Dissezione e immunocolorazione delle ghiandole salivari larvali da zanzare Anopheles gambiae

Riepilogo

La ghiandola salivare della zanzara adulta (SG) è necessaria per la trasmissione di tutti gli agenti patogeni trasmessi dalle zanzare ai loro ospiti umani, inclusi virus e parassiti. Questo video dimostra l'efficiente isolamento degli SG dalle zanzare Anopheles gambiae allo stadio larvale (L4) e la preparazione degli SG L4 per ulteriori analisi.

Abstract

Le ghiandole salivari delle zanzare (SG) sono un organo gateway necessario per la trasmissione di agenti patogeni trasmessi dagli insetti. Gli agenti che causano malattie, compresi i virus e i parassiti del Plasmodium che causano la malaria, si accumulano nelle cavità secretorie delle cellule SG. Qui, sono pronti per la trasmissione ai loro ospiti vertebrati durante un successivo pasto di sangue. Mentre le ghiandole adulte si formano come un'elaborazione di resti di gemme del dotto SG larvale che persistono oltre l'istolisi SG pupale precoce, l'SG larvale è un bersaglio ideale per interventi che limitano la trasmissione della malattia. Comprendere lo sviluppo del SG larvale può aiutare a sviluppare una migliore comprensione della sua morfologia e degli adattamenti funzionali e aiutare nella valutazione di nuovi interventi che mirano a questo organo. Questo protocollo video dimostra una tecnica efficiente per isolare, fissare e colorare gli SG larvali dalle zanzare Anopheles gambiae. Le ghiandole sezionate dalle larve in una soluzione di etanolo al 25% sono fissate in una miscela di metanolo e acido acetico glaciale, seguita da un lavaggio a freddo con acetone. Dopo alcuni risciacqui in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), gli SG possono essere colorati con una vasta gamma di coloranti marcatori e / o antisieri contro le proteine espresse SG. Questo metodo per l'isolamento SG larvale potrebbe anche essere utilizzato per raccogliere tessuto per l'analisi di ibridazione in situ, altre applicazioni trascrittomiche e studi proteomici.

Introduzione

La malaria è una delle principali minacce per la salute pubblica che causa quasi 230 milioni di infezioni e circa 409.000 morti nel 2019¹. La maggior parte dei decessi si trova nell'Africa sub-sahariana e sono causati dal parassita Plasmodium falciparum,il cui insetto vettore è Anopheles gambiae,oggetto di questo video dimostrativo. Sebbene i numeri indichino un calo significativo del tasso di mortalità annuale dall'inizio del secolo (> 300.000 decessi annuali in meno), le promettenti diminuzioni dei tassi di malattia osservate dal 2000 al 2015 si stanno assottigliando, suggerendo la necessità di nuovi approcci per limitare la trasmissione della malattia². Tra le promettenti strategie aggiuntive per controllare e possibilmente eliminare la malaria c'è il targeting della capacità del vettore di zanzara utilizzando l'editing genetico basato su CRISPR / Cas9 e il gene-drive^3,4,5. In effetti, è il targeting del vettore di zanzare (attraverso l'uso esteso di zanzariere trattate con insetticidi di lunga durata) che ha avuto il maggiore impatto sulla riduzione della trasmissione della malattia⁶.

