Gram-pozitif bakteriyel büyümenin küçük moleküllü bir inhibitörü olan masarimisinin sentezi

Özet

Hücre duvarı bozulmasını hedefleyerek Bacillus subtilis ve Streptococcus pneumoniae'nin büyümesini engelleyen küçük moleküllü bir prob olan bakteriyostatik diamide masarimycin'in hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Kimyasal bir prob olarak uygulanması, sinerji / antagonizma tahlillerinde ve B. subtilis ve S. pneumoniae ile morfolojik çalışmalarda gösterilmiştir.

Özet

Bakterilerin hücre duvarındaki peptidoglikan (PG), şekil veren ve çevredeki ortamdan koruma sağlayan benzersiz bir makromoleküler yapıdır. Hücre büyümesini ve bölünmesini anlamanın merkezinde, PG bozunmasının biyosentezi ve hücre duvarı montajını nasıl etkilediği bilgisi vardır. Son zamanlarda, PG'nin modifiye şekerlerin veya amino asitlerin eklenmesiyle metabolik etiketlenmesi bildirilmiştir. Küçük molekül inhibitörleri ile biyosentetik adımların kimyasal sorgulanması mümkün olsa da, otolizinler tarafından PG bozunmasını incelemek için kimyasal biyoloji araçları az gelişmiştir. Bakteriyel otolizinler, PG'nin sıkı bir şekilde koordine edilmiş bozunmasında rol oynayan geniş bir enzim sınıfıdır. Burada, Bacillus subtilis'te N-asetilglukozamidaz LytG'nin bir inhibitörü olan küçük moleküllü bir prob olan masarimycin'in ve Streptococcus pneumoniae'de hücre duvarı metabolizmasının hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. İnhibitörün mikrodalga yardımlı ve klasik organik sentez yoluyla hazırlanması sağlanır. Biyolojik tahlillerde Gram-pozitif fizyolojiyi incelemek için bir araç olarak uygulanabilirliği sunulmaktadır.

Giriş

Peptidoglikan (PG), hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakterilerde hücre şeklini ve yapısını tanımlayan ağ benzeri bir polimerdir ^1,2. Bu heteropolimer, β-(1,4)-bağlı alternatif N-asetilglukozamin (GlcNAc) ve N-asetilmuramik asit (MurNAc) kalıntılarından oluşan bir omurgaya sahip kısa peptitler 3,4,5,6 ile çapraz bağlanmış bir amino şeker matrisidir (Şekil 1)1. MurNAc'nin C-3 laktil moiety'sine bağlı kök peptididir. PG'nin metabolizması, hücre duvarına yeni materyal dahil etmek için sıkı bir şekilde koordine edilmiş bir biyosentetik ve degradatif enzim sistemini içerir ^7,8. PG'nin parçalanması, topluca otolizinler⁹ olarak adlandırılan enzimler tarafından gerçekleştirilir ve ayrıca bölünen bağın özgüllüğüne göre sınıflandırılır. Otolizinler hücre büyümesi, hücre bölünmesi, hareketlilik, PG olgunlaşması, kemotaksis, protein sekresyonu, genetik yeterlilik, farklılaşma ve patojenite gibi birçok hücresel sürece katılır^10,11. Bireysel otolizinlerin spesifik biyolojik fonksiyonlarını çözmek, kısmen fonksiyonel fazlalık nedeniyle göz korkutucu olabilir. Bununla birlikte, son biyofiziksel 8,12,13 ve hesaplamalı çalışmalar ^12, PG metabolizmasındaki rolleri hakkında yeni bilgiler sağlamıştır. Ek olarak, son raporlar PG metabolizmasındaki sentez¹⁴ ve membran aracılı^15,16,17 adım hakkında daha fazla bilgi sağlamıştır. PG metabolizmasının degradatif ve sentetik yolları arasındaki ilişkinin tam olarak anlaşılması, daha önce kullanılmayan antibiyotik hedeflerine yol açabilir.

