Synthese von Masarimycin, einem niedermolekularen Inhibitor des grampositiven Bakterienwachstums

Zusammenfassung

Es wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung des bakteriostatischen Diamid Masarimycin vorgestellt, einer niedermolekularen Sonde, die das Wachstum von Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae hemmt, indem sie auf den Abbau der Zellwand abzielt. Seine Anwendung als chemische Sonde wird in Synergie-/Antagonismus-Assays und morphologischen Studien mit B. subtilis und S. pneumoniae nachgewiesen.

Zusammenfassung

Peptidoglycan (PG) in der Zellwand von Bakterien ist eine einzigartige makromolekulare Struktur, die Form und Schutz vor der Umgebung verleiht. Zentral für das Verständnis des Zellwachstums und der Zellteilung ist das Wissen, wie der PG-Abbau die Biosynthese und den Zellwandaufbau beeinflusst. Kürzlich wurde über die metabolische Markierung von PG durch die Einführung von modifizierten Zuckern oder Aminosäuren berichtet. Während eine chemische Abfrage von Biosyntheseschritten mit niedermolekularen Inhibitoren möglich ist, sind chemisch-biologische Werkzeuge zur Untersuchung des PG-Abbaus durch Autolysine unterentwickelt. Bakterielle Autolysine sind eine breite Klasse von Enzymen, die am eng koordinierten Abbau von PG beteiligt sind. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung einer niedermolekularen Sonde, Masarimycin, einem Inhibitor von N-Acetylglucosaminidase LytG in Bacillus subtilis, und des Zellwandstoffwechsels in Streptococcus pneumoniae vorgestellt. Die Herstellung des Inhibitors über mikrowellengestützte und klassische organische Synthese ist vorgesehen. Seine Anwendbarkeit als Werkzeug zur Untersuchung der grampositiven Physiologie in biologischen Assays wird vorgestellt.

Einleitung

Peptidoglycan (PG) ist ein netzartiges Polymer, das die Zellform und -struktur sowohl in grampositiven als auch in gramnegativen Bakterien ^1,2 beschreibt. Dieses Heteropolymer ist eine Matrix von Aminozuckern, vernetzt durch kurze Peptide 3,4,5,6 mit einem Rückgrat^, das aus β-(^1,4)-verknüpften alternierenden N-Acetylglucosamin- (GlcNAc) und N-Acetylmuraminsäure (MurNAc)-Resten besteht (Abbildung 1)1. An den C-3-Lactylanteil von MurNAc ist das Stammpeptid gebunden. Der Metabolismus von PG beinhaltet ein eng koordiniertes System von biosynthetischen und abbaubaren Enzymen, um neues Material in die Zellwand einzubauen ^7,8. Der Abbau von PG erfolgt durch Enzyme, die zusammen als Autolysine⁹ bezeichnet und basierend auf der Spezifität der gespaltenen Bindung weiter klassifiziert werden. Autolysine nehmen an vielen zellulären Prozessen teil, einschließlich Zellwachstum, Zellteilung, Motilität, PG-Reifung, Chemotaxis, Proteinsekretion, genetischer Kompetenz, Differenzierung und Pathogenität^10,11. Die Entschlüsselung der spezifischen biologischen Funktionen einzelner Autolysine kann entmutigend sein, was zum Teil auf funktionelle Redundanz zurückzuführen ist. Jüngste biophysikalische 8,12,13 und Computerstudien ¹² haben jedoch neue Einblicke in ihre Rolle im PG-Stoffwechsel geliefert. Darüber hinaus haben jüngste Berichte weitere Einblicke in die Synthese¹⁴ und membranvermittelten 15,16,17 Schritte im PG-Metabolismus gegeben. Ein gründliches Verständnis der Beziehung zwischen abbauenden und synthetischen Signalwegen des PG-Stoffwechsels könnte zu bisher unerschlossenen Antibiotikazielen führen.

