Synthèse de la masarimycine, une petite molécule inhibitrice de la croissance bactérienne à Gram positif

Résumé

Un protocole détaillé est présenté pour la préparation du diamide bactériostatique masarimycine, une sonde à petites molécules qui inhibe la croissance de Bacillus subtilis et Streptococcus pneumoniae en ciblant la dégradation de la paroi cellulaire. Son application en tant que sonde chimique est démontrée dans des essais de synergie/antagonisme et des études morphologiques avec B. subtilis et S. pneumoniae.

Résumé

Le peptidoglycane (PG) dans la paroi cellulaire des bactéries est une structure macromoléculaire unique qui confère une forme et une protection contre l’environnement environnant. Au cœur de la compréhension de la croissance et de la division cellulaires se trouve la connaissance de la façon dont la dégradation du PG influence la biosynthèse et l’assemblage de la paroi cellulaire. Récemment, le marquage métabolique du PG par l’introduction de sucres ou d’acides aminés modifiés a été rapporté. Alors que l’interrogation chimique des étapes biosynthétiques avec de petites molécules inhibitrices est possible, les outils de biologie chimique pour étudier la dégradation du PG par les autolysines sont sous-développés. Les autolysines bactériennes sont une large classe d’enzymes qui sont impliquées dans la dégradation étroitement coordonnée du PG. Ici, un protocole détaillé est présenté pour la préparation d’une sonde à petite molécule, la masarimycine, qui est un inhibiteur de la N-acétylglucosaminidase LytG dans Bacillus subtilis, et le métabolisme de la paroi cellulaire chez Streptococcus pneumoniae. La préparation de l’inhibiteur par micro-ondes et la synthèse organique classique est fournie. Son applicabilité en tant qu’outil d’étude de la physiologie à Gram positif dans les essais biologiques est présentée.

Introduction

Le peptidoglycane (PG) est un polymère en forme de maille qui délimite la forme et la structure des cellules dans les bactéries Gram positif et Gram négatif ^1,2. Cet hétéropolymère est une matrice de sucres aminés réticulés par de courts peptides ^3,4,5,6 avec un squelette composé de résidus de N-acétylglucosamine (GlcNAc) et d’acide N-acétylmuramique (MurNAc) β(1,4)-liés (Figure 1)¹. Attaché à la fraction lactyle C-3 de MurNAc est le peptide de la tige. Le métabolisme du PG implique un système étroitement coordonné d’enzymes biosynthétiques et dégradatives pour incorporer de nouveaux matériaux dans la paroi cellulaire ^7,8. La dégradation du PG est effectuée par des enzymes collectivement appelées autolysines⁹ et classées en fonction de la spécificité de la liaison clivée. Les autolysines participent à de nombreux processus cellulaires, notamment la croissance cellulaire, la division cellulaire, la motilité, la maturation du PG, la chimiotaxie, la sécrétion de protéines, la compétence génétique, la différenciation et la pathogénicité^10,11. Démêler les fonctions biologiques spécifiques des autolysines individuelles peut être intimidant, en partie à cause de la redondance fonctionnelle. Cependant, des études biophysiques^{récentes 8,12,13} et des études computationnelles¹² ont fourni de nouvelles informations sur leurs rôles dans le métabolisme du PG. En outre, des rapports récents ont fourni des informations supplémentaires sur la synthèse¹⁴ et les ^15,16,17 étapes médiées par membrane dans le métabolisme du PG. Une compréhension approfondie de la relation entre les voies dégradatives et synthétiques du métabolisme du PG pourrait donner lieu à des cibles antibiotiques inexploitées auparavant.

Bien qu’il y ait eu des progrès significatifs dans la méthodologie pour étudier la glycobiologie chez les eucaryotes, la glycobiologie bactérienne et, en particulier, le métabolisme pg n’a pas progressé à un rythme similaire. Les approches chimiques actuelles pour étudier le métabolisme du PG comprennent les antibiotiques marqués par fluorescence¹⁸, les sondes fluorescentes^19,20 et le marquage métabolique 21,22,23,24. Ces nouvelles approches offrent de nouvelles façons d’interroger le métabolisme de la paroi cellulaire bactérienne. Bien que certaines de ces stratégies soient capables de marquer le PG in vivo, elles peuvent être spécifiques à^{l’espèce 19}, ou ne fonctionner que dans des souches dépourvues d’une autolysine²⁵ particulière. De nombreuses stratégies de marquage du PG sont destinées à être utilisées avec des parois cellulaires isolées²⁶ ou avec des voies de biosynthèse de PG reconstituées in vitro ^20,27,28. L’utilisation d’antibiotiques marqués par fluorescence est actuellement limitée aux étapes biosynthétiques et à la transpeptidation¹⁸.