Ökaryotlarda glikobiyolojiyi incelemek için metodolojide önemli ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, bakteriyel glikobiyoloji ve özellikle PG metabolizması benzer bir oranda ilerlememiştir. PG metabolizmasını incelemek için mevcut kimyasal yaklaşımlar arasında floresan olarak etiketlenmiş antibiyotikler¹⁸, floresan problar^19,20 ve metabolik etiketleme 21,22,23,24 bulunmaktadır. Bu yeni yaklaşımlar, bakteriyel hücre duvarı metabolizmasını sorgulamak için yeni yollar sunmaktadır. Bu stratejilerden bazıları PG'yi in vivo olarak etiketleyebilse de, türe özgü¹⁹ olabilir veya yalnızca belirli bir otolizin^25'ten yoksun suşlarda çalışabilir. Birçok PG etiketleme stratejisi, izole hücre duvarları 26 veya in vitro yeniden yapılandırılmış PG biyosentez yolları^20,27,28 ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Floresan etiketli antibiyotiklerin kullanımı şu anda biyosentetik adımlar ve transpeptitasyon^{18 ile sınırlıdır}.

Bakteriyel otolizinler ve hücre duvarı metabolizmasındaki rolleri hakkındaki güncel bilgiler genetik ve in vitro biyokimyasal analizlerden gelmektedir 11,29,30,31,32. Bu yaklaşımlar bu önemli enzim sınıfı hakkında zengin bir bilgi sağlamış olsa da, biyolojik rollerini deşifre etmek zor olabilir. Örneğin, fonksiyonel artıklık³³ nedeniyle, çoğu durumda bir otolizinin silinmesi bakteriyel büyümenin durmasına neden olmaz. Bu, hücre büyümesi ve bölünme ^7,12'deki zımni rollerine rağmen. Diğer bir komplikasyon ise, bakteriyel otolizinlerin genetik olarak silinmesinin meta-fenotiplere yol açabilmesidir³⁴. Meta-fenotipler, genetik delesyondan etkilenen yol ile diğer birbirine bağlı yollar arasındaki karmaşık etkileşimden kaynaklanır. Örneğin, bir meta-fenotip, bir enzimin eksikliği gibi doğrudan bir etki veya düzenleyicilerin bozulması gibi dolaylı bir etki yoluyla ortaya çıkabilir.

Şu anda, PG'nin parçalanmasını incelemek için kimyasal problar olarak kullanılabilen N-asetilglukozaminidazlar (GlcNAcase) ve N-asetilmuramidazlar gibi glikozidaz otolizinlerinin sadece birkaç inhibitörü vardır. Bunu ele almak için, diamid masarimycin (daha önce fgkc olarak adlandırılan), GlcNAcase LytG^32'yi hedef alan Bacillus subtilis büyümesinin bakteriyostatik bir inhibitörü olarak³⁵ tanımlanmış ve karakterize edilmiştir (Şekil 1). LytG, glikozil hidrolaz ailesi 73 (GH73) içindeki küme 2'nin bir üyesi olan ekzo-etkili bir GlcNAcase^36'dır. Vejetatif büyüme sırasında ana aktif GlcNAcase'dir³². Bildiğimiz kadarıyla, masarimycin, hücresel büyümeyi inhibe eden PG etkili bir GlcNAcase'in ilk inhibitörüdür. Streptococcus pneumoniae ile masarimycin üzerine yapılan ek çalışmalar, masarimycin'in muhtemelen bu organizmada hücre duvarı metabolizmasını inhibe ettiğini bulmuştur³⁷. Burada, masarimycin'in hazırlanmasının, Gram-pozitif organizmalar B. subtilis ve S. pneumoniae'de fizyolojiyi incelemek için kimyasal bir biyoloji probu olarak kullanılması için rapor edilmiştir. Masarimisin ile minal-minimum inhibitör konsantrasyon tedavisinin morfolojik analizinin yanı sıra bir sinerji / antagonizma testi örnekleri sunulmuştur. İyi tanımlanmış etki modlarına sahip antibiyotiklerin kullanıldığı sinerji ve antagonizma testleri, hücresel süreçler arasındaki bağlantıları araştırmak için yararlı bir yol olabilir^38,39,40.