Während es signifikante Fortschritte in der Methodik zur Untersuchung der Glykobiologie bei Eukaryoten gegeben hat, ist die bakterielle Glykobiologie und insbesondere der PG-Stoffwechsel nicht mit einer ähnlichen Geschwindigkeit fortgeschritten. Aktuelle chemische Ansätze zur Untersuchung des PG-Stoffwechsels umfassen fluoreszenzmarkierte Antibiotika¹⁸, fluoreszierende Sonden 19,20 und metabolische Markierung 21,22,23,24. Diese neuen Ansätze bieten neue Möglichkeiten, den bakteriellen Zellwandstoffwechsel zu hinterfragen. Während einige dieser Strategien in der Lage sind, PG in vivo zu markieren, können sie artspezifisch¹⁹ sein oder nur in Stämmen funktionieren, denen ein bestimmtes Autolysin²⁵ fehlt. Viele PG-Markierungsstrategien sind für die Verwendung mit isolierten^{Zellwänden 26} oder mit in vitro rekonstituierten PG-Biosynthesewegen^20,27,28 vorgesehen. Der Einsatz fluoreszierend markierter Antibiotika beschränkt sich derzeit auf biosynthetische Schritte und Transpeptidation¹⁸.

Das aktuelle Wissen über bakterielle Autolysine und ihre Rolle im Zellwandstoffwechsel stammt aus genetischen und in vitro biochemischen Analysen 11,29,30,31,32. Während diese Ansätze eine Fülle von Informationen über diese wichtige Klasse von Enzymen geliefert haben, kann die Entschlüsselung ihrer biologischen Rolle eine Herausforderung sein. Zum Beispiel führt die Deletion eines Autolysins aufgrund der funktionellen Redundanz³³ in den meisten Fällen nicht dazu, dass das Bakterienwachstum gestoppt wird. Dies ist trotz ihrer impliziten Rolle beim Zellwachstum und der Zellteilung ^7,12. Eine weitere Komplikation ist, dass die genetische Deletion von bakteriellen Autolysinen zu Meta-Phänotypen³⁴ führen kann. Meta-Phänotypen entstehen aus dem komplexen Zusammenspiel zwischen dem von der genetischen Deletion betroffenen Signalweg und anderen miteinander verbundenen Wegen. Zum Beispiel kann ein Meta-Phänotyp über einen direkten Effekt wie das Fehlen eines Enzyms oder einen indirekten Effekt wie eine Störung der Regulatoren entstehen.

Derzeit gibt es nur wenige Inhibitoren von Glykosidasenautolysinen wie N-Acetylglucosaminidasen (GlcNAcase) und N-Acetylmuramidasen, die als chemische Sonden verwendet werden können, um den Abbau von PG zu untersuchen. Um dies zu beheben, wurde das Diamid-Masarimycin (früher als fgkc bezeichnet)^{identifiziert und 35} als bakteriostatischer Inhibitor des Bacillus subtilis-Wachstums charakterisiert, der auf das GlcNAcase LytG³² abzielt (Abbildung 1). LytG ist ein exo-wirkendes GlcNAcase³⁶, ein Mitglied von Cluster 2 innerhalb der Glykosylhydrolasefamilie 73 (GH73). Es ist das wichtigste aktive GlcNAcase während des vegetativen Wachstums³². Unseres Wissens ist Masarimycin der erste Inhibitor eines PG-wirkenden GlcNAcase, der das Zellwachstum hemmt. Zusätzliche Studien von Masarimycin mit Streptococcus pneumoniae ergaben, dass Masarimycin wahrscheinlich den Zellwandstoffwechsel in diesem Organismus^{hemmt 37}. Hier wird die Herstellung von Masarimycin zur Verwendung als chemisch-biologische Sonde zur Untersuchung der Physiologie in den grampositiven Organismen B. subtilis und S. pneumoniae berichtet. Es werden Beispiele für die morphologische Analyse der Behandlung der inhibitorischen Konzentration unter dem Minimum mit Masarimycin sowie ein Synergie-/Antagonismus-Assay vorgestellt. Synergie- und Antagonismus-Assays mit Antibiotika mit klar definierten Wirkungsweisen können ein nützlicher Weg sein, um Verbindungen zwischen zellulären Prozessen zu erforschen^38,39,40.

Protokoll

1. Allgemeine Methoden

HINWEIS: Alle Compounds wurden von Standardlieferanten bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet.