Les connaissances actuelles sur les autolysines bactériennes et leur rôle dans le métabolisme de la paroi cellulaire proviennent de l’analyse génétique et biochimique in vitro ^{11,29,30,31,32}. Bien que ces approches aient fourni une mine d’informations sur cette classe importante d’enzymes, il peut être difficile de déchiffrer leur rôle biologique. Par exemple, en raison de la redondance fonctionnelle³³, la suppression d’une autolysine dans la plupart des cas n’entraîne pas l’arrêt de la croissance bactérienne. Ceci malgré leur rôle implicite dans la croissance et la division^{cellulaires 7,12}. Une autre complication est que la délétion génétique des autolysines bactériennes peut donner naissance à des méta-phénotypes³⁴. Les métaphénotypes proviennent de l’interaction complexe entre la voie affectée par la délétion génétique et d’autres voies interconnectées. Par exemple, un méta-phénotype peut survenir via un effet direct tel que l’absence d’une enzyme, ou un effet indirect tel qu’une perturbation des régulateurs.

Actuellement, il n’existe que quelques inhibiteurs des autolysines glycosidases telles que les N-acétylglucosaminidases (GlcNAcase) et les N-acétylmuramidases, qui peuvent être utilisées comme sondes chimiques pour étudier la dégradation du PG. Pour y remédier, le diamide masarimycine (précédemment appelé fgkc) a été identifié et caractérisé³⁵ comme un inhibiteur bactériostatique de la croissance de Bacillus subtilis qui cible le GlcNAcase LytG³² (Figure 1). LytG est un GlcNAcase³⁶ à action exo-agissante, membre du groupe 2 de la famille des glycosyl hydrolases 73 (GH73). C’est le principal GlcNAcase actif au cours de la croissance végétative³². À notre connaissance, la masarimycine est le premier inhibiteur d’un GlcNAcase à action PG qui inhibe la croissance cellulaire. Des études supplémentaires sur la masarimycine avec Streptococcus pneumoniae ont révélé que la masarimycine inhibe probablement le métabolisme de la paroi cellulaire dans cet organisme³⁷. Ici, la préparation de masarimycine est rapportée pour une utilisation comme sonde de biologie chimique pour étudier la physiologie dans les organismes à Gram positif B. subtilis et S. pneumoniae. Des exemples d’analyse morphologique d’un traitement à concentration inhibitrice inférieure au minimum avec de la masarimycine, ainsi qu’un test de synergie/antagonisme sont présentés. Les tests de synergie et d’antagonisme utilisant des antibiotiques avec des modes d’action bien définis peuvent être un moyen utile d’explorer les connexions entre les processus cellulaires 38,39,40.

Protocole

1. Méthodes générales

REMARQUE: Tous les composés ont été achetés auprès de fournisseurs standard et utilisés sans autre purification.

1. Effectuer une chromatographie sur couche mince (TLC) sur une plaque d’aluminium prélaquée de gel de silice XG F254. Détecter les taches sous une lampe UV, par immersion dans la tache de p-anisaldéhyde, ou en exposant à la vapeur_I2 .
2. Enregistrez tous les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) sur un spectromètre de 400 MHz.
   REMARQUE : ¹spectre H-RMN et ¹³spectres C-RMN ont été référencés aux pics de solvant résiduels. Les constantes de couplage sont données en [Hz] et les décalages chimiques en [ppm].
3. Enregistrer les spectres de spectrométrie de masse par ionisation chimique de pression atmosphérique (APCI) de la masarimycine sur un spectromètre de masse compact équipé d’une sonde d’analyse des solides atmosphériques.

2. Procédure générale de préparation de la masarimycine

REMARQUE: Effectuez les étapes ci-dessous dans une hotte aspirante.