Protokol

1. Genel yöntemler

NOT: Tüm bileşikler standart tedarikçilerden satın alınmış ve daha fazla saflaştırma yapılmadan kullanılmıştır.

1. Silika jel XG F254 ile önceden kaplanmış bir alüminyum plaka üzerinde ince tabaka kromatografisi (TLC) gerçekleştirin. UV lambasının altındaki lekeleri, p-anisaldehit lekesine daldırarak veya I₂ buharına maruz bırakarak tespit edin.
2. Tüm nükleer manyetik rezonans (NMR) spektrumlarını 400 MHz spektrometreye kaydedin.
   NOT: ¹H- NMR ve ¹³C-NMR spektrumu, artık çözücü piklerine atıfta bulunulmuştur. Kaplin sabitleri [Hz] cinsinden ve kimyasal kaymalar [ppm] cinsinden verilir.
3. Masarimisinin atmosferik basınçlı kimyasal iyonizasyon (APCI) kütle spektrometri spektrumlarını, atmosferik katı madde analiz probu ile donatılmış kompakt bir kütle spektrometresine kaydedin.

2. Masarimisin hazırlanması için genel prosedür

NOT: Aşağıdaki adımları bir duman davlumbazında uygulayın.

1. Her reaktandan metanolünde 0.1 M'lik bir çözelti hazırlayın: sikloheksilamin, sikloheksil karboksidaldehit, o-iyodobenzoik asit ve sikloheksil izosiyanür³⁵.
   DİKKAT: Sikloheksilamin, sikloheksil izosiyanür ve sikloheksil karboksaldehit yanıcıdır. Cilt korozyonuna neden olabilir ve oral, dermal, solunum veya üreme toksisitesine neden olabilirler. Bileşikleri açık alevlerden, sıcak yüzeylerden ve ateşleme kaynaklarından uzak tutun. Uygun cilt ve göz koruması kullanın, iyi havalandırılan bir alanda çalışın ve buhar veya buğu solumaktan kaçının. Depolama için, şişeleri sıkıca kapalı tutun ve serin ve kuru bir yerde saklayın. Sikloheksil karboksaldehiti N₂ atmosferi altında bir kurutucuda saklayın.
2. Kapaklı yuvarlak tabanlı bir şişede 5 mL sikloheksilamin (metanol içinde 0,1 M çözelti) ve 5 mL sikloheksil karboksaldehit (metanol içinde 0,1 M) karıştırın ve çözeltiyi bir kum banyosunda 40 °C'de 30 dakika boyunca karıştırın/sıcak plaka üzerinde manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak karıştırın. Kum yüzeyinin yaklaşık 1 cm altına yerleştirilmiş bir termometre kullanarak sıcaklığı izleyin.
3. 30 dakika sonra, 2.2. adımdan itibaren çözeltiye 5 mL sikloheksil izosiyanür (metanol içinde 0.1 M çözelti) ekleyin ve 50 ° C'de 20 dakika daha karıştırın. Son olarak, reaksiyon karışımına 5 mL o-iyodobenzoik asit (metanol içinde 0.1 M çözelti) ekleyin ve 3-5 saat boyunca 55 ° C'de karıştırmaya devam edin.
4. Yukarıdaki reaksiyon karışımı 3 saat boyunca karıştırıldıktan sonra yaklaşık her saat önce TLC ile reaksiyonun ilerlemesini periyodik olarak izleyin.
5. 3 cm x 6 cm'lik alüminyum destekli TLC plaka şeridini kesin. 2 numaralı bir kalem kullanarak, alttan yaklaşık 1 cm uzakta bir çizgi çizin. Bir cam mikrokılcal damar kullanarak, reaksiyon karışımının yaklaşık 5 μL'sini TLC plakasına yerleştirin ve kurumasını bekleyin.
