Sintesi di Masarimycin, un inibitore di piccole molecole della crescita batterica Gram-positiva

Riepilogo

Viene presentato un protocollo dettagliato per la preparazione della diamide batteriostatica masarimicina, una sonda a piccola molecola che inibisce la crescita di Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae mirando alla degradazione della parete cellulare. La sua applicazione come sonda chimica è dimostrata in saggi di sinergia/antagonismo e studi morfologici con B. subtilis e S. pneumoniae.

Abstract

Il peptidoglicano (PG) nella parete cellulare dei batteri è una struttura macromolecolare unica che conferisce forma e protezione dall'ambiente circostante. Fondamentale per comprendere la crescita e la divisione cellulare è la conoscenza di come la degradazione del PG influenza la biosintesi e l'assemblaggio della parete cellulare. Recentemente, è stata riportata l'etichettatura metabolica di PG attraverso l'introduzione di zuccheri o amminoacidi modificati. Mentre l'interrogazione chimica dei passaggi biosintetici con inibitori di piccole molecole è possibile, gli strumenti di biologia chimica per studiare la degradazione del PG da parte delle autolisine sono sottosviluppati. Le autolisine batteriche sono un'ampia classe di enzimi coinvolti nella degradazione strettamente coordinata del PG. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per la preparazione di una sonda a piccola molecola, masarimycin, che è un inibitore della N-acetilglucosaminidasi LytG nel Bacillus subtilis e del metabolismo della parete cellulare nello Streptococcus pneumoniae. Viene fornita la preparazione dell'inibitore tramite sintesi organica classica e assistita da microonde. Viene presentata la sua applicabilità come strumento per studiare la fisiologia Gram-positiva nei saggi biologici.

Introduzione

Il peptidoglicano (PG) è un polimero a maglie che delinea la forma e la struttura cellulare nei batteri Gram-positivi e Gram-negativi ^1,2. Questo eteropolimero è una matrice di amminozuccheri reticolati da peptidi corti ^3,4,5,6 con una spina dorsale composta da residui alternati di N-acetilglucosamina (GlcNAc) e acido N-acetilmuramico (MurNAc) legati a β-(1,4) (Figura 1)1. Attaccato alla porzione di lattilo C-3 di MurNAc è il peptide dello stelo. Il metabolismo della PG coinvolge un sistema strettamente coordinato di enzimi biosintetici e degradativi per incorporare nuovo materiale nella parete cellulare ^7,8. La degradazione del PG viene effettuata da enzimi collettivamente denominati autolisine⁹ e ulteriormente classificati in base alla specificità del legame scisso. Le autolisine partecipano a molti processi cellulari tra cui la crescita cellulare, la divisione cellulare, la motilità, la maturazione PG, la chemiotassi, la secrezione proteica, la competenza genetica, la differenziazione e la patogenicità^10,11. Svelare le funzioni biologiche specifiche delle singole autolisine può essere scoraggiante, in parte a causa della ridondanza funzionale. Tuttavia, recenti studi biofisici 8,12,13 e computazionali¹² hanno fornito nuove informazioni sui loro ruoli nel metabolismo pg. Inoltre, recenti rapporti hanno fornito ulteriori informazioni sulla sintesi¹⁴ e sui ^15,16,17 passaggi mediati dalla membrana nel metabolismo pg. Una conoscenza approfondita della relazione tra vie degradative e sintetiche del metabolismo pg potrebbe dare origine a bersagli antibiotici precedentemente non sfruttati.

Mentre ci sono stati progressi significativi nella metodologia per studiare la glicobiologia negli eucarioti, la glicobiologia batterica e, in particolare, il metabolismo PG non è avanzato a un ritmo simile. Gli attuali approcci chimici per studiare il metabolismo pg includono antibiotici marcati fluorescentemente¹⁸, sonde fluorescenti ^19,20 e etichettatura metabolica 21,22,23,24. Questi nuovi approcci stanno fornendo nuovi modi per interrogare il metabolismo della parete cellulare batterica. Mentre alcune di queste strategie sono in grado di etichettare PG in vivo, possono essere specie-specifiche¹⁹, o funzionare solo in ceppi privi di una particolare autolisina²⁵. Molte strategie di marcatura PG sono destinate all'uso con pareti cellulari isolate²⁶ o con vie di biosintesi PG ricostituite in vitro 20,27,28. L'uso di antibiotici marcati con fluorescenza è attualmente limitato alle fasi biosintetiche e alla transpeptidazione¹⁸.

