Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

Özet

Caenorhabditis elegans'ta rutin olarak kullanılan RNA girişimi (RNAi) için bir dağıtım yöntemi olan bakteriler tarafından üretilen dsRNA'nın oral yoldan uygulanması, burada yetişkin sivrisineklere başarıyla uygulanmıştır. Yöntemimiz, enjeksiyon kullanmadan sağlam ters genetik çalışmalarına ve iletimi engelleyen vektör çalışmalarına izin verir.

Özet

RNA girişimi, yirmi yıldır ters genetik analiz için yoğun olarak kullanılan bir araç olmuştur. Yetişkin sivrisineklerde, çift sarmallı RNA (dsRNA) uygulaması, öncelikle önemli ölçüde zaman gerektiren ve saha uygulamaları için uygun olmayan enjeksiyon yoluyla gerçekleştirilmiştir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, burada dsRNA'nın yetişkin Anopheles gambiae'ye oral yoldan verilmesi yoluyla RNAi'nin sağlam aktivasyonu için daha etkili bir yöntem sunuyoruz. HT115 (DE3) Escherichia coli suşunda uzun dsRNA'lar üretildi ve yetişkin sivrisineklere pamuk topları ad-libitum üzerinde% 10 sakarozda ısıdan öldürülen dsRNA içeren bakterilerin konsantre bir süspansiyonu sunuldu. Pamuk topları tedavi süresince her 2 günde bir değiştirildi. Bu yöntemin doublesex'i (cinsiyet farklılaşmasında rol oynayan bir gen) veya çatal kafasını (tükürük bezi transkripsiyon faktörünü kodlayan) hedeflemek için kullanılması, sırasıyla kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qRT-PCR) veya floresan konfokal mikroskopi ile ölçüldüğü gibi, hedef gen ekspresyonunun ve / veya protein immünofloresan sinyalinin azalmasına neden olmuştur. Tükürük bezi morfolojisinde de defektler gözlendi. Bu son derece esnek, kullanıcı dostu, düşük maliyetli, zaman verimli dsRNA dağıtım yöntemi, böcek vektör fizyolojisi ve ötesi için önemli olan hedef genlere geniş çapta uygulanabilir.

Giriş

Birçok hastalık sivrisinekler tarafından bulaşır, bu da sivrisinek fizyolojisi ve genetiğinin incelenmesini önemli bir girişim haline getirir. RNAi'nin bu organizmalarda kullanımı son 20 yılda öne çıkmış ve birçok sivrisinek geninin 1,2,3,4,5 fonksiyonel karakterizasyonuna izin vermiştir. DsRNA dağıtımı için en yaygın kullanılan teknik, sivrisineklere zarar verebileceği ve önemli zaman ve çaba gerektiren dezavantajları olan mikroenjeksiyon olmuştur. RNAi için oral dağıtım yöntemleri test edilmiştir, ancak esas olarak sivrisineklerin larva aşamasında ^6,7,8,9. Yetişkin sivrisineklerde dsRNA'nın oral yoldan verilmesi tam olarak araştırılmamıştır ve vektör biyolojisi ve vektör kontrolünün incelenmesi için yararlı bir araç olabilir.

Sıtma, enfekte bir dişi sivrisinek enfekte olmamış bir konakçıdan kan unu aldığında ve sıtma parazitleri içeren tükürük enjekte ettiğinde Anopheles sivrisinekleri tarafından bulaşır10. Nihayetinde bir sivrisinek tükürüğünde bulaşması için, parazit sivrisinek bağışıklık sisteminden kaçma, midgut bariyerinin geçişi ve tükürük bezlerinin istilası da dahil olmak üzere birçok engelin üstesinden gelmelidir¹¹. Sivrisinek tükürük bezi (SG) mimarisi parazit invazyonunun anahtarıdır ve bu mimari hem anahtar tükürük bezi eksprese edilen transkripsiyon faktörleri hem de cinsel dimorfizmin belirleyicileri tarafından kontrol edilir. Tükürük bezlerinin hücresel spesifikasyonu ve homeostatik bakımı ve kan beslenmesinde işlev gören tükürük proteinlerinin üretimi ve sekresyonu için çeşitli yüksek oranda korunmuş transkripsiyon faktörleri gereklidir^12,13,14. Çatal başı (Fkh), böcek SG yapısının ve işlevinin önemli bir düzenleyicisi olarak işlev gören kanatlı bir sarmal transkripsiyon faktörüdür (meyve sinekleri ve ipekböceği güvesi üzerindeki çalışmalara dayanarak)15,16,17,18,19,20. Drosophila SG'lerde Fkh, SG sağkalımını ve tükürük üretimini teşvik etmek için SG'ye özgü bir temel sarmal-döngü-sarmal (bHLH) transkripsiyon faktörü olan Adaçayı ile birlikte işlev görür¹⁹. Drosophila'da tükürük üretiminin önemli, pozitif bir eş düzenleyicisi, salgı yolu genlerinin ekspresyonunu düzenleyen iyi çalışılmış bir lösin fermuar transkripsiyon faktörü olan CrebA'dır^21,22,23. Ayrıca, kadın tükürük bezlerinde, sadece kan beslenmesinde değil, aynı zamanda parazitlerin bu dokuyu istila etme kabiliyetinde de önemli bir rol oynayan güçlü bir morfolojik farklılaşma derecesi vardır²⁴.