1. Führen Sie eine Dünnschichtchromatographie (TLC) auf einer mit Kieselgel XG F254 vorbeschichteten Aluminiumplatte durch. Erkennen Sie Flecken unter einer UV-Lampe, durch Eintauchen in p-Anisaldehydflecken oder durch Aussetzen von I_2-Dampf.
2. Zeichnen Sie alle Kernspinresonanzspektren (NMR) auf einem 400-MHz-Spektrometer auf.
   ANMERKUNG: 1 H-NMR- und ¹³C-NMR-Spektren wurden auf Restlösungsmittelspitzen bezogen^. Kopplungskonstanten sind in [Hz] und chemische Verschiebungen in [ppm] angegeben.
3. Record atmospheric pressure chemical ionization (APCI) Massenspektrometriespektren von Masarimycin auf einem kompakten Massenspektrometer, das mit einer atmosphärischen Feststoffanalysesonde ausgestattet ist.

2. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von Masarimycin

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einem Abzug aus.

1. Es wird eine 0,1 M Lösung in Methanol jedes Reaktanten hergestellt: Cyclohexylamin, Cyclohexylcarboxaldehyd, O-Iodbenzoesäure und Cyclohexylisocyanid³⁵.
   ACHTUNG: Cyclohexylamin, Cyclohexylisocyanid und Cyclohexylcarboxaldehyd sind brennbar. Sie können Hautkorrosion verursachen und orale, dermale, respiratorische oder reproduktive Toxizität induzieren. Halten Sie Verbindungen von offenen Flammen, heißen Oberflächen und Zündquellen fern. Tragen Sie einen geeigneten Haut- und Augenschutz, arbeiten Sie in einem gut belüfteten Bereich und vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen oder Nebel. Halten Sie die Flaschen zur Lagerung fest verschlossen und lagern Sie sie an einem kühlen, trockenen Ort. Lagern Sie Cyclohexylcarboxaldehyd in einem Exsikkator unter einer_{N2-Atmosphäre} .
2. Mischen Sie 5 ml Cyclohexylamin (0,1 M Lösung in Methanol) und 5 ml Cyclohexylcarboxaldehyd (0,1 M in Methanol) in einem verschlossenen runden Bodenkolben und rühren Sie die Lösung mit einem magnetischen Rührstab auf einer Rühr-/Kochplatte für 30 min bei 40 °C in einem Sandbad. Überwachen Sie die Temperatur mit einem Thermometer, das etwa 1 cm unter der Sandoberfläche platziert ist.
3. Nach 30 min werden 5 ml Cyclohexylisocyanid (0,1 m Lösung in Methanol) in die Lösung aus Schritt 2.2 gegeben und weitere 20 min bei 50 °C umgerührt. Zum Schluss werden 5 ml o-Jodbenzoesäure (0,1 m Lösung in Methanol) in das Reaktionsgemisch gegeben und bei 55 °C für 3-5 h weiter gerührt.
4. Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion regelmäßig durch TLC etwa jede Stunde, nachdem das obige Reaktionsgemisch 3 h lang gerührt wurde.
5. Schneiden Sie einen 3 cm x 6 cm großen Streifen aus TLC-Platte mit Aluminiumrücken. Zeichne mit einem Bleistift #2 eine Linie etwa 1 cm von unten. Platzieren Sie mit einer Glasmikrokapillare etwa 5 μL der Reaktionsmischung auf der TLC-Platte und lassen Sie sie trocknen.
6. Zu einem 150-ml-Becherglas fügen Sie genügend mobile Phase (90: 10-Hexan: Isopropanol) hinzu, um den Boden des Becherglases zu bedecken. Legen Sie die obige TLC-Platte vorsichtig mit einer Pinzette in das Becherglas, um sicherzustellen, dass die TLC-Platte gleichmäßig in die mobile Phase eintritt. Decken Sie die Oberseite des Becherglases mit einem Stück Alufolie ab.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die mobile Phase die Linie und die gefleckte Probe nicht bedeckt.
7. Lassen Sie die mobile Phase die TLC-Platte hinauffahren, bis sie etwa 1 cm unter der Oberseite der Platte liegt. Entfernen Sie die TLC-Platte und zeichnen Sie mit einem Bleistift eine Linie, die die von der mobilen Phase zurückgelegte Strecke angibt. Lassen Sie die TLC-Platte in einem Abzug trocknen.
8. Nach dem Trocknen legen Sie die TLC-Platte in ein Becherglas, das eine kleine Menge festes I₂ enthält, und bedecken Sie das Becherglas mit einem Stück Zinnfolie. Überwachen Sie die TLC auf die Entwicklung von gelben/braunen Flecken. Entfernen Sie nach der Entwicklung die TLC-Platte und markieren Sie die Position der Spots mit einem Bleistift (Ergänzende Abbildung 1).
   HINWEIS: Wenn I_{2 Flecken} nicht markiert sind, löst sich der Fleck im Laufe der Zeit auf. Flecken können auch auf der TLC-Platte durch UV-Licht, p-Anisaldehyd-Färbung oder Kaliumpermanganatfärbung sichtbar gemacht werden (siehe Ergänzende Informationen).
9. Berechnen Sie die_Rf-Werte für alle visualisierten Spots mit der folgenden Formel:
   R_f =
10. Betrachten Sie die Reaktion als abgeschlossen, wenn nur eine Stelle mit R_f = 0,3 auf der TLC-Platte sichtbar ist. Entfernen Sie das Lösungsmittel in einem rotatorischen Verdampfer unter reduziertem Druck und trocknen Sie das Rohprodukt (erhalten als gelblich-braunes Öl) unter einem Hochvakuum, bis das gesamte Methanol verdampft ist.