Le attuali conoscenze sulle autolisine batteriche e sul loro ruolo nel metabolismo della parete cellulare provengono da analisi genetiche e biochimiche in vitro 11,29,30,31,32. Mentre questi approcci hanno fornito una ricchezza di informazioni su questa importante classe di enzimi, decifrare il loro ruolo biologico può essere difficile. Ad esempio, a causa della ridondanza funzionale³³, la cancellazione di un'autolisina nella maggior parte dei casi non comporta l'arresto della crescita batterica. Questo nonostante il loro ruolo implicito nella crescita e divisione cellulare ^7,12. Un'altra complicazione è che la delezione genetica delle autolisine batteriche può dare origine a meta-fenotipi³⁴. I metafenotipi derivano dalla complessa interazione tra la via interessata dalla delezione genetica e altre vie interconnesse. Ad esempio, un meta-fenotipo può insorgere attraverso un effetto diretto come la mancanza di un enzima o un effetto indiretto come un'interruzione dei regolatori.

Attualmente, ci sono solo pochi inibitori delle autolisine della glicosidasi come N-acetilglucosaminidasi (GlcNAcase) e N-acetilmuramidasi, che possono essere utilizzati come sonde chimiche per studiare la degradazione del PG. Per risolvere questo problema, la diamide masarimicina (precedentemente definita come fgkc) è stata identificata e caratterizzata^{con 35} come inibitore batteriostatico della crescita del Bacillus subtilis che prende di mira il GlcNAcase LytG³² (Figura 1). LytG è un GlcNAcase³⁶ eso-agente, membro del cluster 2 all'interno della famiglia 73 della glicosil idrolasi (GH73). È il principale GlcNAcase attivo durante la crescita vegetativa³². Per quanto ne sappiamo, la masarimicina è il primo inibitore di un GlcNAcase ad azione PG che inibisce la crescita cellulare. Ulteriori studi sulla masarimicina con Streptococcus pneumoniae hanno scoperto che la masarimicina probabilmente inibisce il metabolismo della parete cellulare in questo organismo³⁷. Qui, la preparazione di masarimicina è segnalata per l'uso come sonda di biologia chimica per studiare la fisiologia negli organismi Gram-positivi B. subtilis e S. pneumoniae. Vengono presentati esempi di analisi morfologica del trattamento con concentrazione inibitoria sub-minima con masarimicina, nonché un test di sinergia/antagonismo. I saggi di sinergia e antagonismo con antibiotici con modalità d'azione ben definite possono essere un modo utile per esplorare le connessioni tra i processi cellulari 38,39,40.

Protocollo

1. Metodi generali

NOTA: Tutti i composti sono stati acquistati da fornitori standard e utilizzati senza ulteriore purificazione.

1. Eseguire la cromatografia a strato sottile (TLC) su una piastra di alluminio prefigurata con gel di silice XG F254. Rileva le macchie sotto una lampada UV, immergendoti nella macchia di p-anisaldeide o esponendo al vapore I₂ .
2. Registra tutti gli spettri di risonanza magnetica nucleare (NMR) su uno spettrometro a 400 MHz.
   NOTA: ¹H-NMR e ¹³spettri C-NMR sono stati riferiti ai picchi di solvente residuo. Le costanti di accoppiamento sono date in [Hz] e gli spostamenti chimici in [ppm].
3. Registrare gli spettri di spettrometria di massa a ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) di masarimicina su uno spettrometro di massa compatto dotato di una sonda di analisi dei solidi atmosferici.

2. Procedura generale per la preparazione della masarimicina

NOTA: eseguire i passaggi seguenti in una cappa aspirante.