Tükürük bezi sağkalımını, yapısını, fizyolojisini ve cinsel dimorfizmini belirlemede rol oynayan genlerin çoğu, karmaşık uzaysal zamansal ekspresyon profillerine sahiptir^25,26,27 ve RNAi'yi indüklemek için dsRNA'nın geleneksel dağıtım yöntemleri^, bu veya diğer dokulardaki bu tür genleri hedeflemede her zaman etkili değildir. Bununla birlikte, larva evresinde dsRNA'nın oral yoldan verilmesi Aedes aegypti ve An. gambiae sivrisinekleri, dsx geninin ^9,28 dişiye özgü formunu susturmak için başarıyla kullanılmıştır. Sivrisinek tükürük bezlerinde dsRNA kullanan önceki çalışmalar, büyük miktarlarda dsRNA'ya ihtiyaç duyulmasına rağmen, susturma etkisinin nispeten uzun süreli (en az 13 gün) olduğunu ^bulmuştur29. Burada, dsx, fkh veya CrebA için diziye özgü dsRNA'yı eksprese eden ısıdan öldürülmüş E. coli suşu HT115'in (DE3) yetişkin dişi sivrisineklerde bu genlerin RNAi susturulmasını indükleme yeteneği test edilmiştir. An. gambiae'de dsRNA kaynaklı gen yıkımının oral yoldan uygulanması, mRNA seviyelerinde belirgin azalmalar ve bu genlerin fonksiyon kaybı ile tutarlı fenotiplerle. Bu nedenle, bu yaklaşım muhtemelen çeşitli tükürük bezi genlerinin işlevini yıkmak için çalışacaktır.

Protokol

1. DsRNA'nın E. coli ekspresyon vektörüne klonlanması

1. dsRNA'nın ekspresyonu için uygun bir vektöre eklenecek hedef gen dizisini seçin. Aşağıdaki yöntemi kullanarak Vectorbase.org ifade değerlerini alın.
   1. Ana sayfa arama kutusunda ilgilendiğiniz bir geni (örneğin, Tablo 1) arayın.
   2. Ortaya çıkan gen sayfasında, 8. Transkriptomik bölümü.
   3. Listelenen ilgili RNA-seq ve mikroarray gen ekspresyon deneylerini arayın.
   4. İlgilenilen değerleri elektronik tablo yazılımına aktarın ve bir veri tablosu oluşturun.
2. Kullanılacak en az bir T7 promotörü ile piyasada satılan bir plazmid seçin. Seçilen plazmidin sadece bir T7 promotörü varsa (çoğu ticari plazmidin yaptığı gibi), ilgilenilen gen için dsDNA'nın amplifikasyonunda kullanılmak üzere ters astara ikinci bir T7 promotörü ekleyin.
   NOT: Hedef genler için dsRNA dizisi, RNAi reaktiflerinin tasarımı için E-RNAi web uygulaması kullanılarak seçilebilir³⁰. Uzun dsRNA (yaklaşık 400 bp) veya kısa saç tokası dsRNA (shRNA), spesifik gen dizilerine dayanarak tasarlanabilir. Bu diziler, klonlamadan önce kimlik doğrulaması için yükseltilmeli ve sıralanmalıdır. Bu çalışmada kullanılan seçilmiş gen bölgeleri, plazmidler ve promotörler Ek Dosya 1'de listelenmiştir.
3. Daha önce ^9,31'de açıklanan basit bir tek adımlı prosedüre göre klonlama yapın. Bu amaçla, PCR ürününü saflaştırın ve doğrusallaştırılmış plazmid DNA'sına bağ yapın. Yetkili E. coli hücrelerinin ısı-şok dönüşümü için ligasyon ürününü kullanın³². Dönüştürülen hücreleri mavi/beyaz tarama yoluyla seçin. T7-primer PCR kullanarak kesici ucun yönünü onaylayın ve M13 astarları kullanarak sırayı onaylayın.
   NOT: Beyaz/mavi taramalar, transformasyon için seçilen plazmid, β-galaktosidazı kodlayan lakZ genini taşıdığında kullanılabilir. Beyaz koloniler lacZ içinde istenen eki içermelidir ve hedef dizi^33'ün varlığını ve yönünü daha da doğrulamak için seçilebilir.
4. Plazmidi ilk dönüşümden arındırın ve daha önce tarif edildiği gibi yetkin E. coli HT115'i (DE3) dönüştürmek için kullanın³⁴. Kesici uçlu plazmidin yetkili E. coli HT115'te (DE3) bulunduğunu doğruladıktan sonra, tek kullanım için gliserol bakteri stokları yapın.
   NOT: Her deneyde kullanılmak üzere uygun bir ilişkili olmayan kontrol dsRNA'sı edinilmeli veya hazırlanmalıdır. Bu durumda, Arabidopsis thaliana'dan ilgisiz gen aintegumenta (karınca) dizisi kullanılır.