11. Lösen Sie das getrocknete Rohprodukt in 30 ml Ethylacetat auf und geben Sie es in einen separaten Trichter. Ethylacetat nacheinander mit 1 M HCl (2 x 30 ml), H2O (30 mL), gesättigter_{NaHCO3-Lösung} (2 x 30 ml),_H2O(30 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (2 x 30 ml) extrahieren_. Verwerfen Sie die wässrigen Schichten.
    HINWEIS: Die Ethylacetatschicht ist die oberste Schicht in jeder der Extraktionen. Schütteln Sie bei jeder Extraktion den Separationstrichter, der das Ethylacetat und die wässrige Lösung (HCl, H2O,_NaHCO3 oder NaCl) enthält, kräftig und lassen Sie die Schichten vollständig abscheiden.
12. Entfernen Sie die Ethylacetatschicht aus dem Separatorientrichter und sammeln Sie sie in einem Erlenmeyerkolben. Fügen Sie einen Spatel voll Na₂SO 4 (wasserfrei) hinzu_, um Restwasser aus Ethylacetat zu entfernen.
    HINWEIS: Die Ethylacetatlösung gilt als trocken, wenn_Na2SO4 im Kolben frei läuft und nicht verklumpt. Wenn_{Na2 SO}4 verklumpt, kann ein zusätzlicher Spatel Na₂SO₄ hinzugefügt werden.
13. Filtern Sie die getrocknete Ethylacetatlösung durch #1 Filterpapier, um_{Na2 SO4} zu entfernen. Waschen Sie das Filterpapier mit einer kleinen Menge Ethylacetat. Geben Sie die gefilterte Ethylacetatlösung in einen runden Bodenkolben und entfernen Sie das Lösungsmittel auf einem rotatorischen Verdampfer unter reduziertem Druck, um Masarimycin als Öl zu erhalten, sobald das gesamte Ethylacetat entfernt wurde.
14. Das oben erhaltene Masarimycinöl wird in einer minimalen Menge (1-2 ml) von 9:1 Hexan: Isopropanol gelöst und auf einer magnetischen Rührplatte umgerührt, bis die gesamte Verbindung gelöst ist.
15. Reinigen Sie das gelöste Masarimycin durch Flash-Chromatographie mit einer 12 g Normalphasen-Silica-Flash-Säule.
    1. Gleichen Sie die Blitzsäule mit 10 Säulenvolumina der mobilen Phase (99:1 Hexan: Isopropanol) aus, wobei das Gerät auf eine Durchflussrate von 15 ml/min eingestellt ist.
       HINWEIS: Nachdem das Gleichgewicht abgeschlossen ist, stoppen Sie den Fluss und trennen Sie die Oberseite der Säule vom System.
    2. Ziehen Sie gelöstes Masarimycin mit einer 5-ml-Spritze auf. Verbinden Sie die Spritze direkt mit der Oberseite der Gleichgewichtsblitzsäule und injizieren Sie die Lösung in die Säule. Schließen Sie die belastete Säule wieder an das Blitzchromatographiesystem an und initiieren Sie die Gradientenelution.
    3. Eludes Masarimycin aus der Säule mittels Gradientenelution zu einer Endkonzentration der mobilen Phase von 10:90 Hexan: Isopropanol über 12 Säulenvolumen. Überwachen Sie die Elution von Masarimycin durch Absorption bei 230 und 254 nm.
    4. Sammeln Sie die aus der Säule eluierten Verbindungen durch einen Fraktionssammler, der 20 ml Lösungsmittel pro Fraktion sammelt.
       HINWEIS: Wenn kein Flash-Chromatographie-System verfügbar ist, kann die Reinigung von Masarimycin über eine Schwerkraftkieselsäuresäule mit einer mobilen 3:1 (Hexan: Ethylacetat) Phase durchgeführt werden. Fraktionen, die Masarimycin enthalten, können durch TLC unter Verwendung derselben mobilen Phase identifiziert werden. Die Visualisierung von TLC-Spots erfolgte entweder mit UV-Licht,_I-2-Dampf oder Kaliumpermanganat-Färbung.
    5. Identifizierung von Masarimycin-haltigen Fraktionen durch TLC (Schritte 2.5-2.9) oder Massenspektrometrie auf einem kompakten Massenspektrometer, das mit einer atmosphärischen Feststoffanalysesonde ausgestattet ist. Trocknen Sie das Endprodukt unter Vakuum (~0,3 mbar).
       HINWEIS: Masarimycin wird routinemäßig als farbloses Öl oder Feststoff mit einer Ausbeute von 55% -70% in Bezug auf mmol von Cyclohexylcarboxaldehyd, das der Reaktion zugesetzt wird, erhalten. Berechnen Sie die Endausbeute von Masarimycin, indem Sie die Masse des gereinigten Masarimycins erhalten und die theoretische Ausbeute der Reaktion mit der folgenden Formel berechnen:
       % Ausbeute = x 100%
16. Bestätigen Sie die Struktur von Masarimycin durch NMR.
    1. Lösen Sie ~ 10 mg Masarimycin-Probe in 0,5 ml_{CDCl 3} auf. Übertragen Sie die Lösung mit einer Pasteur-Pipette auf ein 5-mm-NMR-Rohr und verschließen Sie das Rohr. Legen Sie die NMR-Röhre in das Spektrometer.
    2. Erfassen Sie ^1-H- und ^{13-C-NMR-Spektren}mit voreingestellten Experimenten des Herstellers. Chemische Schichtzuordnungen und repräsentative Spektren sind in den Ergänzungsabbildungen 3-4 enthalten.
17. Masarimycin trocken oder in DMSO gelöst (25 mM Endkonzentration) bei -20 °C bis zur Anwendung lagern.