1. Preparare una soluzione di 0,1 M in metanolo di ciascun reagente: cicloesilammina, cicloesil carbossildeide, acido o-iodobenzoico e cicloesil isocianuro³⁵.
   ATTENZIONE: La cicloesilammina, l'isocianuro di cicloesile e la carbossaldeide cicloesile sono infiammabili. Possono causare corrosione cutanea e indurre tossicità orale, cutanea, respiratoria o riproduttiva. Tenere i composti lontani da fiamme libere, superfici calde e fonti di accensione. Indossare un'adeguata protezione della pelle e degli occhi, lavorare in un'area ben ventilata ed evitare l'inalazione di vapori o nebbia. Per la conservazione, tenere le bottiglie ben chiuse e conservarle in un luogo fresco e asciutto. Conservare cicloesil carbossialdeide in un essiccatore in un'atmosfera N₂ .
2. Mescolare 5 mL di cicloesilammina (0,1 M di soluzione in metanolo) e 5 mL di cicloesil carbossilaldeide (0,1 M in metanolo) in un matraccio a fondo tondo tappato e mescolare la soluzione utilizzando una barra magnetica su una piastra agitata/calda per 30 minuti a 40 °C in un bagno di sabbia. Monitorare la temperatura utilizzando un termometro posto a circa 1 cm sotto la superficie della sabbia.
3. Dopo 30 minuti, aggiungere 5 mL di isocianuro di cicloesile (soluzione da 0,1 M in metanolo) alla soluzione dal punto 2.2 e mescolare per altri 20 minuti a 50 °C. Infine, aggiungere 5 mL di acido o-iodobenzoico (soluzione da 0,1 M in metanolo) alla miscela di reazione e continuare a mescolare a 55 °C per 3-5 ore.
4. Monitorare periodicamente l'andamento della reazione da parte di TLC circa ogni ora dopo che la miscela di reazione di cui sopra è stata agitata per 3 ore.
5. Tagliare una striscia di 3 cm x 6 cm di piastra TLC con supporto in alluminio. Usando una matita #2, disegna una linea a circa 1 cm dal basso. Utilizzando un microcapillare di vetro, individuare circa 5 μL della miscela di reazione sulla piastra TLC e lasciarla asciugare.
6. A un becher da 150 ml, aggiungere abbastanza fase mobile (esano 90:10: isopropanolo) per coprire il fondo del becher. Utilizzando un paio di pinzette, posizionare con attenzione la piastra TLC sopra nel becher assicurandosi che la piastra TLC entri nella fase mobile in modo uniforme. Coprire la parte superiore del becher con un pezzo di carta stagnola.
   NOTA: assicurarsi che la fase mobile non copra la linea e il campione individuato.
7. Lasciare che la fase mobile risalga la piastra TLC fino a quando non si trova a circa 1 cm sotto la parte superiore della piastra. Rimuovere la piastra TLC e, utilizzando una matita, disegnare una linea che indichi la distanza percorsa dalla fase mobile. Lasciare asciugare la piastra TLC in una cappa aspirante.
8. Una volta essiccato, posizionare la piastra TLC in un becher contenente una piccola quantità di solido I₂ e coprire il becher con un pezzo di stagnola. Monitorare la TLC per lo sviluppo di macchie gialle/marroni. Una volta sviluppato, rimuovere la piastra TLC e contrassegnare la posizione delle macchie con una matita (Figura supplementare 1).
   NOTA: Se₂ macchie non sono contrassegnate, la macchia si dissiperà nel tempo. Le macchie possono anche essere visualizzate sulla piastra TLC mediante luce UV, colorazione di p-anisaldeide o colorazione del permanganato di potassio (vedere Informazioni supplementari).
9. Calcolate i valori R_f per tutti i punti visualizzati utilizzando la seguente formula:
   R_f =
10. Considerare la reazione completa quando solo un punto con R_f = 0,3 è visibile sulla piastra TLC. Rimuovere il solvente in un evaporatore rotativo a pressione ridotta e asciugare il prodotto grezzo (ottenuto come olio bruno-giallastro) sotto un alto vuoto fino a quando tutto il metanolo è evaporato.
11. Sciogliere il prodotto greggio essiccato in 30 ml di acetato di etile e trasferirlo in un imbuto separatore. Estrarre l'acetato di etile in sequenza con 1 M HCl (2 x 30 mL), H₂O (30 mL), soluzione satura di NaHCO₃ (2 x 30 mL), H₂O (30 mL) e soluzione di NaCl saturo (2 x 30 mL). Scartare gli strati acquosi.