2. dsRNA'yı eksprese eden ısıda öldürülen bakterilerin hazırlanması

1. 100 μg / mL ampisilin ve 12.5 μg / mL tetrasiklin içeren 50 mL Luria Broth (LB) içinde plazmidi ifade eden dsRNA'yı içeren E. coli suşu HT115'in (DE3) tek bir bakteri kolonisinden, 12 saat boyunca 37 ° C'de bir platform çalkalayıcıda (180 rpm) bir kültür büyütün.
2. Bakteri kültürünü (1:1000), 100 μg / mL ampisilin ve 12.5 μg / mL tetrasiklin içeren 2x Maya Tripton (2x YT) ortamına seyreltin.
3. 40 μM (son konsantrasyon) izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ekleyerek dsRNA üretimini indükleyin.
4. Hücreler bir O.D.600 = 0.4'e ulaştığında, yaklaşık 2 saat indüksiyondan sonra, 37 ° C'de 180 rpm'de ajitasyon ile, Taracena ve ark. ⁹ tarafından tanımlandığı gibi ısıda öldürülen bakterilerin konsantre bir süspansiyonunu hazırlayın. Hücreleri santrifüjleme (4000 x g, 4 °C, 10 dakika) ile pelet edin ve hücreleri bir hacim sodyum fosfat tamponunda (PBS) yıkayın.
5. Aynı koşullar altında tekrar döndürün, PBS'de başlangıç hacminin 1 / 100'üne kadar tekrar askıya alın ve 1 saat boyunca 70 ° C'ye yerleştirin.
6. Isı ile öldürülen bakterilerin 400 μL alikotunu yapın ve bu alikotları daha fazla kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın (bir haftadan fazla saklamayın). Isı ile öldürülen bakterilerin bu süspansiyonu, RNAi deneyleri için spesifik dsRNA'yı içerir. Bu prosedürü hem hedef gen dsRNA-bakterileri hem de her deneyde kullanılacak ilişkisiz dsRNA-kontrolü için uygulayın.

3. Sivrisinekleri dsRNA'yı eksprese eden ısıdan öldürülmüş bakterilerle beslemek

1. Bir dsRNA aliquotunu (HT115 (DE3) bakteri süspansiyonu) defrost edin ve% 0.2 metilparaben içeren 1.6 mL% 12 şeker çözeltisi ile karıştırın.
2. Bu çözeltiye küçük bir pamuk topu batırın ve ıslatılmış pamuk topunu 5 günlük sivrisinekler içeren bir kafesin içine yerleştirin. Sivrisineklerin bu çözelti ile beslendiğinden emin olun, hem şekeri hem de dsRNA içeren bakterileri aynı anda toplayın.
3. dsRNA-şeker çözeltisine batırılmış pamuk topunu art arda 8 gün boyunca her gün değiştirin.
4. Sivrisinek kafeslerini sabit koşullar altında, yani 27 °C ve% 80 bağıl nemde, 12 saat ışıkta fotoperiyotta tutun: karanlık fotosiklus, 30 dakikalık şafak ve 30 dakikalık alacakaranlık periyodu ile ayrılmış.

4. Hedef gen ekspresyon seviyelerini test edin

1. Kabı bir dakika boyunca veya sivrisinekler hareket etmeyi bırakana kadar buz üzerine yerleştirerek sivrisinekleri soğuk anestezi altına alın. Sivrisinekler anestezi uygulandıktan sonra, diseksiyon için dişileri izole etmek için onları soğuk bir yüzeye yerleştirin.
2. Sivrisineklere% 70 etanol püskürtün ve PBS ile cam bir yüzeye yerleştirin. Bir çift forseps ile, sivrisinek kafasını sabit bir şekilde sabitleyin ve göğüs kafesini çok yavaş çekin, tükürük bezlerinin PBS'ye salınmasına izin verin.
3. Tükürük bezlerini, 10 kişi diseke edilene kadar buz gibi soğuk PBS'de tutun. Guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform yöntemini kullanarak RNA ekstraksiyonu için Havuz On SG'ler. RNA peletini 30 μL RNaz içermeyen suda askıya alın.
4. 260 ve 280 nm'de absorbansı okumak ve seyreltme faktörü ile çarparak her numunenin RNA konsantrasyonunu hesaplamak için önceki adımda SG'den ekstrakte edilen RNA'nın 1 μL aliquot'unu kullanın. ~2.0'lık bir 260/280 oranı, iyi kalitede RNA'yı gösterir.
5. Ticari bir ters transkripsiyon kiti kullanarak tamamlayıcı DNA'yı (cDNA) sentezlemek için 1 μg saflaştırılmış RNA kullanın.
6. Üreticinin tavsiyelerine göre bir RT-PCR reaksiyonu hazırlamak için cDNA'nın 1:10 seyreltilmesini yapın. Her örnek için, hedef gen için bir reaksiyon hazırlayın ve paralel olarak, temizlik (HK) geni ile bir reaksiyon ayarlayın. Yöntemden rastgele varyasyonun etkisini ortadan kaldırmak için her gen reaksiyonunu teknik bir üçlüye ayarlayın.
   NOT: Burada, HK genleri olarak An. gambiae ribozomal S7 geni (GeneBank: L20837.1) ve aktin (VectorBase: AGAP000651) kullanılmıştır.
7. Tüm primerleri, SYBR-green üreticisinin endikasyonlarını takip ederek 300 nM'lik son konsantrasyonda kullanın. Standart PCR koşullarıyla yükseltin: 10 dakika boyunca 95 °C, ardından 95 °C'de 15 sn ve 60 °C'de 60 s'lik 40 döngü.
   NOT: Gen ekspresyonunu ölçmek için delta-delta-Ct yöntemi (ΔΔCt) kullanılır. Delta Ct (ΔCt), hedef genin Ct ile temizlik geninin Ct arasındaki farktır. ΔΔCt, deney grubunun ΔCt'si ile kontrol grubu^35'in ΔCt'si arasındaki farktır.