6. 150 mL'lik bir behere, kabın tabanını örtmek için yeterli mobil faz (90:10 hekzan: izopropanol) ekleyin. Bir çift cımbız kullanarak, yukarıdaki TLC plakasını dikkatlice beherin içine yerleştirin ve TLC plakasının mobil faza eşit şekilde girmesini sağlayın. Beherin üstünü bir parça infoil ile örtün.
   NOT: Mobil fazın çizgiyi ve lekeli numuneyi örtmediğinden emin olun.
7. Mobil fazın, plakanın üst kısmının yaklaşık 1 cm altına gelene kadar TLC plakasından yukarı doğru hareket etmesine izin verin. TLC plakasını çıkarın ve bir kalem kullanarak, mobil fazın kat ettiği mesafeyi gösteren bir çizgi çizin. TLC plakasının bir duman davlumbazında kurumasını bekleyin.
8. Kuruduktan sonra, TLC plakasını az miktarda katı I₂ içeren bir beherin içine yerleştirin ve beheri bir parça teneke folyo ile örtün. TLC'yi sarı/kahverengi lekelerin gelişimi açısından izleyin. Geliştirildikten sonra, TLC plakasını çıkarın ve bir kalem kullanarak lekelerin yerini işaretleyin (Ek Şekil 1).
   NOT: I₂ leke işaretlenmezse, leke zamanla dağılır. Lekeler ayrıca TLC plakasında UV ışığı, p-anisaldehit boyama veya potasyum permanganat boyama ile görselleştirilebilir (Ek Bilgilere bakınız).
9. Aşağıdaki formülü kullanarak görselleştirilmiş tüm noktalar için R_f değerlerini hesaplayın:
   R_f =
10. TLC plakasında R_f = 0.3 ile sadece bir nokta göründüğünde reaksiyonun tamamlandığını düşünün. Çözücüyü düşük basınç altında döner bir evaporatörde çıkarın ve ham ürünü (sarımsı-kahverengi bir yağ olarak elde edilir) tüm metanol buharlaşana kadar yüksek bir vakum altında kurutun.
11. Kurutulmuş ham ürünü 30 mL etil asetat içinde çözün ve bir ayırma hunisine aktarın. Etil asetat sırasıyla 1 M HCl (2 x 30 mL), H 2 O (30 mL), doymuş NaHCO 3 çözeltisi (2 x 30 mL_{), H 2O (}30 mL) ve doymuş NaCl çözeltisi (2 x₃₀ mL) ile ekstrakte edin. Sulu tabakaları atın.
    NOT: Etil asetat tabakası, ekstraksiyonların her birinde üst tabakadır. Her ekstraksiyon için, etil asetat ve sulu çözelti (HCl, H₂O, NaHCO₃ veya NaCl) içeren ayırma hunisini kuvvetlice sallayın ve katmanların tamamen ayrılmasına izin verin.
12. Etil asetat tabakasını ayırıcı huniden çıkarın ve bir Erlenmeyer şişesinde toplayın. Etil asetattan kalan suyu gidermek için Na₂SO₄ (susuz) dolu bir spatula ekleyin.
    NOT: Şişedeki Na₂SO₄ serbestçe çalıştığında ve kümelenmediğinde etil asetat çözeltisi kuru olarak kabul edilir. Na 2 SO4 kümeleniyorsa, ek bir Na₂SO₄ spatulası eklenebilir.
13. Na₂SO 4'ü çıkarmak için kurutulmuş etil asetat çözeltisini #1 filtre kağıdından_süzün. Filtre kağıdını az miktarda etil asetat ile yıkayın. Filtrelenmiş etil asetat çözeltisini yuvarlak tabanlı bir şişeye yerleştirin ve tüm etil asetat çıkarıldıktan sonra masarimisin yağ olarak elde etmek için çözücüyü düşük basınç altında döner bir evaporatör üzerinde çıkarın.
