquí fue adaptado de un protocolo de disección de Drosophila SG y un protocolo de disección de mosquitos^{adultos 14,15,16}. Sin embargo, la mayoría de los marcadores no penetraron en la membrana basal (datos no mostrados) cuando se utilizaron los métodos de disección en adultos y tinción de SG. Las adaptaciones del protocolo para adultos incluyeron diseccionar las glándulas en una solución de EtOH al...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
KH2PO4	Millipore Sigma	P9791
Na2HPO4 • 2H2O	Millipore Sigma	71643
NaCl	Millipore Sigma	S7653
Acetone	Millipore Sigma	179124
Brush with soft bristles	Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set	B08LH63D89
Cover slips (22 x 50 mm)	VWR	48393-195
DAPI (DNA)	ThermoFisher Scientific	D1306
Ethyl alcohol 200 proof	Millipore Sigma	EX0276
Gilson Pipetman P200 Pipette	Gilson	P200
Glacial Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Jewelers forceps, Dumont No. 5	Millipore Sigma	F6521
KCl	Millipore Sigma	58221
Methanol	Millipore Sigma	1414209
Nail polish	Amazon (Sally Hansen)	B08148YH9M
Nile Red (lipid)	ThermoFisher Scientific	N1142
Paper towels/wipes	ULINE	S-7128
Petri plate (to make putty plate)	ThermoFisher Scientific	FB0875712
Pipette Tips	Gilson	Tips E200ST
Plastic Transfer Pipette	Fisher Scientific	S304671
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab	Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)	ThermoFisher Scientific	A11008
Silicone resin and curing agent for putty plate	Dow Chemicals - Ximeter Silicone	PMX-200
Slides, frosted on one end for labelling	VWR  20 X 50 mm	48393-195
Wheat Germ Agglutinin	ThermoFisher Scientific	W834