5. Fenotipik değerlendirme: başarılı kan besleme

1. Kan besleme yeteneğini değerlendirmek için, hedef ile tedavi edilen 15 dişi sivrisinek gruplarını ayarlayın ve dsRNA'yı küçük kafeslerde (12 cm çapında) kontrol edin ve 4 saat boyunca aç bırakın.
2. 37 ° C'ye ayarlanmış bir sirkülasyon suyu banyosu kullanarak, cam sivrisinek besleyiciler (24 mm çapında) ve parafilm membranı, sivrisineklere defibrinlenmiş koyun kanı sunar.
   NOT: Kan, ABD menşeli sağlıklı, donör hayvanlardan aseptik olarak çeken ve antikoagülanlar veya katkı maddeleri olmadan manuel olarak defibrinasyon yapan ticari bir satıcıdan alınabilir.
3. Doğrudan gözlemle, her gruba tamamen dahil olmak için ilk beş dişiden başarılı bir şekilde kan unu elde etmek için yapılan sondalama girişimlerinin sayısını sayın ve kaydedin.
   NOT: Sivrisineklerde, kan arama davranışını etkileyen enerji kaynaklarına müdahale edebilecek önemli metabolik değişikliklerden kaçınmak için, açlık minimumda tutuldu (4 saat). Sonuç olarak, her sivrisinek hevesle kan unu aramaz ve insan kokusuna maruz kalma, odalar ve beslenme yüzeyleri arasındaki sıcaklık değişimi gibi zaman değişkenlerinin etkisini azaltmak için engorged dişilerin sayısını beşle (her grubun toplamının üçte biri) sınırladık.

6. Fenotipik değerlendirme: Tükürük bezi morfolojisi ve ilgili proteinlerin aşağı regülasyonu

1. Taze dokuyu adım 4.2'de açıklandığı gibi 1x Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde izole edin ve 90 saniye boyunca buz gibi soğuk asetonda sabitleyin. Asetonu çıkardıktan sonra 1x PBS'de birkaç kez durulayın. 1x PBS'ye seyreltilmiş antiserum ile 4 ° C'de gece boyunca birincil antikorlarla inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Tükürük proteinleri için kullanılan birincil antikorların tanımlanması için Malzemeler Tablosuna bakınız (Anopheles anti-platelet protein, AAPP; Müsin 2, MUC2), SG transkripsiyon faktörleri (Çatal Kafası, fkh; Adaçayı, adaçayı; Siklik-AMP yanıt elemanı bağlayıcı protein A, CrebA) ve salgı veziküllerinin bir belirteci (Rab11). Bu antikorlar SG formu ve fonksiyonu için okuma olarak kullanılır. Bununla birlikte, immünofloresan için uygun herhangi bir antikor bu protokol için uygun olmalıdır.
2. 1x PBS'de birkaç kez yıkayın. 1x PBS'de seyreltilmiş ikincil antikorlar (floresan) ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. Herhangi bir karşı leke ekleyin [örneğin 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; DNA), buğday tohumu aglutinin (WGA; kitin için), falloidin (F-aktin için) ve / veya Nil Kırmızısı (lipitler için)] 2 saatlik inkübasyonun bitiminden 30 dakika önce.
3. 1x PBS'de üç kez yıkayın. Daha sonra, dokuları% 100 gliserol içine 1 mm kalınlığında bir kapak kayması ile standart bir mikroskop slaydına monte edin ve floresan konfokal mikroskop kullanarak görüntülemeye kadar -20 ° C'de saklayın.
   NOT: Kantitatif veriler elde etmek için, görüntüleme ayarları sabit tutulmalıdır. Burada, dokunun tüm 3D hacmi boyunca yalnızca maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüleri dahil edildi ve tüm görüntü niceliği, SG olmayan doku kalıntılarındaki (yağ gövdesi, kütikül veya kafa) DAPI sinyaline dayanan tedaviler arasında (bir deney dahilinde) normalleştirildi. slaytta da bulunur.

Sonuçlar

Başlamak için, mevcut çalışmayla ilgili tüm genlerin ekspresyon durumunu belirlemek için gelişimsel aşamalar^36,37 boyunca potansiyel hedefleri taramak için VectorBase'den mikroarray ekspresyon verileri kullanılmıştır (Tablo 1). Beklendiği gibi, seçtiğimiz tüm hedef genler yetişkin SG'lerde ekspresyon gösterdi. aapp ve adaçayı seviyeleri özellikle yüksekti (Tablo 1). Ayrıca, yetişkin dişi SG'lerde f-Agdsx'in yüksek ekspresyon seviyeleri de dikkat çekiciydi⁹.

RNAi reaktiflerinin tasarımı için E-RNAi web uygulaması kullanılarak dsRNA olarak kullanılmak üzere her genden spesifik segmentler değerlendirildi ³⁰. Her bir hedef gene özgü diziler içeren ~ 400 bp bölgeleri daha sonra klonlandı (Şekil 1A), uygun bakteri suşlarına dönüştürüldü ve dsRNA üretmek için indüklenen ısıda öldürülen bakterilerin süspansiyonlarını hazırlamak için kullanıldı. Yetişkin sivrisinekler, f-Agdsx, fkh veya karınca (ilgisiz negatif kontrol) için dsRNA'nın bakteriyel süspansiyonlarını içeren sakkarozla ıslatılmış pamuk topları üzerinde 8 gün boyunca beslendi.