    NOTA: Lo strato di acetato di etile è lo strato superiore in ciascuna delle estrazioni. Per ogni estrazione, agitare vigorosamente l'imbuto separatore contenente l'acetato di etile e la soluzione acquosa (HCl, H₂O, NaHCO₃ o NaCl) e lasciare che gli strati si separino completamente.
12. Rimuovere lo strato di acetato di etile dall'imbuto separatore e raccoglierlo in un matraccio Erlenmeyer. Aggiungere una spatola piena di Na₂SO₄ (anidra) per rimuovere l'acqua residua dall'acetato di etile.
    NOTA: La soluzione di acetato di etile è considerata secca quando Na₂SO₄ nel matraccio scorre liberamente e non si aggrega. Se Na₂SO₄ si aggrega, è possibile aggiungere una spatola aggiuntiva di Na₂SO₄ .
13. Filtrare la soluzione essiccata di acetato di etile attraverso la carta da filtro #1 per rimuovere Na₂SO₄. Lavare la carta da filtro con una piccola quantità di acetato di etile. Posizionare la soluzione filtrata di acetato di etile in un matraccio a fondo tondo e rimuovere il solvente su un evaporatore rotatorio a pressione ridotta per ottenere masarimicina come olio una volta rimosso tutto l'acetato di etile.
14. Sciogliere l'olio di masarimicina ottenuto sopra in una quantità minima (1-2 ml) di esano 9:1: isopropanolo e mescolare su una piastra magnetica fino a quando tutto il composto è sciolto.
15. Purificare la masarimicina disciolta mediante cromatografia flash utilizzando una colonna flash di silice in fase normale da 12 g.
    1. Equilibrare la colonna flash con 10 volumi di colonna di fase mobile (esano 99:1: isopropanolo) con lo strumento impostato ad una portata di 15 mL/min.
       NOTA: al termine dell'equilibrio, arrestare il flusso e scollegare la parte superiore della colonna dal sistema.
    2. Aspirare la masarimicina disciolta usando una siringa da 5 ml. Collegare la siringa direttamente alla parte superiore della colonna flash bilanciata e iniettare la soluzione nella colonna. Ricollegare la colonna caricata al sistema di cromatografia flash e avviare l'eluizione del gradiente.
    3. Elute masarimycin dalla colonna utilizzando l'eluizione gradiente ad una concentrazione di fase mobile finale di 10:90 esano: isopropanolo su 12 volumi di colonna. Monitorare l'eluizione di masarimicina attraverso l'assorbimento a 230 e 254 nm.
    4. Raccogliere i composti eluiti dalla colonna da un collettore di frazioni che raccoglie 20 ml di solvente per frazione.
       NOTA: Se non è disponibile un sistema di cromatografia flash, la purificazione della masarimicina può essere eseguita tramite una colonna di silice gravitazionale con una fase mobile 3:1 (esano: acetato di etile). Le frazioni contenenti masarimicina possono essere identificate da TLC utilizzando la stessa fase mobile. La visualizzazione delle macchie TLC è stata effettuata con luce UV, vapore I₂ o colorazione del permanganato di potassio.
    5. Identificare le frazioni contenenti masarimicina mediante TLC (fasi 2.5-2.9) o spettrometria di massa su uno spettrometro di massa compatto dotato di una sonda di analisi dei solidi atmosferici. Asciugare il prodotto finale sotto vuoto (~0,3 mbar).
       NOTA: La masarimicina è abitualmente ottenuta come olio incolore o solido con una resa del 55%-70% rispetto al mmol di cicloesil carbossialdeide aggiunto alla reazione. Calcola la resa finale della masarimicina ottenendo la massa della masarimicina purificata e calcolando la resa teorica della reazione usando la seguente formula:
       % resa = x 100%
16. Confermare la struttura della masarimicina mediante NMR.
    1. Sciogliere ~10 mg di campione di masarimicina in 0,5 ml di CDCl₃. Utilizzando un pipetto Pasteur, trasferire la soluzione su un tubo NMR da 5 mm e tappare il tubo. Posizionare il tubo NMR nello spettrometro.
    2. Acquisisci spettri NMR ¹H e ¹³C utilizzando esperimenti preimpostati dal produttore. Le assegnazioni dei turni chimici e gli spettri rappresentativi sono forniti nelle figure supplementari 3-4.
17. Conservare la masarimicina asciutta o disciolta in DMSO (concentrazione finale di 25 mM) a -20 °C fino all'uso.