Le zanzare femmine acquisiscono gametociti di Plasmodium da un essere umano infetto durante un pasto di sangue. Dopo la fecondazione, la maturazione, l'attraversamento dell'epitelio dell'intestino medio, l'espansione della popolazione e la navigazione dell'emocoel nei loro ospiti di zanzara obbligati, centinaia di decine di migliaia di sporozoiti di Plasmodium invadono i SG di zanzara e riempiono le cavità secretorie delle cellule secretorie costituenti. Una volta all'interno delle cavità secretorie, i parassiti hanno accesso diretto al dotto salivare e sono quindi pronti per la trasmissione a un nuovo ospite vertebrato al successivo pasto di sangue. Poiché gli SG sono fondamentali per la trasmissione degli sporozoiti che causano la malaria ai loro ospiti umani e gli studi di laboratorio suggeriscono che gli SG non sono essenziali per l'alimentazione del sangue, la sopravvivenza delle zanzare o la fecondità^7,8,9,rappresentano un obiettivo ideale per le misure di blocco della trasmissione. Gli SG di zanzara adulta si formano come un'elaborazione di resti di "gemme del dotto" negli SG larvali che persistono oltre l'istolisi SG pupale precoce¹⁰, rendendo la SG larvale un bersaglio ideale per interventi per limitare la trasmissione della malattia in stadio adulto.

Caratterizzare lo stadio larvale dello sviluppo SG può aiutare a sviluppare non solo una migliore comprensione della sua morfologia e degli adattamenti funzionali, ma può anche aiutare a valutare nuovi interventi che prendono di mira questo organo attraverso l'editing genico dei regolatori chiave sg. Poiché tutti gli studi precedenti sull'architettura della ghiandola salivare larvale precedono l'immunocolorazione e le moderne tecniche di imaging^10,11,abbiamo sviluppato un protocollo per isolare e colorare le ghiandole salivari con una varietà di anticorpi e marcatori cellulari¹². Questo video dimostra questo approccio all'estrazione, alla fissazione e alla colorazione di SG larvali da larve di Anopheles gambiae L4 per l'imaging confocale.

Protocollo

1. Preparazione di soluzioni e strumenti

1. Preparazione della soluzione di dissezione
   1. Per preparare la soluzione di dissezione, aggiungere 2,5 ml di etanolo al 100% a 7,5 ml di H₂O distillato in un tubo di plastica 15. Invertire il tubo 3 volte per mescolare.
      NOTA: questa soluzione può essere conservata a temperatura ambiente per diverse settimane.
2. Preparazione di 10 stock salino tamponato con fosfato (PBS)
   1. Per preparare 10 stock PBS, aggiungere 17,8 g Na₂HPO₄• 2H₂O, 2,4 g KH₂PO₄, 80 g NaCl e 2 g KCl a 800 ml di acqua deionizzata. Mescolare con una barra di agitazione su una piastra di agitazione fino a quando i solidi non si sono completamente sciolti. Regolare il volume finale a 1 L con acqua purificata.
      NOTA: Questa soluzione può essere conservata a temperatura ambiente per diversi mesi.
3. Preparazione di 1x PBS
   1. Aggiungere 10 mL di PBS 10x a 90 mL di H 2 O in un_flaconedi vetro sterile. Chiudere bene il coperchio e invertire 3 volte per mescolare.
      NOTA: la soluzione può essere conservata a 4 °C per diverse settimane.
4. Preparazione di fissativo.
   1. Aggiungere 600 μL di metanolo a 200 μL di acido acetico glaciale. Rendi la soluzione fresca ogni volta.
5. Costruzione di una piastra di mastice (una piastra di coltura di tessuto riempita con gomma siliconica)
   1. Mescolare i componenti (1:50) di resina epossidica (1 g) e acqua (50 ml) e versare la miscela in una capsula di Petri. Attendere che i componenti si asciughino prima dell'uso.
      NOTA: Una volta costruito, il piatto di mastice può essere utilizzato per anni.

