Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Özet

Protokol, kesilmiş sinirden fare motor sinir terminallerine floresan kalsiyum boyası yükleme yöntemini açıklar. Ek olarak, konfokal mikroskopi kullanarak periferik sinir uçlarındaki hızlı kalsiyum geçicilerini kaydetmek için benzersiz bir yöntem sunulmuştur.

Özet

Presinaptik kalsiyum seviyesinin tahmini, sinaptik iletimin incelenmesinde kilit bir görevdir, çünkü presinaptik hücreye kalsiyum girişi, nörotransmitter salınımına yol açan bir dizi olayı tetikler. Ayrıca, presinaptik kalsiyum seviyelerindeki değişiklikler birçok hücre içi proteinin aktivitesine aracılık eder ve sinaptik plastisitede önemli bir rol oynar. Kalsiyum sinyallemesini incelemek, nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmenin yollarını bulmak için de önemlidir. Nöromüsküler kavşak, sadece bir tür nörotransmittere sahip olduğu için sinaptik plastisiteyi incelemek için uygun bir modeldir. Bu makalede, kalsiyuma duyarlı bir boyanın kesilmiş sinir demeti boyunca farelerin motor sinir uçlarına yüklenme yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, bazal kalsiyum seviyesi ve kalsiyum geçici gibi hücre içi kalsiyum değişiklikleriyle ilgili tüm parametrelerin tahmin edilmesini sağlar. Kalsiyumun hücre dışından sinir terminallerine akışı ve kalsiyuma duyarlı boyaya bağlanması/çözülmesi birkaç milisaniye aralığında gerçekleştiğinden bu olayları kaydetmek için hızlı bir görüntüleme sistemi gereklidir. Gerçekten de, yüksek hızlı kameralar hızlı kalsiyum değişimlerinin kaydedilmesi için yaygın olarak kullanılır, ancak düşük görüntü çözünürlüğü parametrelerine sahiptirler. Burada kalsiyum geçici kaydı için sunulan protokol, konfokal mikroskopi tarafından sağlanan son derece iyi mekansal-zamansal çözünürlüğe izin verir.

Giriş

Uyarılabilir hücrelerde hızlı kalsiyum dalgalarını ölçme problemi, merkezi ve periferik sinir sistemlerinde sinyal iletimini incelemenin en önemli ve zorlu yönlerinden biridir. Kalsiyum iyonları, nörotransmitter salınımını, sinaptik plastisiteyi ve çeşitli hücre içi proteinlerin aktivitesinin modülasyonunu tetiklemede önemli bir rol oynar 1,2,3,4,5. Kalsiyum sinyallemesini incelemek, nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmenin yollarını bulmak için de önemlidir⁶. Kalsiyum seviyelerindeki değişiklikleri ölçmek için, floresan kalsiyuma duyarlı boyalar yaygın olarak kullanılır ve floresan seviyelerindeki değişiklikler analiz edilir ^7,8,9.

Kalsiyum boyalarının hücrelere yüklenmesi farklı şekillerde sağlanabilir. Ağırlıklı olarak, hücre perkastan boyalar^10,11 oranında kullanılır. Bununla birlikte, böyle bir durumda, sadece hücre içindeki bir boya konsantrasyonunu kontrol etmek zor değildir, aynı zamanda yükleme için hedef hücreleri seçmek de zordur. Bu yöntem, boya postsinaptik hücrelere girdiğinden periferik sinir uçlarını incelemek için geçerli değildir. Bunun yerine, hücre geçirimsiz boyalar bu tür preparatlar için daha uygundur. Bu durumda, boyalar hücrelere mikroenjeksiyonla veya bir yama pipeti ^12,13,14 yoluyla verilir. Bir sinir kütüğünden yükleme yöntemi de vardır. İkinci yöntem, nöromüsküler bileşke preparatları^{15,16,17,18,19,20} için en uygun yöntemdir. Sadece ilgilenilen hücreler için boyama yapılmasına izin verir. Bu yöntem, hedef hücredeki boya konsantrasyonunun doğru bir değerlendirmesini sağlamasa da, konsantrasyon, çözeltilerde duran hücrelerin floresan seviyesini, bilinen bir kalsiyum²¹ konsantrasyonu ile karşılaştırarak yaklaşık olarak tahmin edilebilir. Bu çalışmada, memelilerin sinapslarına uygulanan bu yöntemin bir modifikasyonu sunulmuştur.