14. Yukarıda elde edilen masarimisin yağını minimum miktarda (1-2 mL) 9: 1 hekzan: izopropanol içinde çözün ve tüm bileşik çözülene kadar manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın.
15. Çözünmüş masarimycin'i 12 g normal faz silika flaş sütunu kullanarak flaş kromatografisi ile saflaştırın.
    1. Flaş kolonunu 10 sütun hacimli mobil fazla (99:1 hekzan: izopropanol) dengeleyin ve cihaz 15 mL/dak akış hızına ayarlayın.
       NOT: Dengeleme tamamlandıktan sonra, akışı durdurun ve sütunun üst kısmını sistemden ayırın.
    2. 5 mL'lik bir şırınga kullanarak çözünmüş masarimycin hazırlayın. Şırıngayı doğrudan dengelenmiş flaş sütununun üstüne bağlayın ve çözeltiyi sütuna enjekte edin. Yüklenen sütunu flaş kromatografisi sistemine yeniden bağlayın ve gradyan elüsyonunu başlatın.
    3. Gradyan elüsyonu kullanarak kolondan 10:90 hekzanlı son mobil faz konsantrasyonuna kadar masarimycin'i elute: 12 sütun hacmi üzerinde izopropanol. Masarimisin elüsyonunu 230 ve 254 nm'de absorpsiyon yoluyla izleyin.
    4. Kolondan salınan bileşikleri, fraksiyon başına 20 mL çözücü toplayan bir fraksiyon toplayıcı ile toplayın.
       NOT: Bir flaş kromatografi sistemi mevcut değilse, masarimisin saflaştırılması 3: 1 (hekzan: etil asetat) mobil fazlı bir yerçekimi silika sütunu aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Masarimisin içeren fraksiyonlar, aynı mobil faz kullanılarak TLC ile tanımlanabilir. TLC lekelerinin görselleştirilmesi UV ışığı, I₂ buharı veya potasyum permanganat boyama ile yapıldı.
    5. Atmosferik katı madde analiz probu ile donatılmış kompakt bir kütle spektrometresinde TLC (adım 2.5-2.9) veya kütle spektrometresi içeren fraksiyonları tanımlayın. Nihai ürünü vakum altında (~ 0,3 mbar) kurutun.
       NOT: Masarimisin rutin olarak renksiz bir yağ veya katı olarak, reaksiyona eklenen sikloheksil karboksaldehit mmol ile ilgili olarak% 55-70 verim ile elde edilir. Saflaştırılmış masarimycin'in kütlesini elde ederek ve aşağıdaki formülü kullanarak reaksiyonun teorik verimini hesaplayarak masarimycin'in nihai verimini hesaplayın:
       % verim = x %100
16. NMR tarafından masarimycin'in yapısını onaylayın.
    1. ~ 10 mg masarimisin örneğini 0.5 mL CDCl₃ içinde çözün. Bir Pasteur pipet kullanarak, çözeltiyi 5 mm'lik bir NMR tüpüne aktarın ve tüpü kapatın. NMR tüpünü spektrometreye yerleştirin.
    2. ^{Üretici tarafından}önceden ayarlanmış deneyleri kullanarak 1 H ve ¹³C NMR spektrumları elde edin. Kimyasal kayma atamaları ve temsili spektrumlar Ek Şekil 3-4'te verilmiştir.
17. Masarimisin kuru veya DMSO'da (25 mM son konsantrasyon) çözünmüş olarak -20 °C'de kullanıma kadar saklayın.