2. Dissezione della ghiandola (Figura 1A)

1. Raccogli le larve L4 in fase avanzata (~ 10 giorni dopo la schiusa; Figura 2) dai vassoi di alimentazione utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica.
   NOTA: Vedere questo utile manuale online per l'allevamento standard delle zanzare e la coltura larvale¹³.
   1. Posizionare una piastra di mastice sul palco di un microscopio di dissezione e trasferire le larve sulla piastra di mastice.
      NOTA: Quando si aliquotano le larve per la dissezione iniziale, è utile trasferire ~ 10 larve sul vetrino contemporaneamente usando una pipetta di trasferimento di plastica.
2. Posizionare una goccia di soluzione di dissezione (1:3 EtOH:H₂O) sulla piastra di mastice, separata dalle 10 larve.
3. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica o una pipetta di vetro usa e getta per posizionare una larva L4 nella goccia di EtOH del 25%.
4. Prendi una pinza (#5), una in ogni mano, e con la mano non dominante, afferra la testa della larva. Usando la mano dominante, afferrare la larva con una pinza appena sotto la testa e tirare delicatamente con una forza costante minima, in modo tale che la testa si stacchi dal resto del corpo e le ghiandole rimangano attaccate alla testa. Scartare la porzione del corpo della carcassa della larva.
   NOTA: Durante la dissezione, posizionare un tovagliolo di carta nelle vicinanze per raccogliere le carcasse delle larve.
5. Raccogliere la testa / ghiandole in 1 mL di 1x PBS in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Utilizzare 1 mL di PBS per ~ 40 ghiandole sezionate con le loro teste attaccate. Attendere che le testine/SG affondino sul fondo del buffer.

3. Fissazione per la colorazione anticorpale (Figura 1B)

1. Scolare il PBS partendo dalla parte superiore del tubo della microcentrifuga utilizzando una pipetta di trasferimento in vetro, evitando i tessuti appiccicosi delle zanzare e rimuovendo il più possibile la soluzione PBS senza danneggiare i tessuti. Sostituire la soluzione con 800 μL di una miscela 3:1 di metanolo in acido acetico glaciale. Posizionare il tubo a 4 °C durante la notte (12-24 ore consigliate; 19 ore preferite).
2. Il giorno seguente, scolare la soluzione e sostituirla con 1 mL di acetone freddo al 100%. Lasciare per 90 s.
3. Rimuovere l'acetone e risciacquare delicatamente i tessuti tre volte con 1 mL di 1x PBS ogni volta.
   NOTA: i campioni devono fluttuare lentamente verso l'alto con il flusso, quindi ricadere sul fondo del tubo nel momento in cui ogni aggiunta PBS è completa.

4. Immunocolorazione (Figura 1B)

1. Aggiungere l'anticorpo primario (ad es. Rab11) alla diluizione appropriata (1:100) in 200 μL del volume totale di 1x PBS. Ruotare delicatamente il contenuto del tubo con una punta della pipetta. Incubare durante la notte a 4 °C.
2. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare tre volte con 1 mL di 1x PBS (pipettare delicatamente la soluzione dentro e fuori dalla pipetta).
3. Aggiungere l'anticorpo secondario (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) alla diluizione appropriata (1:200) in 200 μL di volume totale. Ruotare delicatamente il contenuto del tubo con una punta della pipetta. Incubare a temperatura ambiente per 90 min.
4. Aggiungere coloranti, come il Rosso Nilo (lipidi, 5 μL di 1 μg/μL) e/o Hoechst (DNA, 3 μL di 1 μg/μL), in 200 μL di PBS in questa fase. Incubare a temperatura ambiente per ulteriori 60 minuti. Lavare delicatamente tre volte con 1x PBS.