Dişi sivrisineklerin RNAi beslemesinin analizi için, ilk önce f-Agdsx veya fkh dsRNA beslemelerinin gen susturmaya neden olup olmadığı belirlendi. fkh-dsRNA ile beslenen grupta fkh-dsRNA düzeylerinde %98.8'lik bir azalma (±2.1) gözlenmiştir (Şekil 1B), dsRNA'nın SG'lerde fkh transkriptlerinin bolluğunu çok etkili bir şekilde azalttığını göstermektedir. Şaşırtıcı bir şekilde, fkh mRNA seviyeleri, f-Agdsx için dsRNA ile tedavi edilen sivrisineklerde% 89.86 (±4.48) oranında f-Agdsx indirgemesine sahip olan% 82.0 (±18.9) oranında azalmıştır. fkh'nin tükürük bezinde F-Dsx'in hedefi olabileceğini düşündürmektedir. Fkh ekspresyon seviyelerindeki önemli azalma ile birlikte, fkh-knockdown sivrisinekleri, kan beslemek için gereken sondalama girişimlerinin sayısında önemli bir artış göstermiştir. Bu sivrisinekler, ortalama olarak, kontrol grubundan veya f-Agdsx dsRNA ile beslenen sivrisineklerden beş kat daha fazla beslenme girişimi sergilediler (Şekil 1C). Bu, fkh knockdown RNAi tedavilerinin anahtar transkripsiyonel düzenleyicilerin (SG TF'ler Adaçayı ve CrebA) (Şekil 2), salgılanan proteinlerin (AAPP ve müsin) (Şekil 3) ve salgı makinelerinin [Nil Kırmızısı (lipitler) ve Rab11 (salgı vezikülleri)] (Şekil 4) lokalizasyonunda ve / veya dağılımında değişikliklere neden olup olmadığını sormaya yol açtı. Önemli olarak, farklı lob bölgelerinde, loblarda ve bireysel SG'lerde boyama yoğunluğunda önemli farklılıklar gözlenmiştir.

Tahmin edildiği gibi, adaçayı ve CrebA boyama seviyeleri, fkh RNAi'yi (Şekil 2B) takiben tüm SG loblarında, karınca kontrol RNAi'sine kıyasla belirgin şekilde azalmıştır (Şekil 2A). Çizgi tarama profillerinde hem en yüksek maksimum yoğunluk değerlerinde (kırmızı kesikli çizgiler ve sayısal etiketler) hem de en düşük maksimum yoğunluk değerlerinde (mavi kesikli çizgiler ve sayısal etiketler) azalmalar, doku içindeki hem yüksek hem de düşük sinyal alanlarında azalmalar olduğunu göstermiştir (Şekil 2A, B). Bu veriler, An. gambiae fkh RNAi'nin etkili olduğunu ve fkh'nin, Drosophila SGs 19,38,39'daki genetik ilişkilerine benzer şekilde^, An. gambiae'deki SG TF'ler Sage ve CrebA'nın üretimini ve / veya stabilitesini düzenlediğini göstermektedir.

Çok bol tükürük bileşeni proteinleri göz önüne alındığında, kontrol RNAi tedavisine kıyasla, fkh RNAi'yi takip eden üç SG lobunda da Anofel anti-trombosit proteini (AAPP)^40,41 seviyeleri azalmıştır (Şekil 3A, B; yeşil). Öte yandan, Müsin düzeylerinde herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir (Şekil 3A,B; mor). Bu veriler, Fkh'nin farklı tükürük protein genlerinin ekspresyonuna farklı şekilde katkıda bulunduğunu göstermektedir.

Son olarak, iki salgı belirteci gözlenmiştir (Şekil 4A,B): Rab11 (apikal geri dönüşüm endozomları ile ilişkili veziküller)⁴² ve Nil Kırmızısı (lipitler). Fkh RNAi tedavisini takiben distal lateral (DL) loblarda azalmış Rab11 floresansı gözlendi (Şekil 4A v ve 4B v; yeşil). Bununla birlikte, medial (M) ve proksimal lateral (PL) loblarda artmış Rab11 sinyali de meydana gelmiştir (Şekil 4A vii, ix vs. 4B vii, ix; yeşil) meydana gelmiştir. Fkh RNAi sonrası Nil Kırmızısı sinyalinde (Şekil 4A,B; mor) kontrol RNAi tedavisine göre fark edilebilir bir fark gözlenmedi. Bu veriler, fkh indirgemesinin bazı salgı makineleri eylemlerini SG lobları arasında farklılık gösteren karmaşık bir şekilde değiştirebileceğini düşündürmektedir.

		Dataset:	Goltsev ·	Neira Oviedo	Neira Oviedo	Fırıncı	Fırıncı	Fırıncı	Fırıncı
gen sembolü	fonksiyon	AGAP Kimliği	embriyo (25 saat)	L3 larvaları	L3 SG	yetişkin kadın vücut (3 gün)	yetişkin erkek vücut (3 gün)	yetişkin kadın SG (3 gün)	yetişkin erkek SG (3 gün)
AAPP	tükürük proteini	AGAP009974	3.92	4.38	4.33	3.81	2.46	11.92	2.69
CrebA	txn faktörü	AGAP001464	6.28	5.22	5.92	2.99	2.96	3.27	3.13
"	txn faktörü	AGAP011038	4.50	4.46	5.23	2.96	2.86	3.05	2.88
dsx	txn faktörü	AGAP004050	4.91	5.39	5.55	3.72	4.00	4.57	4.01
fkh	txn faktörü	AGAP001671	5.18	4.67	5.25	2.99	3.09	3.21	3.05
MUC2	tükürük proteini	AGAP012020	4.59	5.53	5.63	2.96	3.07	3.08	3.26
Rab11	veziküler kaçakçılık	AGAP004559	10.21	7.47	8.60	4.90	3.79	3.38	2.96
akıllı	txn faktörü	AGAP013335	5.32	5.96	8.89	3.40	3.33	7.37	7.23

