Bitki Parazitik Nematodu Ditylenchus dipsaci Kültürleme ve Eleme

Özet

Mevcut protokol, Ditylenchus dipsaci'nin kültürlenmesi, toplanması ve taranması için güvenilir ve basit bir yöntem tanımlamaktadır.

Özet

Bitki-paraziter nematodlar (PPN'ler) her yıl küresel gıda mahsullerinin% 12'sinden fazlasını yok eder ve bu da yılda yaklaşık 157 milyar dolar (USD) kayba eşittir. Büyüyen küresel nüfus ve sınırlı ekilebilir arazi ile, PPN istilasını kontrol etmek gıda üretimi için kritik öneme sahiptir. Mahsul verimini en üst düzeye çıkarmanın zorluğunu birleştirmek, nematod seçiciliğinin eksikliği nedeniyle etkili pestisitler üzerindeki artan kısıtlamalardır. Bu nedenle, yeni ve güvenli kimyasal nematisitler geliştirmek, gıda güvenliği için hayati öneme sahiptir. Bu protokolde, PPN türü Ditylenchus dipsaci kültürü ve koleksiyonu gösterilmiştir. D. dipsaci hem ekonomik olarak zarar verici hem de çoğu modern nematisite karşı nispeten dirençlidir. Mevcut çalışma ayrıca, bu nematodların yeni küçük moleküllü nematisitler için ekranlarda nasıl kullanılacağını ve veri toplama ve analiz metodolojileri hakkındaki raporları da açıklamaktadır. Gösterilen boru hattı, haftada binlerce bileşik verimi sağlar ve Pratylenchus penetrans gibi diğer PPN türleriyle kullanım için kolayca uyarlanabilir. Burada açıklanan teknikler, giderek daha aç bir dünyayı beslemeye yardımcı olmak için PPN'lerle güvenli bir şekilde mücadele eden oldukça seçici ticari ürünlere dönüşebilecek yeni nematisitleri keşfetmek için kullanılabilir.

Giriş

Bitki-parazitik nematodların (PPN'ler) küresel gıda üretiminin% 12,3'ünün kaybından sorumlu olduğu ve yılda tahmini 157 milyar dolar hasara neden olduğu tahmin edilmektedir ^1,2,3. Ne yazık ki, PPN'leri kontrol etme yeteneği azalmaktadır, çünkü etkili kimyasal nematisitler yasaklanmıştır veya insan güvenliği ve çevresel kaygılar nedeniyle artan kısıtlamalarla karşı karşıya kalmaktadır. Bu öncelikle önceki nesil pestisitlerin zayıf nematod seçiciliğinden kaynaklanmaktadır⁴. Son 25 yılda, altı yeni kimyasal nematisit pilot olarak uygulandı veya piyasaya sürüldü⁵. Bunlardan biri Avrupa'da zaten yasaklandı ve bir diğeri insan sağlığı ^6,7 üzerindeki etkisi nedeniyle soruşturulurken durduruldu. Bu nedenle, PPN'ler için oldukça seçici olan yeni nematisitlere acil bir ihtiyaç vardır.

Kök ve ampul nematod, Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) ekonomik olarak etkili bir PPN⁴. D. dipsaci, 30 biyolojik ırkta yaklaşık 500 bitki türünü enfekte eder ve çavdar, yulaf, sarımsak, soğan ve pırasa gibi tarımsal açıdan en önemli mahsullerden bazılarını hedefler ^8,9. Örneğin, D. dipsaci son zamanlarda Ontario ve Quebec'teki sarımsak tarlalarını temizledi ve bu da% 90'a varan kayıplara neden ^oldu10,11. Coğrafi dağılımı neredeyse her yerdedir ve Amerika (Kaliforniya ve Florida dahil), Avrupa, Asya'nın çoğu (Çin dahil) ve Okyanusya^9'u içerir. D. dipsaci, stomalara yapraklar veya yaralar ve lentiseller üzerinde giren ve hücre duvarını parçalamak için enzimleri serbest bıraktıkları göçmen bir endoparazittir¹². D. dipsaci'nin mahsuller üzerindeki etkisini birleştirerek, PPN'nin neden olduğu hasar, bitkiyi ikincil enfeksiyona duyarlı hale getirir¹¹. Ne yazık ki, D. dipsaci diğer nematod suşlarına kıyasla mevcut nematisitlere karşı yüksek tolerans seviyeleri göstermektedir^13,14.