1. Préparer une solution de 0,1 M dans le méthanol de chaque réactif : cyclohexylamine, cyclohexyl carboxaldéhyde, acide o-iodobenzoïque et isocyanure de cyclohexyle³⁵.
   ATTENTION : La cyclohexylamine, l’isocyanure de cyclohexyle et le cyclohexylcarboxaldéhyde sont inflammables. Ils peuvent provoquer une corrosion cutanée et induire une toxicité buccale, cutanée, respiratoire ou reproductive. Gardez les composés à l’écart des flammes nues, des surfaces chaudes et des sources d’inflammation. Portez une protection appropriée de la peau et des yeux, travaillez dans un endroit bien ventilé et évitez l’inhalation de vapeurs ou de brouillard. Pour le stockage, gardez les bouteilles hermétiquement fermées et conservez-les dans un endroit frais et sec. Conserver le cyclohexyl carboxaldéhyde dans un dessiccateur sous atmosphère de_N2 .
2. Mélanger 5 mL de cyclohexylamine (solution de 0,1 M dans le méthanol) et 5 mL de cyclohexyl carboxaldéhyde (0,1 M dans le méthanol) dans une fiole à fond rond coiffé et remuer la solution à l’aide d’une barre magnétique sur une plaque chauffante pendant 30 min à 40 °C dans un bain de sable. Surveillez la température à l’aide d’un thermomètre placé à environ 1 cm sous la surface du sable.
3. Après 30 min, ajouter 5 mL d’isocyanure de cyclohexyle (solution de 0,1 M dans du méthanol) à la solution de l’étape 2.2 et remuer pendant 20 min supplémentaires à 50 °C. Enfin, ajouter 5 mL d’acide o-iodobenzoïque (solution 0,1 M dans du méthanol) au mélange réactionnel et continuer à agiter à 55 °C pendant 3-5 h.
4. Surveiller périodiquement la progression de la réaction par TLC environ toutes les heures après que le mélange réactionnel ci-dessus ait été agité pendant 3 h.
5. Coupez une bande de 3 cm x 6 cm de plaque TLC à dos d’aluminium. À l’aide d’un crayon #2, tracez une ligne à environ 1 cm du bas. À l’aide d’un microcapillaire en verre, repérez environ 5 μL du mélange réactionnel sur la plaque TLC et laissez-le sécher.
6. À un bécher de 150 mL, ajouter suffisamment de phase mobile (hexane 90:10 : isopropanol) pour recouvrir le fond du bécher. À l’aide d’une pince à épiler, placez soigneusement la plaque TLC ci-dessus dans le bécher en veillant à ce que la plaque TLC entre uniformément dans la phase mobile. Couvrir le dessus du bécher avec un morceau de papier d’aluminium.
   REMARQUE: Assurez-vous que la phase mobile ne couvre pas la ligne et l’échantillon tacheté.
7. Laissez la phase mobile remonter la plaque TLC jusqu’à ce qu’elle se trouve à environ 1 cm sous le haut de la plaque. Retirez la plaque TLC et, à l’aide d’un crayon, tracez une ligne indiquant la distance parcourue par la phase mobile. Laissez sécher la plaque TLC dans une hotte.
8. Une fois séchée, placez la plaque TLC dans un bécher contenant une petite quantité de solide I₂ et recouvrez le bécher d’un morceau de papier d’aluminium. Surveillez le TLC pour le développement de taches jaunes / brunes. Une fois développée, retirez la plaque TLC et marquez l’emplacement des taches à l’aide d’un crayon (Figure supplémentaire 1).
   REMARQUE: Si I₂ taches ne sont pas marquées, la tache se dissipera avec le temps. Les taches peuvent également être visualisées sur la plaque TLC par la lumière UV, la coloration au p-anisaldéhyde ou la coloration au permanganate de potassium (voir Informations supplémentaires).
9. Calculez les valeurs R_f pour tous les points visualisés à l’aide de la formule suivante :
   R_f =
10. Considérons la réaction comme terminée lorsqu’un seul point avec R_f = 0,3 est visible sur la plaque TLC. Retirer le solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite et sécher le produit brut (obtenu sous forme d’huile brun jaunâtre) sous vide poussé jusqu’à ce que tout le méthanol soit évaporé.
11. Dissoudre le produit brut séché dans 30 mL d’acétate d’éthyle et le transférer dans un entonnoir de séparation. Extraire séquentiellement l’acétate d’éthyle avec 1 M HCl (2 x 30 mL), H₂O (₃₀ mL), solution saturée de NaHCO 3 (2 x 30 mL),_H2O (30 mL) et solution saturée de NaCl (2 x 30 mL). Jetez les couches aqueuses.