3. Mikrowellenverfahren zur Herstellung von Masarimycin

1. Es werden 0,6 Mio. Lösungen von Cyclohexylamin, Cyclohexylcarboxaldehyd, Cyclohexylisocyanid und o-Iodbenzoesäure in Acetonitril hergestellt.
2. Fügen Sie einen Rührstab und 10 ml Acetonitril zu einer Mikrowellenreaktionsdurchstechflasche aus Glas hinzu.
3. 2 ml Cyclohexylamin (0,6 M in Acetonitril), 2 ml Cyclohexylcarboxaldehyd (0,6 M in Acetonitril) und 7 ml Acetonitril in die Durchstechflasche geben.
4. Legen Sie die Mikrowellen-Reaktionsdurchstechflasche in das Mikrowellenkarussell. Rühren Sie die Mischung um, erhitzen Sie sie für 30 min bei 50 ° C bei einer Leistungseinstellung von 400 W und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.
5. 2 ml o-Jodbenzoesäure (0,6 M in Methanol) und 2 ml Cyclohexylisocyanid (0,6 M in Acetonitril) in die Durchstechflasche geben. Rühren Sie die Mischung um, erhitzen Sie sie in der Mikrowelle für 40 min bei einer Leistungseinstellung von 400 W auf 100 °C und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.
6. Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion mit TLC (90:10 Hexan: Isopropanol) unter Verwendung von_I2-Dampf nach Abschluss von Schritt 3.5.
   HINWEIS: Wenn TLC zeigt, dass die Reaktion unvollständig ist (d. h. mehrere Flecken auf TLC), legen Sie die Reaktionsflasche wieder in die Mikrowelle und stellen Sie die in Schritt 3.5 beschriebenen Mikrowellenbedingungen ein.
7. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, gießen Sie die Lösung in einen 100 ml Rundbodenkolben und verdampfen Sie sie mit einem Rotationsverdampfer zum Trocknen.
8. Befolgen Sie die Schritte 2.6-2.16 oben, um die wässrige Aufarbeitung, Reinigung und Charakterisierung von Masarimycin abzuschließen.