5. Montaggio di ghiandole colorate per microscopia (Figura 1C)

1. Pipetta 200 μL di glicerolo al 100% su un vetrino per microscopio.
   NOTA: Poiché il glicerolo è viscoso, lasciare la punta della pipetta nel liquido fino a raggiungere il volume appropriato. Non è stato osservato alcun restringimento dei tessuti quando si va direttamente al 100% di glicerolo. Tuttavia, i ricercatori possono passare attraverso il 30% e il 50% di lavaggi di glicerolo nelle provette prima di spostare i campioni in glicerolo al 100%.
2. Trasferire le teste colorate (fino a 20 per vetrino) con le ghiandole attaccate (insieme ad altre strutture interne) al vetrino del microscopio utilizzando una spazzola morbida (Figura 3A). Distribuire i campioni in modo che siano distribuiti uniformemente lungo il vetrino.
   NOTA: Quando si depositano ghiandole su una diapositiva di copertura con un pennello, è possibile utilizzare una pinza per orientare delicatamente gli SG in modo che siano tutti orientati nella stessa direzione.
3. Osservando al microscopio sezionante, separare la testa larvale dalle ghiandole usando due paia di pinze e tirando con cura i due tessuti in direzioni opposte.
   NOTA: Poiché è difficile isolare completamente gli SG, è sufficiente rimuovere le teste, lasciando gli SG e le strutture interne associate. Anche se gli SG rimangono associati ad altri tessuti, sono facilmente riconoscibili quando colorati con Hoechst e altri marcatori (Figura 3B,C).
4. Rimuovere e scartare le teste e ripetere il processo di separazione per ogni SG.
   NOTA: quando si rimuovono le teste, posizionare un tovagliolo di carta nelle vicinanze per raccoglierle.
5. Posizionare delicatamente un coperchio di 1,5 mm di spessore sulla parte superiore (evitando bolle d'aria) e sigillare con smalto trasparente.
6. Conservare a 4 °C in un contenitore resistente alla luce.
   NOTA: I vetrini preparati delle ghiandole macchiate possono essere mantenuti a 4 °C al buio per un massimo di sei mesi a un anno senza notevoli cambiamenti di qualità. Se il glicerolo inizia a fuoriuscire con il passare dei mesi, sollevare delicatamente il coperchio e la pipetta in più glicerolo per riempire i fori.

Risultati

Le ghiandole salivari sono relativamente facili da sezionare da tutte le larve dello stadio 4. Le larve maschili e femminili possono essere distinte allo stadio larvale L4 tardivo da una striscia rossa lungo il torace dorsale delle femmine ma non dei maschi (Figura 2). Osserviamo anche che la morfologia antennale è molto più elaborata nel maschio che nelle larve L4 femminili (Figura 2), simile alle differenze osservate in questa struttura nelle zanzare adulte....

Discussione

Il protocollo qui descritto è stato adattato da un protocollo di dissezione Drosophila SG e da un protocollo di dissezione delle zanzare adulte^14,15,16. Tuttavia, la maggior parte dei marcatori non è penetrata nella membrana basale (dati non mostrati) quando si utilizzano i metodi di dissezione per adulti e colorazione SG. Gli adattamenti del protocollo per adulti includevano la dissezione delle ghiandole in una soluzione di E...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
KH2PO4	Millipore Sigma	P9791
Na2HPO4 • 2H2O	Millipore Sigma	71643
NaCl	Millipore Sigma	S7653
Acetone	Millipore Sigma	179124
Brush with soft bristles	Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set	B08LH63D89
Cover slips (22 x 50 mm)	VWR	48393-195
DAPI (DNA)	ThermoFisher Scientific	D1306
Ethyl alcohol 200 proof	Millipore Sigma	EX0276
Gilson Pipetman P200 Pipette	Gilson	P200
Glacial Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Jewelers forceps, Dumont No. 5	Millipore Sigma	F6521
KCl	Millipore Sigma	58221
Methanol	Millipore Sigma	1414209
Nail polish	Amazon (Sally Hansen)	B08148YH9M
Nile Red (lipid)	ThermoFisher Scientific	N1142
Paper towels/wipes	ULINE	S-7128
Petri plate (to make putty plate)	ThermoFisher Scientific	FB0875712
Pipette Tips	Gilson	Tips E200ST
Plastic Transfer Pipette	Fisher Scientific	S304671
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab	Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)	ThermoFisher Scientific	A11008
Silicone resin and curing agent for putty plate	Dow Chemicals - Ximeter Silicone	PMX-200
Slides, frosted on one end for labelling	VWR  20 X 50 mm	48393-195
Wheat Germ Agglutinin	ThermoFisher Scientific	W834