3. Procedura a microonde per la preparazione di masarimycin

1. Preparare soluzioni 0,6 M di cicloesilammina, cicloesile carbossildeide, isocianuro di cicloesile e acido o-iodobenzoico in acetonitrile.
2. Aggiungere una barra di agitazione e 10 ml di acetonitrile a un flaconcino di reazione a microonde di vetro.
3. Aggiungere 2 mL di cicloesilammina (0,6 M in acetonitrile), 2 mL di cicloesil carbossildeide (0,6 M in acetonitrile) e 7 ml di acetonitrile al flaconcino.
4. Posizionare il flaconcino di reazione a microonde nel carosello del microonde. Mescolare la miscela, riscaldarla per 30 minuti a 50°C con una potenza di 400 W e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente.
5. Aggiungere 2 mL di acido o-iodobenzoico (0,6 M in metanolo) e 2 mL di isocianuro di cicloesile (0,6 M in acetonitrile) al flaconcino. Mescolare la miscela, riscaldarla a 100 °C nel microonde per 40 minuti con una potenza di 400 W e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente.
6. Monitorare l'avanzamento della reazione mediante TLC (esano 90:10: isopropanolo) utilizzando il vapore I₂ dopo il completamento del passaggio 3.5.
   NOTA: se la TLC mostra che la reazione è incompleta (cioè più punti sulla TLC), riposizionare il flaconcino di reazione nel microonde e impostare le condizioni del microonde descritte al punto 3.5.
7. Una volta completata la reazione, versare la soluzione in un matraccio a fondo tondo da 100 ml ed evaporarla a secco utilizzando un evaporatore rotante.
8. Seguire i passaggi 2.6-2.16 sopra per completare il workup acquoso, la purificazione e la caratterizzazione della masarimicina.

4. Analisi di sinergia e antagonismo

1. Coltivare Streptococcus pneumoniae R6 su piastre di agar Mueller-Hinton (MH) contenenti il 5% (v/v) di sangue di pecora a 37 °C in condizioni anaerobiche. In tutti gli esperimenti, utilizzare cellule di secondo passaggio coltivate in 5 ml di brodo MH a 37 °C in condizioni anaerobiche fino a quando OD₆₀₀ è ~ 0,4.
2. Sottoporre gli inibitori masarimicina e optochina a diluizioni seriali 1:2 nei rispettivi solventi, con le concentrazioni risultanti che affiancano i valori minimi di concentrazione inibitoria (MIC) di ciascun inibitore.
   1. Effettuare la diluizione iniziale di masarimicina in dimetilsolfossido (DMSO) fino a raggiungere una concentrazione di 100 μM. Da questo punto, fare diluizioni di masarimicina in brodo MH. Preparare la soluzione madre di optochin (3,5 mM) sciogliendo l'optochina disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) in brodo MH sterile.
      NOTA: le soluzioni stock di Masarimycin sono state realizzate a 25 mM in DMSO.
3. Su una piastra sterile di microtitolazione a 96 pozzetti, aggiungere aliquote da 2 μL di ciascuna diluizione optochina a ciascuna fila della piastra. Alla stessa piastra, aggiungere 2 aliquote μL di ogni diluizione di masarimicina a ciascuna colonna per creare una serie di concentrazioni di optochin e masarimycin sulla piastra (Figura 2).
4. Aggiungere brodo MH sterile (93 μL) a ciascun pozzetto contenente gli inibitori di cui sopra. Inoculare le piastre di microtitolazione con 5 μL di coltura (OD₆₀₀ ~ 0,4) dal punto 4.1.
   NOTA: l'inoculazione della piastra a 96 pozzetti viene in genere eseguita in condizioni anaerobiche in una workstation anaerobica. Il volume finale nel pozzo è di 100 μL.
5. Coltivare colture per 18 ore a 37 °C in condizioni anaerobiche, seguite dall'aggiunta di 30 μL di soluzione allo 0,01% (m/v) di sale sodico di resazurina. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire la formazione e la stabilizzazione del colore.
   NOTA: La soluzione di resazurina viene preparata sciogliendo il composto in acqua distillata e può essere conservata a 4 °C per un massimo di due settimane.
6. Leggere direttamente i valori di concentrazione dalla piastra e assegnare la più bassa concentrazione di inibitori per la quale non si osserva alcuna crescita batterica (colore blu) come [X] (vedere il punto 4.7.1), cioè la più bassa concentrazione inibitoria del farmaco in presenza del co-farmaco.
   NOTA: La crescita batterica positiva è identificata nei pozzetti dal colorante resazurina che diventa rosa. I valori di MIC per ciascun farmaco da solo (cioè in assenza di co-farmaco) sono determinati in modo simile utilizzando il test resazurin MIC³⁵ con ciascun farmaco separatamente (Figura supplementare 5). I MIC in S. pneumoniae sono 7,8 μM e 15,85 μM per masarimycin e optochin, rispettivamente.
7. Determinare la concentrazione inibitoria frazionaria (FIC) e l'indice FIC (FIC_I) utilizzando le seguenti equazioni.
   1. FIC= [X]/MIC_x, dove [X] (dal passo 4.6) è la più bassa concentrazione inibitoria del farmaco in presenza del co-farmaco, e MIC_x è la più bassa concentrazione inibitoria del farmaco in assenza del co-farmaco.
   2. FIC_I= FIC_masarimicina +_antibiotico FIC
      NOTA: FIC_I < 0,5 = sinergico, 0,5 < FIC_I < 1 = additivo, 1 < FIC_I < 4 = indifferente, FIC_I > 4 = antagonista.