4. Synergie- und Antagonismus-Assay

1. Züchten Sie Streptococcus pneumoniae R6 auf Mueller-Hinton (MH) Agarplatten mit 5% (v/v) Schafblut bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen. Verwenden Sie in allen Experimenten Zellen der zweiten Passage, die in 5 ml MH-Brühe bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen gezüchtet wurden, bis OD₆₀₀ ~ 0,4 beträgt.
2. Setzen Sie die Inhibitoren Masarimycin und Optochin seriellen 1:2-Verdünnungen in entsprechenden Lösungsmitteln aus, wobei die resultierenden Konzentrationen die minimalen Inhibitorkonzentrationswerte (MIC) jedes Inhibitors flankieren.
   1. Machen Sie die anfängliche Verdünnung von Masarimycin in Dimethylsulfoxid (DMSO), bis eine Konzentration von 100 μM erreicht ist. Machen Sie ab diesem Punkt Masarimycin-Verdünnungen in MH-Brühe. Bereiten Sie die Optochin-Stammlösung (3,5 mM) vor, indem Sie handelsübliches Optochin (siehe Materialverzeichnis) in steriler MH-Brühe auflösen.
      HINWEIS: Masarimycin-Stammlösungen wurden bei 25 mM in DMSO hergestellt.
3. Zu einer sterilen 96-Well-Mikrotiterplatte fügen Sie 2 μL Aliquots jeder Optochinverdünnung zu jeder Reihe der Platte hinzu. Zu derselben Platte fügen Sie 2 μL Aliquots jeder Masarimycin-Verdünnung zu jeder Spalte hinzu, um eine Reihe von Optochin- und Masarimycin-Konzentrationen auf der Platte zu erzeugen (Abbildung 2).
4. Fügen Sie sterile MH-Brühe (93 μL) zu jeder Vertiefung hinzu, die die oben genannten Inhibitoren enthält. Die Mikrotiterplatten werden mit 5 μL Kultur (OD_{600 ~0,4)} aus Schritt 4.1 beimpft.
   HINWEIS: Die Impfung der 96-Well-Platte erfolgt typischerweise unter anaeroben Bedingungen an einem anaeroben Arbeitsplatz. Das endgültige Volumen im Bohrloch beträgt 100 μL.
5. Züchten Sie Kulturen für 18 h bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen, gefolgt von der Zugabe von 30 μL 0,01% (m/v) Lösung von Resazurin-Natriumsalz. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 15 Minuten, um die Bildung und Stabilisierung der Farbe zu ermöglichen.
   HINWEIS: Resazurinlösung wird durch Auflösen der Verbindung in destilliertem Wasser hergestellt und kann bei 4 °C bis zu zwei Wochen gelagert werden.
6. Lesen Sie die Konzentrationswerte direkt von der Platte ab und weisen Sie die niedrigste Inhibitorkonzentration, für die kein Bakterienwachstum beobachtet wird (blaue Farbe), als [X] zu (siehe Schritt 4.7.1), d.h. die niedrigste inhibitorische Konzentration des Arzneimittels in Gegenwart des Co-Arzneimittels.
   HINWEIS: Positives Bakterienwachstum wird in den Vertiefungen durch den rosa werdenden Resazurinfarbstoff identifiziert. MIC-Werte für jedes Arzneimittel allein (d. h. in Abwesenheit eines Co-Arzneimittels) werden auf ähnliche Weise unter Verwendung des Resazurin-MIC-Assays³⁵ mit jedem Arzneimittel separat bestimmt (Ergänzende Abbildung 5). MICs in S. pneumoniae betragen 7,8 μM bzw. 15,85 μM für Masarimycin bzw. Optochin.
7. Bestimmen Sie die fraktionierte inhibitorische Konzentration (FIC) und den FIC-Index (FIC_I) mithilfe der folgenden Gleichungen.
   1. FIC= [X]/MIC x, wobei [X] (aus Schritt 4.6) die niedrigste inhibitorische Konzentration des Arzneimittels in Gegenwart des Co-Arzneimittels und MIC_x die niedrigste hemmende Konzentration des Arzneimittels in Abwesenheit des Co-Arzneimittels ist.
   2. FIC_I = FIC_Masarimycin + FIC_Antibiotikum
      ANMERKUNG: FIC I < 0,5 = synergistisch, 0,5 <_FIC I < 1 = additiv, 1 < FIC I < 4 = gleichgültig,_{FIC I} > 4 = antagonistisch.