    REMARQUE: La couche d’acétate d’éthyle est la couche supérieure dans chacune des extractions. Pour chaque extraction, agiter vigoureusement l’entonnoir séparateur contenant l’acétate d’éthyle et la solution aqueuse (HCl,_H2O, NaHCO₃ ou NaCl) et laisser les couches se séparer complètement.
12. Retirez la couche d’acétate d’éthyle de l’entonnoir de séparation et recueillez-la dans une fiole d’Erlenmeyer. Ajouter une spatule pleine de Na₂SO₄ (anhydre) pour éliminer l’eau résiduelle de l’acétate d’éthyle.
    REMARQUE: La solution d’acétate d’éthyle est considérée comme sèche lorsque Na₂SO₄ dans la fiole coule librement et ne s’agglutine pas. Si Na₂SO₄ s’agglutine, une spatule supplémentaire de Na₂SO₄ peut être ajoutée.
13. Filtrer la solution d’acétate d’éthyle séchée à travers le papier filtre n ° 1 pour éliminer Na₂SO₄. Lavez le papier filtre avec une petite quantité d’acétate d’éthyle. Placer la solution d’acétate d’éthyle filtrée dans une fiole à fond rond et retirer le solvant sur un évaporateur rotatif sous pression réduite pour obtenir de la masarimycine sous forme d’huile une fois que tout l’acétate d’éthyle est retiré.
14. Dissoudre l’huile de masarimycine obtenue ci-dessus en une quantité minimale (1-2 mL) d’hexane 9:1: isopropanol et remuer sur une plaque magnétique jusqu’à ce que tout le composé soit dissous.
15. Purifier la masarimycine dissoute par chromatographie flash à l’aide d’une colonne flash de silice en phase normale de 12 g.
    1. Équilibrez la colonne flash avec 10 volumes de colonne de phase mobile (hexane 99:1 : isopropanol) avec l’instrument réglé à un débit de 15 mL/min.
       REMARQUE: Une fois l’équilibrage terminé, arrêtez le flux et déconnectez le haut de la colonne du système.
    2. Prélever la masarimycine dissoute à l’aide d’une seringue de 5 ml. Connectez la seringue directement au sommet de la colonne flash équilibrée et injectez la solution dans la colonne. Reconnectez la colonne chargée au système de chromatographie flash et lancez l’élution du gradient.
    3. Eluter masarimycine de la colonne en utilisant l’élution de gradient à une concentration finale de phase mobile de 10:90 hexane: isopropanol sur 12 volumes de colonne. Surveiller l’élution de la masarimycine par absorption à 230 et 254 nm.
    4. Recueillir les composés élués de la colonne par un collecteur de fraction qui recueille 20 mL de solvant par fraction.
       REMARQUE: Si un système de chromatographie flash n’est pas disponible, la purification de la masarimycine peut être effectuée via une colonne de silice gravitaire avec une phase mobile 3: 1 (hexane: acétate d’éthyle). Les fractions contenant de la masarimycine peuvent être identifiées par TLC en utilisant la même phase mobile. La visualisation des taches TLC a été effectuée avec une lumière UV, de la vapeur I₂ ou une coloration au permanganate de potassium.
    5. Identifier les fractions contenant de la masarimycine par TLC (étapes 2.5-2.9) ou spectrométrie de masse sur un spectromètre de masse compact équipé d’une sonde d’analyse des solides atmosphériques. Sécher le produit final sous vide (~0,3 mbar).
       REMARQUE: La masarimycine est systématiquement obtenue sous forme d’huile incolore ou solide avec un rendement de 55% à 70% par rapport au mmol de cyclohexyl carboxaldéhyde ajouté à la réaction. Calculer le rendement final de la masarimycine en obtenant la masse de la masarimycine purifiée et en calculant le rendement théorique de la réaction en utilisant la formule suivante:
       % de rendement = x 100 %
16. Confirmer la structure de la masarimycine par RMN.
    1. Dissoudre ~10 mg d’échantillon de masarimycine dans 0,5 mL de CDCl₃. À l’aide d’un pipet Pasteur, transférer la solution dans un tube RMN de 5 mm et boucher le tube. Placez le tube RMN dans le spectromètre.
    2. Acquérir des spectres ^{RMN 1}H et ¹³C à l’aide d’expériences prédéfinies par le fabricant. Les affectations de décalage chimique et les spectres représentatifs sont fournis dans les figures supplémentaires 3 à 4.
17. Conserver la masarimycine sèche ou dissoute dans du DMSO (concentration finale de 25 mM) à -20 °C jusqu’à utilisation.