Tablo 1: An için ortalama log2 mikroarray ifade profilleri. gambiae ilgi çekici genler. Gösterilen gen adları, fonksiyonel kategori, Vectorbase (AGAP) tanımlayıcıları ve Vectorbase'den toplanan ortalama log2 mikroarray ekspresyon verileridir. Bu veriler, ilgilendiğimiz genlerin (tükürük bezi (SG) hücre biyolojisi ve sekresyonunda yer alan), larva evre 3 (L3) ve yetişkin SG'lerde, tüm bireylere kıyasla eksprese edildiğini ve zenginleştirildiğini göstermektedir.

Şekil 1: Yetişkin An. gambiae'de f-Agdsx ve fkh knockdown, SG'lerdeki fkh mRNA seviyelerini azaltır ve kadınların kan besleme yeteneğini etkiler. (A) Bu metodolojide dsRNA üretimi için kullanılan plazmid tasarımının temsili görüntüsü. İkinci T7 promotör dizisi, pGEMT plazmidine klonlanacak kesici ucu yükseltmek için kullanılan 3' astarına dahil edilerek plazmid'e eklenir. Plazmid daha sonra E. coli HT115 (DE3) bakterilerine dönüştürülür ve% 10 şekerli suda indüklenmiş ısıdan öldürülmüş bakterilerin süspansiyonundan bir besleme çözeltisi yapılır. (B) F-Agdsx veya fkh için bir dsRNA besleme çözeltisi ile beslenen hayvanlar, önemli ölçüde daha düşük fkh transkript seviyeleri gösterdi (çoklu karşılaştırmalı tek yönlü ANOVA; n = 15). Bununla birlikte, sadece fkh dsRNA (C) ile beslenen grup, bir kan unu elde etmek için gereken ısırma girişimlerinin sayısında önemli bir fark göstermiştir. Bu gruptaki sivrisinekler, ortalama olarak, kontrol veya dsx-dsRNA ile beslenen grupların ihtiyaç duyduğundan daha başarılı bir kan unu elde etmek için yapılan sondalama girişimlerinin sayısının beş katına ihtiyaç duyuyordu (çoklu karşılaştırmalı tek yönlü ANOVA; n = 15). Hata çubukları, Ortalama Standart Hata'yı (SEM) gösterir. Her deney üç ayrı biyolojik kopyada gerçekleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Erişkin An. gambiae tükürük bezlerinde fkh knockdown, SG transkripsiyon faktörü düzeylerini azaltır. Gösterilen 13. gün yetişkin dişi An. gambiae SG'lerden 8 gün (5-13 gün) sonra (A) ilişkili olmayan dsRNA kontrolüne (karınca) veya (B) SG TF çatal kafasını (fkh, AGAP001671) hedef alan dsRNA'ya oral maruziyetten sonra% 10 sakarozda DAPI (DNA; kırmızı), etiketli buğday tohumu agglutinin (WGA, kitin / O-GlcNAsilasyon; mavi), SG TFs Sage (yeşil) ve CrebA'ya (mor) karşı antiserum. Gösterilen ölçek çubuğu uzunlukları mikronlardır. SG'ler (i) beyaz çizgilerle özetlenmiştir. Yakınlaştırılmış lob görüntülerindeki sarı çizgiler (sarı kutularla çevrili ve "giriş" etiketli bölgelerin), sinyal yoğunluğunun hat taramalarının nerede yapıldığını gösterir. Her yakınlaştırılmış lob için çizgi taramalarına karşılık gelen yeşil ve mor kanal yoğunlukları, görüntülerin altındaki grafiklerde (SG'de her zaman soldan sağa) çizilir; X ekseni = mesafe (piksel cinsinden) ve Y ekseni = gri birim (piksel yoğunluğu). Piksel yoğunluğunun dinamik aralığı kırmızı (maksimum) ve mavi (minimum) noktalı çizgilerle sınırlandırılır ve karşılık gelen değerler her grafikte gösterilir. MIP = tüm SG derinliği boyunca maksimum yoğunluklu 3D projeksiyon. DL: distal lateral lob; M: medial lob; PL: proksimal lateral lob; SD: tükürük kanalı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Yetişkin An. gambiae tükürük bezlerinde fkh knockdown, SG salgılanan protein seviyelerini azaltır. Gösterilen 13. gün yetişkin dişi An. gambiae SG'lerden 8 gün (5-13 gün) sonra (A) ilişkili olmayan dsRNA kontrolüne (karınca) veya (B) SG TF çatal kafasını (fkh, AGAP001671) hedef alan dsRNA'ya oral maruziyetten sonra, DAPI (DNA; kırmızı) boyaları ile boyanmış% 10 sakkarozda, etiketli buğday tohumu agglutinin (WGA, kitin / O-GlcNAsilasyon; mavi), ve tükürük proteinleri AAPP (yeşil) ve Müsin (MUC2, mor). Gösterilen ölçek çubuğu uzunlukları mikronlardır. SG'ler (i) beyaz çizgilerle özetlenmiştir. Yakınlaştırılmış lob görüntülerindeki sarı çizgiler (sarı kutularla çevrili bölgelerin), sinyal yoğunluğunun hat taramalarının nerede yapıldığını gösterir. Her lob için çizgi taramalarına karşılık gelen yeşil ve mor kanal yoğunlukları, görüntülerin altındaki grafiklerde (SG'de her zaman soldan sağa) çizilir; X ekseni = mesafe (piksel cinsinden) ve Y ekseni = gri birim (piksel yoğunluğu). Piksel yoğunluğunun dinamik aralığı kırmızı (maksimum) ve mavi (minimum) kesikli çizgilerle sınırlandırılır ve karşılık gelen değerler her grafikte gösterilir. MIP = tüm SG derinliği boyunca maksimum yoğunluklu 3D projeksiyon. DL: distal lateral lob; M: medial lob; PL: proksimal lateral lob; SD: tükürük kanalı. İtalik "DL" etiketleri (Bi), aynı DL lobunun iki görünür bölgesini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Erişkin An. gambiae tükürük bezlerinde fkh knockdown, SG sekresyon belirteçlerini azaltır. Gösterilen temsili görüntüler 13. gün yetişkin dişi An. gambiae SG'lerden 8 gün (5-13 gün) oral maruziyetten sonra (A) ilişkili olmayan dsRNA kontrolüne (karınca) veya (B) SG TF çatal kafasını (fkh, AGAP001671) hedef alan dsRNA'ya% 10 sakkarozda DAPI (DNA; kırmızı), etiketli buğday tohumu agglutinin (WGA, kitin / O-GlcNAsilasyon; mavi) boyaları ile boyanmış, Nil Kırmızısı (lipitler; mor) ve geri dönüşüm endozom vezikül işaretleyicisi Rab11'e (yeşil) karşı antiserumlar. Gösterilen ölçek çubuğu uzunlukları mikronlardır. SG'ler (i) beyaz çizgilerle özetlenmiştir. Yakınlaştırılmış lob görüntülerindeki sarı çizgiler (sarı kutularla çevrili bölgelerin), sinyal yoğunluğunun hat taramalarının nerede yapıldığını gösterir. Her lob için çizgi taramalarına karşılık gelen yeşil ve mor kanal yoğunlukları, görüntülerin altındaki grafiklerde çizilir (SG'de her zaman soldan sağa); X ekseni = mesafe (piksel cinsinden) ve Y ekseni = gri birim (piksel yoğunluğu). Piksel yoğunluğunun dinamik aralığı kırmızı (maksimum) ve mavi (minimum) kesikli çizgilerle sınırlandırılır ve karşılık gelen değerler her grafikte gösterilir. MIP = tüm SG derinliği boyunca maksimum yoğunluklu 3D projeksiyon. DL: distal lateral lob; M: medial lob; PL: proksimal lateral lob; SD: tükürük kanalı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