5. Morphologische Untersuchung

1. Züchten Sie Bacillus subtilis 11774 auf Luria-Bertani (LB) Agarplatten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt und 5 g/L NaCl) mit 1,5% Bacto-Agar bei 37 °C. Verwenden Sie in allen Experimenten Zellen der zweiten Passage, die in 5 ml LB-Brühe bei 37 ° C bis OD₆₀₀ = 1 gezüchtet wurden. Züchten Sie S.pneumoniae auf die gleiche Weise wie in Schritt 4.1.
2. Nach Erhalt einer Zellkulturdichte mit OD 600nm = 1 für B. subtilis oder OD_600nm = 0,4 für S. pneumoniae wird Masarimycin mit einer Pipette zu dem als "behandelt" bezeichneten Kulturröhrchen bis zu einer Endkonzentration von 3,8 μM (0,75x MIC für B.subtilis) oder 5,85 μM (0,75x MIC für S.pneumoniae) zugegeben. Fügen Sie dem zweiten Kulturröhrchen mit der Bezeichnung "Steuerung" ein äquivalentes Volumen von DMSO hinzu.
3. Für B.subtilis legen Sie die Proben 90 min lang in einen Inkubator bei 37 °C mit Schütteln bei 150 U/min. Bei S. pneumoniae die Zellen unter anaeroben Bedingungen ohne Schütteln inkubieren.
4. Nach 90 min die Kulturen in einem 1:10-Gemisch (v/v) aus Kulturmedien und Fixierpuffer (20 mM HEPES, 1% Formaldehyd (pH 6,8)) bei 4 °C über Nacht chemisch fixieren. Nachdem die Fixierung abgeschlossen ist, tragen Sie 10-20 μL Proben mit einer Pipette auf Glasmikroskopobjektträger auf und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Fixieren Sie die luftgetrockneten Proben, indem Sie die Glasobjektträger mit einem Bunsenbrenner erhitzen.
5. Nach der Hitzefixierung die Proben unter Zugabe von 100 μL 0,1% (m/v) Methylenblau (Lösung in 20% (v/v) Ethanol) färben. Die gebeizten Objektträger für 10 min inkubieren und den überschüssigen Farbstoff mit dH₂O wegwaschen. Dann erhitzen Sie die gefärbten Objektträger vorsichtig auf 60 ° C in einem Ofen für 15-20 Minuten, um die Zellen auf eine gemeinsame Fokusebene zu bringen.
6. Verschließen Sie die gefärbten Proben, indem Sie ein Mikroskop-Deckglas über die gefärbten Zellen legen. Versiegeln Sie dann die Kanten mit Objektträgerzement. Legen Sie den versiegelten Objektträger auf den Mikroskoptisch und bringen Sie das Bild mit 100-facher Vergrößerung mittels Hellfeldmikroskopie in den Fokus.
7. Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf den Objektträger und bringen Sie das Sichtfeld mit 1000-facher Vergrößerung in den Fokus. Erfassen Sie Mikroaufnahmen mit einer Kamera, die an das Mikroskop und die zugehörige Software angeschlossen ist. Erfassen Sie Bilder mit den Einstellungen für den automatischen Weißabgleich und die Blende in der Software.
   HINWEIS: Alternativ können Bilder mit der Open-Source-Software ImageJ verarbeitet werden.

Ergebnisse

Masarimycin ist ein niedermolekularer bakteriostatischer Inhibitor von B. subtilis und S. pneumoniae und hemmt nachweislich das exo-wirkende GlcNAcase LytG in B. subtilis ^35,37 und zielt in S. pneumoniae ³⁷ auf die Zellwand ab. Masarimycin kann entweder durch die klassische oder mikrowellengestützte organische Synthese mit Ausbeuten im Bereich von 55% -70% effizient hergestellt werden. Die mikrowellenge...