5. Studio morfologico

1. Coltivare Bacillus subtilis 11774 su piastre di agar Luria-Bertani (LB) (10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito e 5 g/L di NaCl) contenenti l'1,5% di Bacto agar a 37 °C. In tutti gli esperimenti, utilizzare cellule di secondo passaggio coltivate in 5 ml di brodo LB a 37 °C fino a OD₆₀₀ = 1. Coltivare S.pneumoniae nello stesso modo del passaggio 4.1.
2. Dopo aver ottenuto una densità di coltura cellulare con OD_600nm = 1 per B. subtilis, o OD_600nm = 0,4 per S. pneumoniae, aggiungere masarimycin usando una pipetta al tubo di coltura etichettato "trattato" ad una concentrazione finale di 3,8 μM (0,75x MIC per B.subtilis), o 5,85 μM (0,75x MIC per S.pneumoniae). Al secondo tubo di coltura etichettato "controllo", aggiungere un volume equivalente di DMSO.
3. Per B.subtilis, posizionare i campioni in un incubatore a 37 °C per 90 minuti con agitazione a 150 giri/min. Per S. pneumoniae, incubare le cellule senza scuotere in condizioni anaerobiche.
4. Dopo 90 minuti, fissare chimicamente le colture in una miscela 1:10 (v/v) di terreno di coltura e tampone di fissaggio (20 mM HEPES, 1% formaldeide (pH 6,8)) a 4 °C durante la notte. Al termine del fissaggio, applicare 10-20 μL di campioni su vetrini per microscopio di vetro utilizzando una pipetta e lasciarli asciugare all'aria. Fissare i campioni essiccati all'aria riscaldando i vetrini utilizzando un bruciatore Bunsen.
5. Dopo il fissaggio a caldo, i campioni di colorazione con l'aggiunta di 100 μL di blu di metilene allo 0,1% (m/v) (soluzione in etanolo al 20% (v/v). Incubare i vetrini macchiati per 10 minuti e lavare via il colorante in eccesso con dH₂O. Quindi, riscaldare delicatamente i vetrini macchiati a 60 ° C in un forno per 15-20 minuti per portare le celle su un piano focale comune.
6. Sigillare i campioni macchiati posizionando un coprimicroscopio sulle cellule macchiate. Quindi, sigillare i bordi usando il cemento del vetrino del microscopio. Posizionare il vetrino del microscopio sigillato sul palco del microscopio e mettere a fuoco l'immagine con un ingrandimento di 100x utilizzando la microscopia a campo luminoso.
7. Posizionare una goccia di olio per immersione sul vetrino del microscopio e mettere a fuoco il campo visivo utilizzando un ingrandimento di 1000x. Acquisire micrografie utilizzando una fotocamera collegata al microscopio e il relativo software associato. Acquisisci immagini utilizzando le impostazioni di bilanciamento automatico del bianco e apertura sul software.
   NOTA: in alternativa, le immagini possono essere elaborate utilizzando il software open source ImageJ.