DsRNA'yı An. gambiae sivrisineklerine oral besleme yoluyla etkili bir şekilde verme yeteneği, hem laboratuvarda hem de sahada vektör biyolojisi çalışmaları için geniş etkilere sahiptir. Mikroenjeksiyon uzun zamandır sivrisineklerde kimyasalların, antikorların, RNAi'nin ve genetik modifikasyon stratejilerinin tercih edilen dağıtım şekli olarak kabul edilmektedir^43,44. Önemli fiziksel manipülasyonun, hücresel hasarın ve stresin sonucu, büyük ölçekli veya saha uygulamaları için potansiyel olarak uygun olabilecek oral teslimatın kullanılmasıyla önlenebilir. Önceki çalışmalar, RNAi'nin bireysel bir yetişkin sivrisinek²⁹ içinde her yerde hareket ettiğini ve tükürük bezleri de dahil olmak üzere tüm dokularda etkilere izin verdiğini öne sürmüştür. Sivrisinekleri, uzun bir zaman dilimi boyunca asenkron olarak sindirilen çok sayıda dsRNA eksprese eden E. coli ile besleyerek, bir kafesteki tüm bireyler arasında RNAi'ye tutarlı ve düzgün bir şekilde maruz kalma potansiyeli elde edilebilir. Bu yöntem, çok sayıda sivrisinek beslemeye ve hedef gene bağlı olarak ortaya çıkan fenotiplerin potansiyel değişkenliğini analiz etmeye izin verir. Bununla birlikte, önemli bir husus, pamuk lifinde bakterilerin ve dolayısıyla dsRNA'nın heterojen dağılımı olasılığıdır. Sivrisinek şekeri beslemesi için günlük olarak kullanılan 400 μL bakteri, daha önce⁹ tarif edildiği ve hesaplandığı gibi yaklaşık ≤4.6 μg dsRNA içerecektir, ancak her bir sivrisinek tarafından yutulan dsRNA miktarı ayrı ayrı belirlenmemiştir. dsRNA yapılarının oluşturulması rutin hale gelirse, bu basit tedavi protokolü bu tekniğin herhangi bir sivrisinek araştırmacısı tarafından hızlı bir şekilde asimilasyonuna izin verir. A priori, tedavi sırasında harcanan zaman (günde 30 dakika), benzer numune boyutlarına mikroenjeksiyon öğrenmek ve uygulamak için geçen zamana kıyasla önemsizdir.