3. Masarimisin hazırlanması için mikrodalga prosedürü

1. Asetonitrilde 0.6 M sikloheksilamin, sikloheksil karboksaldehit, sikloheksil izosiyanür ve o-iyodobenzoik asit çözeltileri hazırlayın.
2. Bir cam mikrodalga reaksiyon şişesine bir karıştırma çubuğu ve 10 mL asetonitril ekleyin.
3. Şişeye 2 mL sikloheksilamin (asetonitrilde 0.6 M), 2 mL sikloheksil karboksaldehit (asetonitrilde 0.6 M) ve 7 mL asetonitril ekleyin.
4. Mikrodalga reaksiyon şişesini mikrodalga karuseline yerleştirin. Karışımı karıştırın, 400 W'lık bir güç ayarında 50 ° C'de 30 dakika ısıtın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
5. Şişeye 2 mL o-iyodobenzoik asit (metanosolda 0.6 M) ve 2 mL sikloheksil izosiyanür (asetonitrilde 0.6 M) ekleyin. Karışımı karıştırın, mikrodalgada 400 W'lık bir güç ayarında 40 dakika boyunca 100 ° C'ye ısıtın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
6. Adım 3.5'in tamamlanmasından sonra I₂ buharı kullanarak TLC (90:10 hekzan: izopropanol) ile reaksiyonun ilerlemesini izleyin.
   NOT: TLC, reaksiyonun eksik olduğunu gösteriyorsa (yani, TLC üzerinde birden fazla nokta), reaksiyon şişesini mikrodalgaya geri yerleştirin ve adım 3.5'te açıklanan mikrodalga koşullarını ayarlayın.
7. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, çözeltiyi 100 mL'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye dökün ve döner bir evaporatör kullanarak kuruluğa kadar buharlaştırın.
8. Masarimisinin sulu çalışmasını, saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu tamamlamak için yukarıdaki 2.6-2.16 adımlarını izleyin.

4. Sinerji ve antagonizma testi

1. Streptococcus pneumoniae R6'yı, anaerobik koşullar altında 37 ° C'de% 5 (v / v) koyun kanı içeren Mueller-Hinton (MH) agar plakalarında büyütün. Tüm deneylerde, OD_{600 ~ 0.4} olana kadar anaerobik koşullar altında 37 ° C'de 5 mL MH suyunda yetiştirilen ikinci geçiş hücrelerini kullanın.
2. Masarimisin ve optochin inhibitörlerini ilgili çözücülerde seri 1: 2 seyreltmelere maruz bırakın, elde edilen konsantrasyonlar her bir inhibitörün minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) değerlerini çevreler.
   1. 100 μM'lik bir konsantrasyona ulaşılana kadar masarimisin dimetil sülfoksit (DMSO) içindeki ilk seyreltmesini yapın. Bu noktadan itibaren, MH suyunda masarimycin seyreltmeleri yapın. Ticari olarak temin edilebilen optochin'i (bakınız Malzeme Tablosu) steril MH et suyunda eriterek optochin stok çözeltisi (3,5 mM) hazırlayın.
      NOT: Masarimisin stok çözümleri DMSO'da 25 mM'de yapılmıştır.
3. Steril bir 96 kuyucuklu mikrotitre plakasına, plakanın her sırasına her optochin seyreltmesinin 2 μL alikotunu ekleyin. Aynı plakaya, plaka üzerinde bir dizi optoksin ve masarimisin konsantrasyonu oluşturmak için her sütuna her masarimycin seyreltmesinin 2 μL alikotunu ekleyin (Şekil 2).
4. Yukarıdaki inhibitörleri içeren her bir oyuğa steril MH suyu (93 μL) ekleyin. Mikrotitre plakalarını adım 4.1'den itibaren 5 μL kültür (OD₆₀₀ ~ 0.4) ile aşılayın.
   NOT: 96 delikli plakanın aşılanması tipik olarak anaerobik bir iş istasyonunda anaerobik koşullar altında yapılır. Kuyudaki son hacim 100 μL'dir.
5. Anaerobik koşullar altında 37 ° C'de 18 saat boyunca kültürleri büyütün, ardından 30 μL% 0.01 (m / v) resazurin sodyum tuzu çözeltisi ilavesi yapılır. Renk oluşumuna ve stabilizasyonuna izin vermek için plakayı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
   NOT: Resizrin çözeltisi, bileşiğin damıtılmış suda çözülmesiyle hazırlanır ve iki haftaya kadar 4 ° C'de saklanabilir.
6. Konsantrasyon değerlerini doğrudan plakadan okuyun ve bakteriyel büyümenin gözlenmediği en düşük inhibitör konsantrasyonunu (mavi renk) [X] olarak atayın (bkz. adım 4.7.1), yani yardımcı ilacın varlığında ilacın en düşük inhibitör konsantrasyonu.
   NOT: Pozitif bakteri büyümesi, pembeye dönüşen resazurin boyası ile kuyucuklarda tanımlanır. Tek başına her ilacın MIC değerleri (yani, yardımcı ilacın yokluğunda), her bir ilaçla ayrı ayrı resazurin MIC testi³⁵ kullanılarak benzer şekilde belirlenir (Ek Şekil 5). S. pneumoniae'deki MIC'ler, masarimycin ve optochin için sırasıyla 7.8 μM ve 15.85 μM'dir.
7. Aşağıdaki denklemleri kullanarak fraksiyonel inhibitör konsantrasyonunu (FIC) ve FIC indeksini (FIC_I) belirleyin.
   1. FIC= [X]/MIC x, burada [X] (adım 4.6'dan itibaren), yardımcı ilacın varlığında ilacın en düşük inhibitör konsantrasyonudur ve MIC_x, yardımcı ilacın yokluğunda ilacın en düşük inhibitör konsantrasyonudur.
   2. FIC_I = FIC_masarimycin + FIC_antibiyotik
      NOT: FIC I < 0.5 = sinerjik, 0.5 < FIC I < 1 = katkı maddesi, 1 < FIC I < 4 = kayıtsız, FIC _I > 4 = antagonistik.

5. Morfolojik çalışma

1. 37 °C'de %1,5 Bacto agar içeren Luria-Bertani (LB) agar plakalarında (10 g/L tripton, 5 g/L maya ekstresi ve 5 g/L NaCl) Bacillus subtilis 11774 yetiştirin. Tüm deneylerde, OD₆₀₀ = 1'e kadar 37 ° C'de 5 mL LB suyunda yetiştirilen ikinci geçiş hücrelerini kullanın. S.pneumoniae'yi adım 4.1'deki gibi büyütün.
2. B. subtilis için OD 600nm = 1 veya S. pneumoniae için OD_600nm = 0.4 ile bir hücre kültürü yoğunluğu elde ettikten sonra, 3.8 μM (B.subtilis için 0.75x MIC) veya 5.85 μM (S.pneumoniae için 0.75x MIC) nihai konsantrasyonuna "işlenmiş" etiketli kültür tüpüne bir pipet kullanarak masarimycin ekleyin. "Kontrol" etiketli ikinci kültür tüpüne eşdeğer bir DMSO hacmi ekleyin.
3. B.subtilis için, numuneleri 150 rpm'de çalkalama ile 90 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. S. pneumoniae için, anaerobik koşullar altında titremeden hücreleri inkübe edin.
4. 90 dakika sonra, kültürleri 1:10 karışım (v / v) kültür ortamı ve sabitleme tamponunda (20 mM HEPES,% 1 formaldehit (pH 6.8)) gece boyunca 4 ° C'de kimyasal olarak sabitleyin. Sabitleme tamamlandıktan sonra, pipet kullanarak cam mikroskop slaytlarına 10-20 μL numune uygulayın ve havanın kurumasını bekleyin. Cam slaytları bir Bunsen brülörü kullanarak ısıtarak hava ile kurutulmuş numuneleri sabitleyin.
5. Isıl sabitlemeden sonra, numuneleri% 0.1 (m / v) metilen mavisi (% 20 (v / v) etanolde çözelti) 100 μL ilavesiyle lekeleyin. Lekeli slaytları 10 dakika boyunca inkübe edin ve fazla boyayı dH₂O ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri ortak bir odak düzlemine getirmek için lekeli slaytları bir fırında 15-20 dakika boyunca 60 ° C'ye hafifçe ısıtın.
6. Lekeli numuneleri, lekeli hücrelerin üzerine mikroskop kapağı yerleştirerek kapatın. Ardından, mikroskop slayt çimentosu kullanarak kenarları kapatın. Kapalı mikroskop slaytını mikroskop aşamasına yerleştirin ve parlak alan mikroskobu kullanarak görüntüyü 100x büyütmede odaklayın.
7. Mikroskop slaytına bir damla daldırma yağı yerleştirin ve 1000x büyütme kullanarak görüş alanını odaklamaya getirin. Mikroskopa ve ilgili yazılıma bağlı bir kamera kullanarak mikrograflar edinin. Yazılımdaki otomatik beyaz dengesi ve diyafram ayarlarını kullanarak görüntüler elde edin.
   NOT: Alternatif olarak, görüntüler açık kaynaklı ImageJ yazılımı kullanılarak işlenebilir.

Sonuçlar

Masarimisin, B. subtilis ve S. pneumoniae'nin küçük moleküllü bakteriyostatik inhibitörüdür ve B. subtilis^35,37'de ekzo-etkili GlcNAcase LytG'yi inhibe ettiği ve S. pneumoniae^37'de hücre duvarını hedef aldığı gösterilmiştir. Masarimisin, klasik veya mikrodalga destekli organik sentez ile% 55 -% 70 aralığında verimlerle verimli bir şekilde hazırlanabilir. Mikrodalga destekli sentez,...

Tartışmalar

Masarimisin, B. subtilis³⁵ ve S. pneumoniae³⁷ büyümesinin tek bir mikromolar bakteriyostatik inhibitörüdür. B. subtilis'te , masarimycin'in GlcNAcase LytG^35'i inhibe ettiği gösterilirken, S. pneumoniae'nin hücre duvarındaki kesin moleküler hedef tanımlanmamıştır³⁷. Klasik organik sentez veya mikrodalga prosedürü kullanılarak masarimisin sentezi, inhibitörün iyi verim ve yüksek saf...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Iodobenzoic acid	SIGMA-ALDRICH	I7675-25G	corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	109827-4L	flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile	SIGMA-ALDRICH	34851-4L	flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates	Sorbtech	4434126	silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d	SIGMA-ALDRICH	151823-50G	solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer	Advion-Interchim	Advion CMS	compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile	fisher chemical	07-200-90	for synergy/antagonism assays
cover slips	fisher chemical	12-547	for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde	CHEM-IMPEX INT'L INC.	24451	flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide	SIGMA-ALDRICH	133302-5G	irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine	SIGMA-ALDRICH	240648-100ML	corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate	SIGMA-ALDRICH	537446-4L	flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g)	Advion-Interchim	PF-50SIHP-F0012	pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde	SIGMA-ALDRICH	F8775-25ML	fixing agent for microscopy
HEPES	SIGMA-ALDRICH	H8651-25G	buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers	SIGMA-ALDRICH	178918-4L	environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer	Advion	expression	Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac	eppendorf	Vacufuge plus	vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	258148-2.5L	corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	320331-2.5L	strong acid
immersion oil	fisher chemical	12-365-19	for microscopy
Iodine, resublimed crystals	Alfa Aesar	41955	environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova	MestreLab Research		software for processing NMR spectra
Methanol	SIGMA-ALDRICH	439193-4L	flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue	SIGMA-ALDRICH	M9140-25G	microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood	fisher chemical	B21176X	growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth	fisher chemical	DF0757-17-6	growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides	fisher chemical	22-310397	for microscopy
Microwave Synthesis Labstation	MILESTONE	START SYNTH	device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes	SIGMA-ALDRICH	Z562769-5EA	5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR)	Bruker	Ascend 400	large superconducting magnet (400MHz)
optochin	fisher chemical	AAB21627MC	ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates	Celltreat	229695	for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera	Zeiss		for morphology studies
puriFlash	interchim	XS520plus	flash chromatography purification system
resazurin	SIGMA-ALDRICH	R7017-1G	for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator	Heidolph	Hei-VAP Value "The Collegiate"	solvent evaporator
Sodium bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	S6014-500G	irritant, white powder
Sodium chloride	fisher chemical	S271-1	crystalline, colorless
Sodium chloride	SIGMA-ALDRICH	S5886-500G	for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate	SIGMA-ALDRICH	7985592-500G	anhydrous, granular, white
tryptone	fisher chemical	BP1421-500	for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation	Microbiology International	DG250	anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract	fisher chemical	BP1422-500	for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software	Zeiss		for acquiring micrographs