3. Procédure micro-ondes pour la préparation de la masarimycine

1. Préparer des solutions 0,6 M de cyclohexylamine, de cyclohexylcarboxaldéhyde, d’isocyanure de cyclohexyle et d’acide o-iodobenzoïque dans l’acétonitrile.
2. Ajouter une barre d’agitation et 10 mL d’acétonitrile dans un flacon de réaction au micro-ondes en verre.
3. Ajouter 2 mL de cyclohexylamine (0,6 M dans l’acétonitrile), 2 mL de cyclohexyl carboxaldéhyde (0,6 M dans l’acétonitrile) et 7 mL d’acétonitrile dans le flacon.
4. Placez le flacon de réaction au micro-ondes dans le carrousel à micro-ondes. Remuez le mélange, chauffez-le pendant 30 min à 50°C à une puissance de 400 W et laissez-le refroidir à température ambiante.
5. Ajouter 2 mL d’acide o-iodobenzoïque (0,6 M dans le méthanol) et 2 mL d’isocyanure de cyclohexyle (0,6 M dans l’acétonitrile) au flacon. Remuez le mélange, chauffez-le à 100 °C au micro-ondes pendant 40 min à une puissance de 400 W et laissez-le refroidir à température ambiante.
6. Surveiller la progression de la réaction par TLC (hexane 90:10 : isopropanol) à l’aide de vapeur_I2 après la fin de l’étape 3.5.
   REMARQUE : Si la TLC montre que la réaction est incomplète (c.-à-d. plusieurs taches sur la TLC), replacez le flacon de réaction dans le micro-ondes et réglez les conditions de micro-ondes décrites à l’étape 3.5.
7. Une fois la réaction terminée, versez la solution dans une fiole à fond rond de 100 mL et évaporez-la à sec à l’aide d’un évaporateur rotatif.
8. Suivez les étapes 2.6 à 2.16 ci-dessus pour terminer le bilan aqueux, la purification et la caractérisation de la masarimycine.

4. Essai de synergie et d’antagonisme

1. Cultiver Streptococcus pneumoniae R6 sur des plaques de gélose de Mueller-Hinton (MH) contenant 5 % (v/v) de sang de mouton à 37 °C dans des conditions anaérobies. Dans toutes les expériences, utiliser des cellules de deuxième passage cultivées dans 5 mL de bouillon MH à 37 °C dans des conditions anaérobies jusqu’à ce que l’OD₆₀₀ soit d’environ 0,4.
2. Soumettre les inhibiteurs masarimycine et optochine à des dilutions en série 1:2 dans des solvants respectifs, les concentrations résultantes flanquant les valeurs minimales de concentration inhibitrice (CMI) de chaque inhibiteur.
   1. Effectuer la dilution initiale de la masarimycine dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) jusqu’à ce qu’une concentration de 100 μM soit atteinte. À partir de ce point, faites des dilutions de masarimycine dans le bouillon MH. Préparer la solution mère d’optochine (3,5 mM) en dissolvant l’optochine disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux) dans un bouillon stérile de MH.
      REMARQUE: Les solutions mères de masarimycine ont été fabriquées à 25 mM en DMSO.
3. À une plaque stérile de microtitrage de 96 puits, ajouter 2 aliquotes μL de chaque dilution optochine à chaque rangée de la plaque. Sur la même plaque, ajouter 2 aliquotes μL de chaque dilution de masarimycine à chaque colonne pour créer un tableau de concentrations d’optochine et de masarimycine sur la plaque (Figure 2).
4. Ajouter un bouillon stérile de MH (93 μL) à chaque puits contenant les inhibiteurs ci-dessus. Inoculer les plaques de microtitrage avec 5 μL de culture (OD₆₀₀ ~ 0,4) à partir de l’étape 4.1.
   REMARQUE: L’inoculation de la plaque de 96 puits se fait généralement dans des conditions anaérobies dans un poste de travail anaérobie. Le volume final dans le puits est de 100 μL.
5. Cultiver des cultures pendant 18 h à 37 °C dans des conditions anaérobies, suivies de l’ajout de 30 μL de solution à 0,01 % (m/v) de sel de résazurine sodique. Incuber la plaque à température ambiante pendant 15 min pour permettre la formation et la stabilisation de la couleur.
   REMARQUE: La solution de résazurine est préparée en dissolvant le composé dans de l’eau distillée et peut être conservée à 4 ° C pendant deux semaines maximum.
6. Lisez directement les valeurs de concentration de la plaque et attribuez la concentration d’inhibiteur la plus faible pour laquelle aucune croissance bactérienne n’est observée (couleur bleue) comme [X] (voir étape 4.7.1), c’est-à-dire la concentration inhibitrice la plus faible du médicament en présence du co-médicament.
   REMARQUE: La croissance bactérienne positive est identifiée dans les puits par le colorant de résazurine qui devient rose. Les valeurs de CMI pour chaque médicament seul (c.-à-d. en l’absence de co-médicament) sont déterminées de la même manière à l’aide du test de CMI de résazurine³⁵ avec chaque médicament séparément (figure supplémentaire 5). Les CMI chez S. pneumoniae sont de 7,8 μM et 15,85 μM pour la masarimycine et l’optochine, respectivement.
7. Déterminer la concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) et l’indice FIC (FIC_I) à l’aide des équations suivantes.
   1. FIC= [X]/MIC_x, où [X] (à partir de l’étape 4.6) est la concentration inhibitrice la plus faible du médicament en présence du co-médicament, et MIC_x est la concentration inhibitrice la plus faible du médicament en l’absence du co-médicament.
   2. FIC_I = FIC_masarimycine +_antibiotique FIC
      NOTE: FIC_I < 0,5 = synergique, 0,5 < FIC_I < 1 = additif, 1 < FIC_I < 4 = indifférent, FIC_I > 4 = antagoniste.

5. Étude morphologique

1. Cultivez Bacillus subtilis 11774 sur des plaques de gélose Luria-Bertani (LB) (10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure et 5 g/L de NaCl) contenant 1,5 % de gélose Bacto à 37 °C. Dans toutes les expériences, utiliser des cellules de deuxième passage cultivées dans 5 mL de bouillon LB à 37 °C jusqu’à OD₆₀₀ = 1. Cultivez S.pneumoniae de la même manière qu’à l’étape 4.1.
2. Après avoir obtenu une densité de culture cellulaire avec OD_600nm = 1 pour B. subtilis, ou OD_600nm = 0,4 pour S. pneumoniae, ajouter la masarimycine à l’aide d’une pipette au tube de culture étiqueté " traité » à une concentration finale de 3,8 μM (0,75x MIC pour B.subtilis), ou 5,85 μM (0,75x MIC pour S.pneumoniae). Au deuxième tube de culture étiqueté « témoin », ajoutez un volume équivalent de DMSO.
3. Pour B.subtilis, placer les échantillons dans un incubateur à 37 °C pendant 90 min en agitant à 150 tr/min. Pour S. pneumoniae, incuber les cellules sans trembler dans des conditions anaérobies.
4. Après 90 min, fixer chimiquement les cultures dans un mélange 1:10 (v/v) de milieux de culture et de tampon de fixation (20 mM HEPES, 1% de formaldéhyde (pH 6,8)) à 4 °C pendant la nuit. Une fois la fixation terminée, appliquez 10 à 20 μL d’échantillons sur des lames de microscope en verre à l’aide d’une pipette et laissez-les sécher à l’air. Fixez les échantillons séchés à l’air en chauffant les lames de verre à l’aide d’un brûleur Bunsen.
5. Après fixation à la chaleur, tacher les échantillons avec l’ajout de 100 μL de bleu de méthylène à 0,1 % (m/v) (solution dans de l’éthanol à 20 % (v/v)). Incuber les lames tachées pendant 10 min et laver l’excès de colorant avec dH₂O. Ensuite, chauffer doucement les lames colorées à 60 ° C dans un four pendant 15-20 min pour amener les cellules à un plan focal commun.
6. Scellez les échantillons colorés en plaçant un couvercle de microscope sur les cellules colorées. Ensuite, scellez les bords à l’aide de ciment à lame de microscope. Placez la lame de microscope scellée sur la scène du microscope et mettez l’image au point à un grossissement de 100x à l’aide de la microscopie à champ lumineux.
7. Placez une goutte d’huile d’immersion sur la lame du microscope et mettez le champ de vision au point en utilisant un grossissement de 1000x. Acquérir des micrographies à l’aide d’une caméra fixée au microscope et à son logiciel associé. Obtenez des images à l’aide des paramètres de balance des blancs et d’ouverture automatiques du logiciel.
   REMARQUE: Alternativement, les images peuvent être traitées à l’aide du logiciel open source ImageJ.

Résultats

La masarimycine est une petite molécule inhibitrice bactériostatique de B. subtilis et S. pneumoniae et il a été démontré qu’elle inhibe l’exo-action GlcNAcase LytG chez B. subtilis^35,37 et cible la paroi cellulaire chez S. pneumoniae³⁷. La masarimycine peut être préparée efficacement par la synthèse organique classique ou assistée par micro-ondes avec des rendements compris entre 55% et 7...

Discussion

La masarimycine est un inhibiteur bactériostatique micromolaire unique de la croissance de B. subtilis³⁵ et de S. pneumoniae³⁷ . Chez B. subtilis, il a été démontré que la masarimycine inhibe le GlcNAcase LytG³⁵, tandis que la cible moléculaire précise dans la paroi cellulaire de S. pneumoniae n’a pas été identifiée³⁷. La synthèse de la masarimycine à l’aide de la synthèse organique ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Iodobenzoic acid	SIGMA-ALDRICH	I7675-25G	corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	109827-4L	flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile	SIGMA-ALDRICH	34851-4L	flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates	Sorbtech	4434126	silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d	SIGMA-ALDRICH	151823-50G	solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer	Advion-Interchim	Advion CMS	compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile	fisher chemical	07-200-90	for synergy/antagonism assays
cover slips	fisher chemical	12-547	for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde	CHEM-IMPEX INT'L INC.	24451	flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide	SIGMA-ALDRICH	133302-5G	irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine	SIGMA-ALDRICH	240648-100ML	corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate	SIGMA-ALDRICH	537446-4L	flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g)	Advion-Interchim	PF-50SIHP-F0012	pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde	SIGMA-ALDRICH	F8775-25ML	fixing agent for microscopy
HEPES	SIGMA-ALDRICH	H8651-25G	buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers	SIGMA-ALDRICH	178918-4L	environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer	Advion	expression	Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac	eppendorf	Vacufuge plus	vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	258148-2.5L	corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	320331-2.5L	strong acid
immersion oil	fisher chemical	12-365-19	for microscopy
Iodine, resublimed crystals	Alfa Aesar	41955	environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova	MestreLab Research		software for processing NMR spectra
Methanol	SIGMA-ALDRICH	439193-4L	flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue	SIGMA-ALDRICH	M9140-25G	microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood	fisher chemical	B21176X	growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth	fisher chemical	DF0757-17-6	growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides	fisher chemical	22-310397	for microscopy
Microwave Synthesis Labstation	MILESTONE	START SYNTH	device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes	SIGMA-ALDRICH	Z562769-5EA	5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR)	Bruker	Ascend 400	large superconducting magnet (400MHz)
optochin	fisher chemical	AAB21627MC	ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates	Celltreat	229695	for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera	Zeiss		for morphology studies
puriFlash	interchim	XS520plus	flash chromatography purification system
resazurin	SIGMA-ALDRICH	R7017-1G	for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator	Heidolph	Hei-VAP Value "The Collegiate"	solvent evaporator
Sodium bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	S6014-500G	irritant, white powder
Sodium chloride	fisher chemical	S271-1	crystalline, colorless
Sodium chloride	SIGMA-ALDRICH	S5886-500G	for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate	SIGMA-ALDRICH	7985592-500G	anhydrous, granular, white
tryptone	fisher chemical	BP1421-500	for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation	Microbiology International	DG250	anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract	fisher chemical	BP1422-500	for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software	Zeiss		for acquiring micrographs