Aksiyon potansiyelinin depolarize fazı sırasında kalsiyum girişi, özellikle nöromüsküler kavşakta hızlı bir süreçtir; bu nedenle, tescili için uygun ekipman gereklidir¹. Voltaja duyarlı bir floresan boya kullanan yeni bir çalışma, bir farenin periferik sinapsındaki aksiyon potansiyelinin süresinin yaklaşık 300 μs²² olduğunu göstermiştir. Kurbağanın periferik sinapslarında kalsiyuma duyarlı boyalar kullanılarak değerlendirilen kalsiyum geçici, daha uzun bir süreye sahiptir^{: yükselme süresi} yaklaşık 2-6 ms ve çürüme süresi, kullanılan kalsiyum boyasına bağlı olarak yaklaşık 30-90 ^ms'dir. Floresan boyaların yardımıyla hızlı süreçleri ölçmek için, genellikle hızlı ve hassas CCD matrislerine sahip CCD veya CMOS kameralar kullanılır. Bununla birlikte, bu kameralar,^{matris 25,26,27,28'in} hassas elemanlarının boyutuyla sınırlı olan düşük çözünürlük dezavantajına sahiptir. Hücrelerin düşük frekanslı uyarılmasına yanıt olarak hem aksiyon potansiyellerini hem de kalsiyum geçicilerini kaydetmek için yeterli hassasiyete sahip en hızlı kameralar, 2.000 Hz'lik bir tarama frekansına ve 80 x 80²⁹ boyutunda bir matrise sahiptir. Daha yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip sinyaller elde etmek için, özellikle^30,31,32 sinyalindeki bazı hacimsel değişiklikleri değerlendirmek gerekirse^, konfokal mikroskopi kullanılır. Ancak, konfokal mikroskobun çizgi tarama modunda yüksek bir tarama hızına sahip olduğu akılda tutulmalıdır, ancak uzamsal bir görüntü oluştururken hızlı işlemlerin kayıt hızında hala önemli sınırlamalar vardır³³. Daha yüksek tarama hızına sahip dönen Nipkow disklerine (yarık tarama mikroskobu) ve Çok Noktalı Dizi Tarayıcılara dayanan konfokal mikroskoplar vardır. Aynı zamanda, konfokal görüntü filtrelemede klasik konfokal mikroskoplardan daha düşüktürler (Nipkow diskli mikroskoplar için iğne delikleri çapraz konuşma)^32,34,35. Rezonans taramalı konfokal görüntüleme aynı zamanda yüksek zamansal ölçümler için gereken yüksek uzaysal-zamansal çözünürlük sağlayabilir³⁶. Bununla birlikte, rezonans tarayıcıları kullanırken zayıf floresan tepkilerinin yüksek bir tarama hızında kaydedilmesinin, hibrit dedektörler gibi son derece hassas dedektörler gerektirdiğini dikkate alın³⁶.

Bu makalede, uzamsal çözünürlük^37'yi korurken Lazer Tarama Konfokal Mikroskopisi (LSCM) ile kaydedilen sinyallerin zamansal çözünürlüğünü artırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Mevcut yöntem, daha önce açıklanan ve LSCM platformu ^38,39,40'a aktarılan yöntemlerin daha da geliştirilmesidir. Bu yaklaşım, mikroskop donanımında değişiklik gerektirmez ve periyodik olarak uyarılan floresan sinyalleri, stimülasyon anına göre bir zaman kayması ile kaydetmek için bir algoritmanın uygulanmasına dayanır.

Protokol

Fareler BALB/C'den (20-23 g, 2-3 aylık) levator auris longus'un (m. LAL) izole sinir-kas preparatları üzerinde deneyler ^yapıldı41. Deneysel prosedürler, Kazan Federal Üniversitesi ve Kazan Tıp Üniversitesi'nin laboratuvar hayvanlarının kullanımına ilişkin kılavuzlara uygun olarak, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Deneysel protokol, 86/609/EEC sayılı Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi'nin gerekliliklerini karşıladı ve Kazan Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylandı.

1. Zil ve Dosyalama çözümlerinin hazırlanması

1. Aşağıdaki bileşenleri karıştırarak memeli kası için Ringer çözeltisini hazırlayın: NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl 2 (₂ mM), MgCl 2 (1 mM), NaH₂ PO₄ (1 mM), NaHCO₃ (11.9 mM) ve glikoz (11 mM). Çözeltiden %95_O2 ve %5 CO₂ ile kabarcık geçirin ve gerekirse HCl/NaOH ekleyerek pH'ını 7.2-7.4'e ayarlayın.
2. Boya yükleme çözeltisini hazırlayın.
   1. 7.2-7.4 aralığında pH'lı HEPES (10 mM) çözeltisi hazırlayın. 500 μg ticari boya, 500 μL'lik bir şişede gelir. 30 mM'lik bir boya konsantrasyonu elde etmek için boyayı HEPES çözeltisinin 14 μL'sinde çözün. İyice çalkalayın ve tamamen çözünene kadar santrifüj yapın.
   2. Ca²⁺ göstergesinin çözeltisini HEPES çözeltisi ile 1 mM konsantrasyona kadar seyreltin. Bir dondurucuda (-20 ° C) saklayın ve ışığa maruz kalmaktan kaçının.

2. Boya yükleme prosedürü

NOT: Boya yükleme prosedürü, daha önce yayınlanan 19,42,43,44,45,46 protokollerinden uyarlanmış sinir kütüğünden yükleme protokolüne göre gerçekleştirilir.

1. LAL kasını daha önce yayınlanmış protokoller^47,48'de açıklandığı gibi bu preparat için diseksiyon prosedürüne göre diseke ^edin.
   1. Elastomer kaplı Petri kabında hafifçe gerilmiş dokuyu (başlangıç uzunluğundan en fazla% 30) ince paslanmaz çelik pimlerle sabitleyin ve kas tamamen kaplanana kadar Ringer çözeltisini ekleyin.
      NOT: Petri kabı, üreticinin talimatlarına göre elastomer ile önceden doldurulmuştur (bkz.
2. Dolum Pipetini Hazırlama
   1. Bir mikropipet çektirici kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu), hücre içi kayıtlar için mümkün olduğunca keskin olan ince uçlu bir mikropipet hazırlayın. İç filamentsiz kılcal damarlar kullanın (dış çapta 1,5 mm ve iç çapta 0,86 veya 1,10 mm).
   2. Konikliği aşındırıcı ile puanladıktan sonra mikropipet ucunu kırın ve ucu yaklaşık 100 μm çapında açık bırakın. İç çap >80 μm'den 12-13 μm'ye düştüğünde sınırlamak için ucu ateşle cilalayın. Dolum Pipetinin bir tarafına silikon bir tüp ve diğer tarafına bir şırınga (iğnesiz) takın.
3. Bir stereomikroskop altında, sinir gövdesinin ayrı sinir dallarına dönüştüğü yeri bulun. Dolgu Pipetini monte edilmiş tüp ve şırınga ile balmumu kullanarak Petri kabının üzerine yerleştirin. Pipet ucunu sinirin üzerinde durana kadar hareket ettirin.
4. İnce makasla siniri kas lifine yakın bir şekilde kesin ve sinir kütüğünün yaklaşık 1 mm uzunluğunda küçük bir parçasını bırakın. Sinir kütüğünü, bazı Ringer çözeltisiyle birlikte, sıkıştırmadan, Doldurma Pipetinin ucuna nazikçe aspire edin. Silikon tüpü Dolum Pipetinden çıkarın.
5. Uzun filamentli bir şırınga kullanarak boya yükleme çözeltisinin bir miktarını (~ 0.3 μL) çekin. Bu hacim filamentin yaklaşık 3 cm'sine karşılık gelir.
   NOT: Başlangıçta, bir alkol lambası veya bir gaz brülörü kullanarak ateşi çekerek 10 μL hacimli bir pipet ucundan bir filament yapmak gerekir.
6. Filament ucunu yükleme solüsyonu ile birlikte yavaşça Dolum Pipetine yerleştirin. Karışımı doğrudan sinir kütüğüne bırakın. Hazırlığı oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.
7. Bundan sonra, preparatı taze Ringer çözeltisi ile durulayın ve 50 mL (veya daha fazla) Ringer çözeltisi olan bir cam beherde 2 saate kadar 25 ° C'de inkübe edin (preparat çözelti ile kaplanmalıdır). Bu süre zarfında, boya sinapslara ulaşacaktır.

3. Konfokal mikroskopi ile video yakalama

NOT: Kalsiyum geçicilerinin kaydı, lazer taramalı konfokal mikroskop (LSCM) ile gerçekleştirilir (bkz. Hızlı kalsiyum geçicilerini kaydetmek için, sinyallerin yeterli uzamsal ve zamansal çözünürlükte kaydedilmesine izin veren orijinal bir protokol kullanılmıştır. Yöntem, Arkhipov ve ark.³⁷ tarafından yayınlanan yayında ayrıntılı olarak tanımlanmıştır. Mikroskop, 20x su daldırma hedefi (1.00 NA) ile donatılmıştır. 488 nm lazer hattı% 10 yoğunluğa düşürüldü ve emisyon floresansı 503 ila 558 nm arasında toplandı.

1. Preparatı silikon elastomer kaplı deney odasına monte edin ve hafifçe gerilmiş bir dizi çelik mikro iğne ile sabitleyin. Hazırlığı Ringer çözeltisi ile iyice durulayın.
   NOT: Organik camdan yapılmış, odanın tabanı elastomer ile kaplı basit bir ısmarlama perfüzyon deney odası kullanılmıştır (üreticinin talimatlarına uygun olarak hazırlanmıştır; bakınız Malzeme Tablosu). Odanın bir çözelti besleme tüpü vardır. Çözelti, manyetik bir tutucuya monte edilmiş bir şırınga iğnesi aracılığıyla dışarı pompalanır (bkz. Bir deney odası olarak, bir Petri kabı (preparatın inkübasyonu için kullanılanlar gibi) kullanılabilir, ancak bağlı besleme ve emme tüpleri ile.
2. Siniri uyarmak için kullanılacak emme elektrodunu takın.
   NOT: Elektrotun yapısı, Kazakov ve ark.⁴⁹ tarafından 2015 yılında yayınlanan makaleye benzer. Elektrodu banyonun yanına ağda yaparak yerleştirin ve sabitleyin. Ucu sinir kütüğüne yaklaştırın ve elektroda aspire edin.
3. Hazırlama odasını mikroskop aşamasına monte edin ve giriş ve çıkış bağlantı parçalarını odaya yerleştirin.
4. Hazırlığı incelemek için, basit bir yerçekimi akışı tahrikli sistem kullanın. Fazla çözeltiyi çıkarmak için perfüzyon emme pompasını açın.
5. Uyarıcı emme elektrodunu bir elektrik stimülatörüne takın ve uyaranlardan sonra kas kasılmalarının meydana geldiğinden emin olun. Stimülasyon koşulları ve kayıt için bölüm 3.9-3.12'ye bakınız.
6. Perfüzyon sistemini Ringer'ın d-tubokurarin (10 μM) çözeltisi ile doldurun.
   NOT: Bu çözüm kas kasılmalarını önlemeye yardımcı olur. Postsinaptik membran üzerindeki nikotinik asetilkolin reseptörlerinin D-tubokurarin veya alfa-bungarotoksine özgü blokerleri, kas kasılmalarını tamamen veya kısmen bloke edecektir⁵⁰. Ayrıca, kas kasılmalarını önlemek için, μ-konotoksin GIIIB gibi postsinaptik sodyum kanallarının spesifik blokerleri kullanılabilir⁵¹.
7. Perfüzyon emme pompasını açın ve preparatın perfüzyonunu d-tubokurarin içeren Ringer çözeltisi ile başlatın.
8. LSCM yazılımında görüntüleme parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın.
   1. LSCM yazılımında (LAS AF; bakınız Malzeme Tablosu), Elektrofizyoloji'yi seçin.
      NOT: Bu modda, zaman noktasında bir görüntü yakalandığında, tetikleyici kutu yardımıyla uyarıcıya senkronize edici bir darbe gönderilir. Bu, preparatta aksiyon potansiyeli üretimini ortaya çıkarır (Şekil 1; uyarıcı ünite).
   2. Edinme Modu'nu seçin. Mikroskop senkronizasyon darbesini kullanarak uyarıcıyı tetiklemek için, İş menü ayarlarında Tetikleyici ayarları'nı seçin. Çerçevede Tetikleyici Çıkışı alanını out1 kanalına ayarlayın.
   3. Şu ayarları kullanın: Tarama Modu: XYT, Tarama Frekansı: 1400 Hz, Yakınlaştırma Faktörü: 6.1, İğne Deliği: tamamen açık. Sıralı geçiş yapan Çift Yönlü X modunun açık olduğundan emin olun.
   4. 52 ms'de bir kare oluşturmak için minimum süreyi ve 20 karede ham bir videoda toplanacak kareleri ayarlayın.
      NOT: Bu ayarlar, her 52 ms'de bir tek bir kare çekerken 128 x 128 piksel çözünürlükte görüntü yakalamaya izin verir.
   5. Argon lazerin uyarma dalga boyunu çıkış gücünün% 8'i ile 488 nm'de ayarlayın.

Şekil 1: Deney düzeneğinin şeması. 1. Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop (LSCM). 2. LSCM'nin senkronizasyon modülü (tetik kutusu). 3. Stimülatör. 4. İzolasyon ünitesi. 5. Biyolojik örnek. 6. Sinirin elektriksel uyarımı için emme elektrodu. 7. Perfüzyon sistemleri (7a: perfüzyon rezervuarı, 7b: damlalık, 7c: akış regülatörü, 7d: vakum şişesi). Oklar, senkronize darbenin yayılma yönüne işaret eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Canlı moda geçmek için Canlı Mod düğmesine basın, bu da boya ile yüklenen sinir terminallerinin önizlemesini almanıza yardımcı olur.

Şekil 2: Ca²⁺ göstergesi yüklü fare siniri ve terminalleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

9. Stimülasyon ünitesi
   NOT: Bu çalışmada, Land ve ^ark.52 tarafından makalede açıklanan uyarıcı kullanılmıştır. Bu cihaz, MatLab yazılımı aracılığıyla stimülasyonun zamansal parametrelerinin ayarlanmasına izin verir.
   1. Yeni bir dosya oluşturun, yukarıda belirtilen makaledeki kodu MatLab kod penceresine yapıştırın ve dosyayı kaydedin. Çalıştır'a tıklayın, böylece stimülasyon parametrelerini içeren bir pencere belirir. Uyaranın gecikme süresini ve süresini ayarlayın.
      NOT: Gecikme, yeniden yapılandırılmış floresan sinyalinin zamansal çözünürlüğünü belirler. 0,2 ms süreli elektrik darbesi geciktirilir ve daha sonra izolasyon ünitesine gönderilir. İkincisi, uyarıcı darbenin genliğini ve polaritesini oluşturur ve biyolojik nesneyi kayıt cihazından elektriksel olarak izole eder.
   2. Siniri uyarmak için, uyarıcı impulsun supramaksimal genliğini seçin (tüm sinir liflerini aktive etmek için gereken maksimum stimülasyon yoğunluğundan% 25 -% 50 daha fazla).
      NOT: Sunulan yöntem, LSCM kullanılarak tek bir hızlı floresan sinyalinin en aza indirilmiş süpürme ile kaydedilmesi için özel bir algoritmaya dayanmaktadır. Geliştirilen algoritmanın her adımında, kaydedilen floresan sinyali, mikroskop taramasından daha kısa bir zaman aralığı ile bir öncekinden kaydırılır. Zaman kaymalarının değeri, gerekli sinyalin zamansal çözünürlüğünü belirler. Algoritmadaki adımların (kaymaların) sayısı, gerekli zamansal çözünürlüğe ve orijinal zamansal çözünürlüğe bağlıdır. Bu kayıt yöntemiyle, preparatın uyarılması 0.25 Hz sıklıkta gerçekleştirilir.
10. Canlı modda, YG'yi arayın ve en iyi odağı elde edin. Veri toplama yazılımını çalıştırın.
11. Stimülatördeki gecikmeyi önceki değere göre 2 ms daha az kaydırın ve veri toplama yazılımını çalıştırın.
12. 26 dizi elde etmek için 3,11 adımını 26 kez tekrarlayın, her dizi bir öncekinden 2 ms kaydırılır.

4. Video işleme

NOT: Konfokal mikroskop tarafından elde edilen bir dizi video görüntüsü, LAS X özgür yazılımı ile TIFF formatında dışa aktarılır (bkz. Bu seri çerçevelere bölündü ve bir klasöre dışa aktarıldı. Görüntü dizisini daha yüksek zaman çözünürlüğü ile oluşturmak için, verilerin analizi ve işlenmesi için açık bir başlangıç koduna sahip olan ImageJ yazılımı kullanılmıştır. Sinyal işleme algoritması Şekil 3'te şematik olarak gösterilmiştir.

Şekil 3: Düşük zamansal çözünürlüğe (kare üzerinde 52 ms) sahip orijinal video dosyalarından yüksek çözünürlüklü bir video dosyası (kare üzerinde 2 ms) derleme şeması. Orijinal video dosyaları ve ilgili sinyaller siyah, macenta ve yeşil renktedir. Derlenen video dosyası ve ortaya çıkan sinyal kırmızı renktedir. Sağdaki şema, satır satır, konfokal mikroskopla elde edilen video görüntülerini gösterir. Solda, karşılık gelen floresan sinyalleri seçilen ROI'den değişir. En üst çizgi, şemaya göre alınan çerçevelerden kare kare oluşturulur. Sonuç, tüm kare dizisinden oluşan bir video görüntüsüdür, böylece kareler arasında 52 ms yerine 2 ms'lik bir gecikme süresi vardır. Her satır, stimülasyon sinyalinin (n - 1) * t ile bir ofsetine karşılık gelir, burada t, zaman kayması (2 ms) ve n, kayma yinelemelerinin sayısıdır. k, orijinal video dosyalarındaki kare sayısını (satır 2-4) gösterir ve kaydedilen sinyalin süresine bağlıdır. Bu durumda, 1 s süreli bir sinyal kaydetmek için, k = 20 (52 ms * 20 = 1040 ms) seçmek gerekir. t₀ , stimülasyondan önce gerekli gecikmedir. n kaydırma yinelemelerinin sayısını hesaplamak için, kareler arasındaki ilk zamansal çözünürlük (52 ms) gerekli zamansal çözünürlüğe (2 ms) bölünmelidir. Bu durumda, n = 26, bu da 26 kayıtlı süpürmeye karşılık gelir. Yapılan manipülasyonlar sonucunda n*k=520 karelik bir video görüntüsü elde edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. LAS X yazılımını çalıştırın. Deneme gerçekleştirilirken oluşturulan projeyi açın. Çerçeveleri hedef klasöre .tiff biçimde kaydetmek için Dışa Aktar'a ve ardından Farklı Kaydet'e tıklayın.
2. ImageJ yazılımını çalıştırın. Görüntü dizisini içe > Dosya > tıklayın.
3. Görüntü Dizisini Aç penceresinde, hedef klasörü seçin ve ilk kareyi açın.
4. Sıra Seçenekleri penceresinde, Başlangıç Görüntüsü alanında, ilk kare için kare numarasını 1 olarak ayarlayın. Artış alanında, değeri ilk sinyal kaydındaki kare sayısına eşit olarak ayarlayın (mevcut durum için 20) ve Tamam'a tıklayın.
5. Dikişli ilk karelerin oluşturulan dosyasını ayrı bir klasöre kaydetmek için, Dosya > > Klasöre Kaydet'e tıklayın.
6. Sonraki 19 kare için 4.3-4.5 arasındaki adımları yineleyin. Sıra Seçenekleri penceresinde, Başlangıç Görüntüsü alanında ilgili kare numarasını ayarlayın.
7. Tam yüksek çözünürlüklü video oluşturmak için tüm kareleri bir araya getirin. Bunu yapmak için, Dosya > > Görüntü Dizisini İçe Aktar'a tıklayın ve Başlangıç Görüntüsü ve Artış alanlarında 1'i seçin. Sonuç, artırılmış zamansal çözünürlüğe sahip son video olacaktır. Dosyayı .tiff veya başka bir uygun biçimde kaydedin.

5. Video analizi

NOT: ImageJ'de YG ve arka plan seçeneğini belirleyin. YG'den arka planı çıkarın. Veriler, (ΔF / F 0 - 1) *% 100 oranında temsil edilir; burada F₀, istirahatteki floresanın yoğunluğudur ve ΔF, stimülasyon sırasında floresanın yoğunluğudur.

1. Yığın Sıralayıcı'> Resim > Yığınları > Araçları'na tıklayın. Ardından, Yatırım Getirisi Yöneticisi'> Analiz > Araçları'na tıklayın.
2. Adım 4.7'de kaydedilen .tiff dosyasını sürükleyip ImageJ penceresine bırakın. Daha iyi bir görünüm için görüntüyü genişletin. Görüntü görselleştirmeyi geliştirmek için, Görüntü'ye tıklayın > Otomatik > > Parlaklığını / Kontrastını Ayarlayın. Bu adım verileri etkilemez.
3. Yatırım getirisi çizerek arka planı sinir terminaline yakın bir yere ayarlayın. Yatırım getirisi yöneticisine ekleyin. Daha > Çoklu Hesaplama'ya tıklayarak arka planı hesaplayın. Ortalama değerleri kopyalayın, E-tablo programına yapıştırın ve ortalamayı hesaplayın.
4. Hesaplanan ortalama değeri, Ana > İşlem'> Çıkar'a tıklayarak yığınlardan çıkarın. Değeri girin.
5. Bir çokgen çizgisi aracılığıyla bir sinir terminalinin etrafına yatırım getirisi çizin. Yatırım getirisi yöneticisine ekleyin.
6. Sinir terminalinin yoğunluğunu ölçün: Daha Fazla > Çoklu Ölçüm'e tıklayın. Ortalama değerleri kopyalayın ve E-tablo programına yapıştırın.
7. Sinyallerin ortalama ofsetini hesaplayın.
   NOT: Stimülasyondan önceki gecikme süresine bağlı olarak ilgili noktaları kullanın. Bu adım, sonraki hesaplamalarda kullanılacak F₀ değerini belirler.
8. Sinyal değerlerini ortalama ofset değerine bölün.
   NOT: Bu adımdan sonra sinyal, arka planın ve ham floresanın seçilen ROI için genlik değerlerine katkısını içermez.
9. Adım 5.8'de elde edilen değerlerden 1'i çıkarın ve ardından %100 ile çarpın.
10. Ca²+- geçici bir grafik çizin ve genliği hesaplayın.

Sonuçlar

Preparatı sunulan tekniğe göre boya ile yükledikten sonra, sinir kütüğüne yakın bulunan sinapsların çoğu yeterli bir floresan seviyesine sahipti (bkz. Şekil 2). Boya ile hazırlama yüklendikten ve tarif edilen kayıt ve görüntü işleme yöntemi uygulandıktan sonra, istenen mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip kalsiyum geçicileri elde edildi (bkz. Şekil 4). Kalsiyum geçicisi önerilen yöntemle geri kazanılmıştır (bkz.

Tartışmalar

Bu makalede^{, Ca 2 +} 'ya duyarlı boyanın sinir kütüğü yoluyla fare sinir uçlarına yüklenmesi ve konfokal mikroskop kullanılarak hızlı bir kalsiyum geçicisinin kaydedilmesi yöntemi sunulmuştur. Bu yükleme yönteminin uygulanmasının bir sonucu olarak, sinir kütüğüne yakın bulunan sinapsların çoğu, motor sinirin düşük frekanslı uyarımına yanıt olarak kalsiyumun sinir uçlarına girişinin kaydedilmesini sağlamak için yeterli bir floresan seviyesine sahipti.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary Glass	Clark Electromedical instruments, UK	GC150-10
Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP	Leica Microsystems , Heidelberg, Germany
Flaming/Brown Micropipette Puller P 97	Sutter Instrument, USA	P-97
Flow regulator	KD Medical GmbH Hospital Products, Germany	KD REG	Disposable infusion set with Flow regulator
HEPES	Sigma-Aldrich, USA	H0887	100mL
Illumination system Leica CLS 150X	Leica Microsystems, Germany
ImageJ	National Institutes of Health, USA		http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Las AF software	Leica Microsystems, Heidelberg, Germany
Las X software	Leica Microsystems, Heidelberg, Germany		https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Magnetic Holder with Suction Tubing	BIOSCIENCE TOOLS, USA	MTH-S
Microspin FV 2400	Biosan, Latvia	BS-010201-AAA
Minutien Pins	Fine science tools, Canada	26002-20
Multi-spin MSC 3000	Biosan, Latvia	BS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt	Molecular Probes, USA	O6806	500 μg
Pipette	Biohit, Russia	720210	0.5-10 µL
Pipette tip	Biohit, Russia	781349	10 µL
Plasticine	local producer
Single-use hypodermic needles	Bbraun	100 Sterican	0.4×40 mm
Spreadsheet program	Microsoft, USA	Microsoft Office Excel
Stereomicroscope, Leica M80	Leica Microsystems , Germany
Suction electrode	Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16.		http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 elastomer	Dow Corning, USA
Syringe	local producer		0.5 mL
Syringe	local producer		60 mL