Risultati

Masarimycin è un inibitore batteriostatico a piccola molecola di B. subtilis e S. pneumoniae e ha dimostrato di inibire il GlcNAcase LytG eso-agente in B. subtilis^35,37 e di colpire la parete cellulare in S. pneumoniae³⁷. La masarimicina può essere preparata in modo efficiente sia dalla sintesi organica classica che da quella assistita da microonde con rese nell'intervallo 55%-70%. La sintesi assistita...

Discussione

Masarimycin è un singolo inibitore batteriostatico micromolare della crescita di B. subtilis³⁵ e S. pneumoniae³⁷ . In B. subtilis, masarimycin ha dimostrato di inibire il GlcNAcase LytG³⁵, mentre il bersaglio molecolare preciso nella parete cellulare di S. pneumoniae non è stato identificato³⁷. La sintesi di masarimicina utilizzando la classica sintesi organica o la procedura a microonde fornisce l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Iodobenzoic acid	SIGMA-ALDRICH	I7675-25G	corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	109827-4L	flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile	SIGMA-ALDRICH	34851-4L	flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates	Sorbtech	4434126	silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d	SIGMA-ALDRICH	151823-50G	solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer	Advion-Interchim	Advion CMS	compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile	fisher chemical	07-200-90	for synergy/antagonism assays
cover slips	fisher chemical	12-547	for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde	CHEM-IMPEX INT'L INC.	24451	flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide	SIGMA-ALDRICH	133302-5G	irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine	SIGMA-ALDRICH	240648-100ML	corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate	SIGMA-ALDRICH	537446-4L	flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g)	Advion-Interchim	PF-50SIHP-F0012	pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde	SIGMA-ALDRICH	F8775-25ML	fixing agent for microscopy
HEPES	SIGMA-ALDRICH	H8651-25G	buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers	SIGMA-ALDRICH	178918-4L	environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer	Advion	expression	Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac	eppendorf	Vacufuge plus	vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	258148-2.5L	corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	320331-2.5L	strong acid
immersion oil	fisher chemical	12-365-19	for microscopy
Iodine, resublimed crystals	Alfa Aesar	41955	environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova	MestreLab Research		software for processing NMR spectra
Methanol	SIGMA-ALDRICH	439193-4L	flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue	SIGMA-ALDRICH	M9140-25G	microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood	fisher chemical	B21176X	growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth	fisher chemical	DF0757-17-6	growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides	fisher chemical	22-310397	for microscopy
Microwave Synthesis Labstation	MILESTONE	START SYNTH	device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes	SIGMA-ALDRICH	Z562769-5EA	5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR)	Bruker	Ascend 400	large superconducting magnet (400MHz)
optochin	fisher chemical	AAB21627MC	ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates	Celltreat	229695	for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera	Zeiss		for morphology studies
puriFlash	interchim	XS520plus	flash chromatography purification system
resazurin	SIGMA-ALDRICH	R7017-1G	for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator	Heidolph	Hei-VAP Value "The Collegiate"	solvent evaporator
Sodium bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	S6014-500G	irritant, white powder
Sodium chloride	fisher chemical	S271-1	crystalline, colorless
Sodium chloride	SIGMA-ALDRICH	S5886-500G	for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate	SIGMA-ALDRICH	7985592-500G	anhydrous, granular, white
tryptone	fisher chemical	BP1421-500	for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation	Microbiology International	DG250	anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract	fisher chemical	BP1422-500	for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software	Zeiss		for acquiring micrographs