Beslenme dsRNA, model organizma Caenorhabditis elegans^45'te ters genetik çalışmalar için rutin olarak kullanılmaktadır. Bu yoğun kullanım seviyesi, oral dağıtım yaklaşımının değerini vurgulamaktadır. Dönüştürülmüş E. coli'de, C. elegans^46,47'de var olana benzer şekilde, An. gambiae genom çapında bir kütüphanenin oluşturulması^, sivrisineklerde artan bir ölçekte hızlı ters genetik taramaya izin verecektir. Bununla birlikte, yöntemin etkinliğinin büyük ölçüde transkriptin endojen seviyelerine ve ekspresyonun hedef doku ile sınırlı kalmayıp daha geniş bir şekilde ifade edilip edilmediğine bağlı olduğunu belirtmek önemlidir ^4,8,44. Ek olarak, bazı insektisitlerin sivrisineklerden davranışsal kaçınmaya neden olabileceğine dair kanıtlar vardır⁴⁸ ve içlerinde potansiyel olarak olumsuz etkilere neden olan bakterilerle beslenmek benzer kaçınma modellerini tetikleyebilir. Sivrisineklerin alternatif bir besin kaynağına sahip olmadığı laboratuvarın kontrollü ortamında, E. coli ile şekerli sudan kaçınma seçenekleri yoktu ve besleyici bir kaynağa duyulan ihtiyaç muhtemelen bakterilerden kaçınma içgüdüsünü geçersiz kılacaktı. Bununla birlikte, stratejinin daha az kontrollü ortamlarda kullanılması amaçlanıyorsa bu dikkate alınmalıdır.

Aynı anda birden fazla geni hedeflemek mümkün olabilir (bir yapı, birden fazla yapı veya dönüştürülmüş bakteriyel izolatların bir karışımını kullanarak), ancak etkinliği değerlendirmek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Bu noktada dikkat edilmesi gereken bir diğer önemli nokta, tek veya birden fazla hedef kullanıldığında olası hedef dışı veya sinerjik etkilerin değerlendirilmesidir. Uygun kontrol genlerinin ve gruplarının oluşturulması deney tasarımının önemli bir parçasıdır. Ayrıca, bu yaklaşımın diğer patojenleri veya virüsleri hedeflemek için kullanılabileceğini tahmin etmek caziptir⁴⁹. Sivrisineklerde RNAi indüksiyonuna yönelik önceki çalışmalar, reaktifin doğrudan enjekte edildiği koşullar altında gerçekleştirildi, bu nedenle E. coli mevcut değildi. E. coli , zaman içinde dsRNA'nın daha yavaş salınmasına izin veren koruyucu bir bölme sağlayabilir ve maruz kalmanın çok daha uzun bir süre boyunca az ya da çok sürekli olmasını sağlar²⁹.

Son olarak, bu sonuçlar, bu tekniğin etkilerinin, maruz kalmanın zaman dilimini (uzunluk ve başlangıç günü) ve kullanılan E. coli miktarını ayarlayarak ayarlanabilir olduğunu göstermektedir. Bu özellik, deneme yanılma yoluyla optimal nakavt koşullarını tanımlayarak temel genlerin (dsx ve fkh) işlevlerini incelememizi sağladı. Bu, ilgilenilen hedef genlerin bu teknik kullanılarak araştırılma olasılığını büyük ölçüde artırır.

Özetle, RNAi'nin yetişkin sivrisineklere oral yoldan verilmesinin basit, çok yönlü ve sivrisinek gen fonksiyonunu incelemek ve sivrisinek kaynaklı hastalıkların vektör kontrolü için yeni ve dövülebilir araçların oluşturulması için güçlü bir yaklaşım olabileceği bulunmuştur.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	10787018
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium	BD Difco	DF0440-17
AAPP	n/a	n/a	Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo
AccuStart II PCR Supermix	Quantabio	95137-100
Agarose	Millipore Sigma	A9539
Ampicillin	Millipore Sigma	A5354
Anopheles gambiae G3	BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4)	MRA-112
BugDorm	BioQuip	1452
Centrifuge 5810R	Eppendorf	P022628181
CrebA	DSHB	CrebA Rbt-PC	Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab
Damiens diet	BioServ
DAPI	Life Technologies	n/a	4′,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution.
Defibrinated sheep blood	HemoStat	DSB050
Escherichia coli HT115 (DE3)
Ethidium bromide	Millipore Sigma	E7637
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	4368814
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Millipore Sigma	I5502
JM109 Competent cells	Promega	L2005
Luria Broth Media	Thermo Fisher Scientific	10855001
Mucin 2	Proteintech	Muc2; 27 675-1-AP	Antisera. 1:100 dilution (mouse).
Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific
Nile Red	Sigma	n/a	Lipid dye; 1:50 dilution.
Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis	Thermo Fisher Scientific	Model B2
pGEMT easy	Promega	A3600
Power SYBR-green PCR master MIX	Applied Biosystems	4367659
PureLink PCR purification kit	Thermo Fisher Scientific	K31001
QuantaStudio 6	Applied Biosystems
QuantStudio6 Real Time PCR System	Applied Biosystems
Rab11	n/a	n/a	Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab
Rh-WGA	Vector Labs	n/a	Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution
Sage	n/a	n/a	Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab
T4 DNA ligase	Promega	M1801
Tetracycline	Millipore Sigma	87128
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596018
Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope	Zeiss
ANTIBODIES
Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A21472
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A28181
IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A27034
Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A27012
PRIMERS
ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC CGGA	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer