Вскрытие и иммуноокрашивание личиночных слюнных желез комаров Anopheles gambiae

Резюме

Слюнная железа взрослого комара (SG) необходима для передачи всех переносимых комарами патогенов их человеческим хозяевам, включая вирусы и паразитов. Это видео демонстрирует эффективную изоляцию SGs от личиночных (L4) стадии комаров Anopheles gambiae и подготовку SGs L4 для дальнейшего анализа.

Аннотация

Слюнные железы комаров (SGs) являются необходимым органом-шлюзом для передачи патогенов, переносимых насекомыми. Болезнетворные агенты, в том числе вирусы и паразиты Plasmodium, вызывающие малярию, накапливаются в секреторных полостях SG-клеток. Здесь они готовы к передаче своим позвоночным хозяевам во время последующей кровяной трапезы. Поскольку взрослые железы формируются как развитие остатков почек личиночного протока SG, которые сохраняются после раннего гистолиза pupal SG, личиночный SG является идеальной мишенью для вмешательств, ограничивающих передачу заболевания. Понимание развития личиночного SG может помочь лучше понять его морфологию и функциональные адаптации и помочь в оценке новых вмешательств, которые нацелены на этот орган. Этот видеопротокол демонстрирует эффективную технику выделения, фиксации и окрашивания личинок SGs от комаров Anopheles gambiae. Железы, рассеченные из личинок в 25% растворе этанола, фиксируют в смеси метанола и ледниковой уксусной кислоты с последующей холодной промывкой ацетоном. После нескольких полосканий в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) SGs могут быть окрашены широким спектром маркерных красителей и / или антисывороток против SG-экспрессированных белков. Этот метод выделения личинок SG также может быть использован для сбора ткани для анализа гибридизации in situ, других транскриптомных применений и протеомных исследований.

Введение

Малярия является серьезной угрозой общественному здравоохранению, вызывающей почти 230 миллионов инфекций и, по оценкам, 409 000 смертей в 2019^{году 1}. Большинство смертей происходит в странах Африки к югу от Сахары и вызваны паразитом Plasmodium falciparum, переносчикомнасекомых которого является Anopheles gambiae,предмет этой видеодемонстрации. Хотя цифры указывают на значительное снижение годового уровня смертности с начала века (>300 000 меньше ежегодных смертей), многообещающее снижение показателей заболеваемости, наблюдаемое с 2000 по 2015 год, сокращается, что свидетельствует о необходимости новых подходов к ограничению передачи^{болезней2.} Среди перспективных дополнительных стратегий борьбы и, возможно, ликвидации малярии — нацеливание на потенциал комаров-переносчиков с использованием редактирования генов на основе CRISPR/Cas9 и генного^{драйва3,4,5.} Действительно, именно борьба с комарами-переносчиками (за счет более широкого использования обработанных инсектицидами надкроватных сеток длительного пользования) оказала наибольшее воздействие на сокращение передачи болезней^6.

Самки комаров приобретают гаметоциты Plasmodium от инфицированного человека во время кровяной трапезы. После оплодотворения, созревания, прохождения эпителия средней кишки, расширения популяции и навигации гемокоэли в их облигатных комарах-хозяевах от сотен до десятков тысяч спорозоитов Plasmodium вторгаются в SG комаров и заполняют секреторные полости составляющих секреторных клеток. Оказавшись внутри секреторных полостей, паразиты имеют прямой доступ к слюнному протоку и, таким образом, готовы к передаче новому хозяину позвоночных при следующем приеме пищи в кровь. Поскольку SG имеют решающее значение для передачи вызывающих малярию спорозоитов их человеческим хозяевам, а лабораторные исследования показывают, что SG не являются необходимыми для кровоснабжения, выживания комаров или плодовитости^7,8,9,они представляют собой идеальную мишень для мер по блокированию передачи. Взрослые комары SGs формируются как развитие остатков «протоковой почки» в личиночных SGs, которые сохраняются за пределами раннего гистолиза pupal SG^10,что делает личиночную SG идеальной мишенью для вмешательств по ограничению передачи заболевания на взрослой стадии.

Характеристика личиночной стадии развития SG может помочь не только лучше понять его морфологию и функциональные адаптации, но также может помочь в оценке новых вмешательств, которые нацелены на этот орган посредством редактирования генов ключевых регуляторов SG. Поскольку все предыдущие исследования архитектуры личиночных слюнных желез предшествовали иммуноокрашиванию и современным методам визуализации^10,11,мы разработали протокол выделения и окрашивания слюнных желез различными антителами и клеточными маркерами^12. Это видео демонстрирует этот подход к извлечению, фиксации и окрашиванию личинок SGs из личинок Anopheles gambiae L4 для конфокальной визуализации.

протокол

1. Подготовка растворов и инструментов

1. Приготовление раствора для рассечения
   1. Для приготовления рассеченного раствора добавляют 2,5 мл 100% этанола к 7,5 мл дистиллированного_H2Oв пластиковой тубе из 15 штук. Переверните трубку 3 раза, чтобы перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких недель.
2. Приготовление 10-кратного запаса фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS)
   1. Чтобы приготовить 10 штоков PBS, добавьте 17,8 г Na₂HPO₄• 2H₂O, 2,4 г KH₂PO_4,80 г NaCl и 2 г KCl до 800 мл деионизированной воды. Перемешать с перемешиванием на перемешиваемой пластине до полного растворения твердых веществ. Отрегулируйте конечный объем до 1 л с очищенной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
3. Подготовка 1x PBS
   1. Добавьте 10 мл 10x PBS к 90 мл_H2Oв стерильной стеклянной бутылке. Плотно закройте крышку и переверните в 3 раза, чтобы перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких недель.
4. Приготовление фиксатора.
   1. Добавьте 600 мкл метанола к 200 мкл ледяной уксусной кислоты. Каждый раз делайте раствор свежим.
5. Конструкция шпаклевочной пластины (тарелка для культивирования тканей, заполненная силиконовой резиной)
   1. Смешайте компоненты (1:50) эпоксидной смолы (1 г) и воды (50 мл) и перелейте смесь в чашку Петри. Подождите, пока компоненты высохнут перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После постройки шпаклевочная пластина может использоваться в течение многих лет.

2. Рассечение железы(рисунок 1А)

1. Собирайте личинок L4 поздней стадии (~10 дней после вылупления; Рисунок 2) из лотков для кормления с использованием пластиковой передаточной пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите это полезное онлайн-руководство по стандартному разведению комаров и культуре личинок¹³.
   1. Поместите шпаклевочную пластинку на ступень рассекающего микроскопа и перенесите личинок на шпаклевочную пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При аликвотировании личинок для первоначального рассечения полезно перенести ~ 10 личинок на слайд за один раз с помощью пластиковой переносной пипетки.
2. Поместите каплю раствора для рассечения (1:3 EtOH:H₂O) на шпаклевочную пластину отдельно от 10 личинок.
3. Используйте пластиковую переносную пипетку или одноразовую стеклянную пипетку, чтобы поместить одну личинку L4 в 25% каплю EtOH.
4. Возьмите щипцы (No 5), по одному в каждой руке, и недоминирующей рукой захватите голову личинки. Используя доминантную руку, схватите личинку щипцами чуть ниже головы и осторожно потяните с минимальной постоянной силой, чтобы голова отделялась от остальной части тела, а железы оставались прикрепленными к голове. Отбросьте часть тела туши личинки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При вскрытии установите бумажное полотенце рядом, чтобы собрать туши личинок.
5. Соберите головные железы в 1 мл 1x PBS в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл. Используйте 1 мл PBS для ~ 40 рассеченных желез с прикрепленными головками. Подождите, пока головки/СГ опустятся на дно буфера.

3. Фиксация для окрашивания антителами(рисунок 1B)

1. Дренируйте PBS, начиная с верхней части трубки микроцентрифуги, используя стеклянную передаточную пипетку, избегая липких тканей комара и удаляя как можно больше раствора PBS, не повреждая ткани. Замените раствор 800 мкл смеси метанола 3:1 с уксусной кислотой ледниковой. Поместите в тубу при температуре 4 °C на ночь (рекомендуется 12-24 ч; предпочтительно 19 ч).
2. На следующий день слейте раствор и замените его 1 мл холодного 100% ацетона. Оставьте на 90 с.
3. Удалите ацетон и осторожно промойте ткани три раза по 1 мл 1x PBS каждый раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны медленно всплывать вместе с потоком, а затем падать обратно на дно трубы к моменту завершения каждого добавления PBS.

4. Иммуноокрашивание(рисунок 1B)

1. Добавляют первичное антитело (например, Rab11) в соответствующем разведении (1:100) в 200 мкл от общего объема 1x PBS. Аккуратно покрутите содержимое трубки кончиком пипетки. Инкубировать в течение ночи при 4 °C.
2. Удалите раствор первичного антитела и трижды промыть 1 мл 1x PBS (осторожно пипетку в пипетку и из нее).
3. Добавляют вторичное антитело (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) в соответствующем разведении (1:200) в 200 мкл общего объема. Аккуратно покрутите содержимое трубки кончиком пипетки. Инкубировать при комнатной температуре в течение 90 мин.
4. Добавьте красители, такие как Nile Red (липиды, 5 мкл 1 мкг/мкл) и/или Hoechst (ДНК, 3 мкл 1 мкг/мкл), в 200 мкл PBS на этом этапе. Инкубировать при комнатной температуре еще 60 мин. Аккуратно вымойте три раза с 1x PBS.

5. Монтаж окрашенных желез для микроскопии(рисунок 1С)

1. Пипетка 200 мкл 100% глицерина на предметном стекле микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку глицерин вязкий, оставьте кончик пипетки в жидкости до тех пор, пока он не достигнет соответствующего объема. Не наблюдалось сокращения тканей при переходе прямо в 100% глицерин. Тем не менее, исследователи могут пройти через промывки 30% и 50% глицерина в пробирках, прежде чем перемещать образцы в 100% глицерин.
2. Перенесите окрашенные головки (до 20 на слайд) с прикрепленными железами (вместе с другими внутренними структурами) на предметное стекло микроскопа с помощью мягкой кисти(рисунок 3А). Распределите образцы так, чтобы они равномерно распределились по стеклянной горке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При отложении желез на затворе щеткой щипцы можно использовать для мягкой ориентации СГ так, чтобы все они были ориентированы в одном направлении.
3. Рассматривая под рассекающим микроскопом, отделите личиночную головку от желез с помощью двух пар щипцов и осторожно потяните две ткани в противоположных направлениях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку трудно полностью изолировать СГ, просто удалите головки, оставив СГ и связанные с ними внутренние структуры. Даже если SG остаются связанными с другими тканями, они легко распознаются при окрашивании Hoechst и другими маркерами(Рисунок 3B,C).
4. Снимите и выбросьте головки и повторите процесс разделения для каждого SG.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При снятии головок установите бумажное полотенце рядом, чтобы собрать их.
5. Аккуратно поместите сверху обшивку толщиной 1,5 мм (избегая пузырьков воздуха) и запечатайте прозрачным лаком для ногтей.
6. Хранить при температуре 4 °C в светонепроницаемом контейнере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленные слайды окрашенных желез можно хранить при температуре 4 °C в темноте от шести месяцев до одного года без каких-либо заметных изменений качества. Если глицерин начинает просачиваться с течением месяцев, осторожно поднимите крышку и пипетку в большее количество глицерина, чтобы заполнить отверстия.

Результаты

Слюнные железы относительно легко рассекаются от всех личинок 4 стадии. Личинки самцов и самок можно отличить на поздней личиночной стадии L4 по красной полосе вдоль спинной грудной клетки самок, но не самцов(рисунок 2). Мы также наблюдаем, что антеннальная морфология гор?...

Обсуждение

Протокол, описанный в настоящем описании, был адаптирован из протокола рассечения Drosophila SG и протокола рассечения взрослых комаров^14,15,16. Однако большинство маркеров не проникали через базальную мембрану (данные не показаны) при использ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
KH2PO4	Millipore Sigma	P9791
Na2HPO4 • 2H2O	Millipore Sigma	71643
NaCl	Millipore Sigma	S7653
Acetone	Millipore Sigma	179124
Brush with soft bristles	Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set	B08LH63D89
Cover slips (22 x 50 mm)	VWR	48393-195
DAPI (DNA)	ThermoFisher Scientific	D1306
Ethyl alcohol 200 proof	Millipore Sigma	EX0276
Gilson Pipetman P200 Pipette	Gilson	P200
Glacial Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Jewelers forceps, Dumont No. 5	Millipore Sigma	F6521
KCl	Millipore Sigma	58221
Methanol	Millipore Sigma	1414209
Nail polish	Amazon (Sally Hansen)	B08148YH9M
Nile Red (lipid)	ThermoFisher Scientific	N1142
Paper towels/wipes	ULINE	S-7128
Petri plate (to make putty plate)	ThermoFisher Scientific	FB0875712
Pipette Tips	Gilson	Tips E200ST
Plastic Transfer Pipette	Fisher Scientific	S304671
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab	Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)	ThermoFisher Scientific	A11008
Silicone resin and curing agent for putty plate	Dow Chemicals - Ximeter Silicone	PMX-200
Slides, frosted on one end for labelling	VWR  20 X 50 mm	48393-195
Wheat Germ Agglutinin	ThermoFisher Scientific	W834