Diskussion

Masarimycin ist ein einzelner mikromolarer bakteriostatischer Inhibitor des Wachstums von B. subtilis 35 und S. pneumoniae^37. In B. subtilis wurde gezeigt, dass Masarimycin das GlcNAcase LytG³⁵ hemmt, während das genaue molekulare Ziel in der Zellwand von S. pneumoniae nicht identifiziert^{wurde 37}. Die Synthese von Masarimycin entweder mit dem klassischen organischen Synthese- oder Mikrowellenverfahr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Iodobenzoic acid	SIGMA-ALDRICH	I7675-25G	corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	109827-4L	flammable, irritant, colorless liquid
Acetonitrile	SIGMA-ALDRICH	34851-4L	flammable, irritant, colorless liquid
Aluminum backed silica plates	Sorbtech	4434126	silica gel XG F254 on aluminum backed plates
chloroform-d	SIGMA-ALDRICH	151823-50G	solvent for NMR
Compact Mass Spectrometer	Advion-Interchim	Advion CMS	compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile	fisher chemical	07-200-90	for synergy/antagonism assays
cover slips	fisher chemical	12-547	for microscopy
Cyclohexanecarboxaldehyde	CHEM-IMPEX INT'L INC.	24451	flammable, irritant, colorless to pink liquid
Cyclohexyl isocyanide	SIGMA-ALDRICH	133302-5G	irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor
Cyclohexylamine	SIGMA-ALDRICH	240648-100ML	corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated
Ethyl acetate	SIGMA-ALDRICH	537446-4L	flammable, irritant, colorless liquid
flash silica cartridge (12g)	Advion-Interchim	PF-50SIHP-F0012	pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin
formaldehyde	SIGMA-ALDRICH	F8775-25ML	fixing agent for microscopy
HEPES	SIGMA-ALDRICH	H8651-25G	buffer for microscopy fixing solution
Hexane, mixture of isomers	SIGMA-ALDRICH	178918-4L	environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid
High performance compact mass spectrometer	Advion	expression	Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution
High Vac	eppendorf	Vacufuge plus	vacuum aided by centrifugal force and temperature
Hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	258148-2.5L	corrosive, irritant, colorless liquid
hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	320331-2.5L	strong acid
immersion oil	fisher chemical	12-365-19	for microscopy
Iodine, resublimed crystals	Alfa Aesar	41955	environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals
Mestre Mnova	MestreLab Research		software for processing NMR spectra
Methanol	SIGMA-ALDRICH	439193-4L	flammable, toxic, health hazard, colorless liquid
methylene blue	SIGMA-ALDRICH	M9140-25G	microscopy stain for staining cell walls
meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood	fisher chemical	B21176X	growth media for Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton broth	fisher chemical	DF0757-17-6	growth media for Streptococcus pneumoniae
microscope slides	fisher chemical	22-310397	for microscopy
Microwave Synthesis Labstation	MILESTONE	START SYNTH	device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel
NMR tubes	SIGMA-ALDRICH	Z562769-5EA	5mm NMR tubes 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR)	Bruker	Ascend 400	large superconducting magnet (400MHz)
optochin	fisher chemical	AAB21627MC	ethylhydrocupreine hydrochloride
petrie plates	Celltreat	229695	for preparing agar plates for bacterial growth
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera	Zeiss		for morphology studies
puriFlash	interchim	XS520plus	flash chromatography purification system
resazurin	SIGMA-ALDRICH	R7017-1G	for synergy/antagonism assays
Rotary Evaporator	Heidolph	Hei-VAP Value "The Collegiate"	solvent evaporator
Sodium bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	S6014-500G	irritant, white powder
Sodium chloride	fisher chemical	S271-1	crystalline, colorless
Sodium chloride	SIGMA-ALDRICH	S5886-500G	for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Sodium sulfate	SIGMA-ALDRICH	7985592-500G	anhydrous, granular, white
tryptone	fisher chemical	BP1421-500	for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Whitney DG250 Workstation	Microbiology International	DG250	anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen
yeast extract	fisher chemical	BP1422-500	for growth of B.subtilis and preparation of LB media
Zen Lite (blue) software	Zeiss		for acquiring micrographs