Bu protokol, D. dipsaci'nin kültürlenmesini ve küçük molekül adayı nematisitler için büyük ölçekli ekranlarda kullanımını açıklar. Kısaca, D. dipsaci popülasyonları, steril Gamborg B-5 (GA) ortamında kültürlenen bezelye bitkilerinde korunur ve genişletilir¹⁵. GA ortamında tohum filizleri yetiştirmeden önce, tohumlar bir dizi yıkamadan geçirilerek sterilize edilmeli ve kontaminasyonu kontrol etmek için besin agar (NA) üzerine kaplanmalıdır. Tohum sterilizasyonu, mevcut olabilecek bakteriyel ve fungal kirleticileri tespit etmek için gereklidir. Kirlenmemiş tohumlar daha sonra tohum filizlerinin enfeksiyona hazırlık olarak büyüyeceği GA plakalarına aktarılır. Tohum filizleri içeren GA plakaları, kök dokusu içeren bir parça agar parçasının taze plakalara aktarılmasıyla önceki bir kültür plakasından nematodlarla enfekte edilir. 6-8 hafta sonra, nematodlar GA ortamından çıkarılır ve kahve filtresiyle kaplı bir huniden bir toplama kabına süzülür. Nematodlar, uygun bir sayı toplandıktan sonra çeşitli biyotahlillerde kullanılabilir. Bu protokolde açıklanan teknik, kültür plakası başına yaklaşık 15.000 D. dipsaci üretir. D. dipsaci yetiştirmek için alternatif protokoller yayınlanmıştır^16,17.

Önceki çalışma^18'e dayanan bir in vitro küçük molekül tarama testi de burada açıklanmaktadır. Solucan sağlığının bir vekili olarak, kuyu başına 20 nematodun hareketliliği, 5 günlük küçük molekül maruziyetinden sonra incelenir. Solucan hareketliliğini daha iyi görselleştirmek için, canlı solucanların hareketini artırmak için NaOH eklenmiştir^19,20. Bu protokol, orta verimli taramaya izin verir ve küçük moleküllerin nematisidal potansiyelini değerlendirmek için değerli veriler sağlar. Farklı bir nematod toplama tekniği kullanılırsa^16,17, burada açıklanan küçük molekül tarama metodolojisi yine de uygulanabilir.

Protokol

Bu çalışma için kullanılan D. dipsaci suşu G-137, Prens Edward County'deki Fish Lake 4 Variety sarımsaktan toplandı ve Tarım ve Tarım-Gıda Kanada tarafından sağlandı. Yeni bir kültüre başlıyorsanız, aşılama metodolojisi¹⁵ için Poirier ve ark.'ya danışın.

1. D. dipsaci'nin kültürlenmesi

1. Daha önce bildirilen çalışmaları takiben medya ve plakaları hazırlayın¹⁵.
   1. 23 g/L NA (bakınız Malzeme Tablosu) ve ultra saf su ile 500 mL Besin agar (NA) ortamı hazırlayın. Steril tekniği kullanarak, 25 mL otoklavlanmış NA ortamını 20 tek kullanımlık Petri kabına (100 mm çap x 15 mm derinlikte) dökün. Agar'ın oda sıcaklığında (22 ° C) ~ 2 saat boyunca kapak açıkken katılaşmasına izin verin ve daha sonra kullanmak üzere bir kenara koyun.
   2. Minimum organik, 20 g/L sakaroz, 15 g/L agar ve damıtılmış su içeren 3,2 g/L GA bazal ortam içeren 500 mL Gamborg B-5 (GA) ortamı hazırlayın (bkz. Steril tekniği kullanarak, 10 tek kullanımlık Petri kabına (100 mm çap x 25 mm derinlikte) 50 mL otoklavlanmış GA ortamı dökün. Agar'ın oda sıcaklığında (22 °C) kapağı ~ 5 saat açıkken katılaşmasına izin verin ve filiz transferi yapılana kadar steril bir torbada oda sıcaklığında dik olarak saklayın.
      NOT: Fazla ortam plakaları, kontaminasyonun meydana gelmesi durumunda yapılır.
2. Önceki bir çalışmadan modifiye edilmiş bir yöntemi izleyerek tohum sterilizasyonu gerçekleştirin¹⁵.
   1. Bir karıştırma çubuğu, 2 forseps, bir cam petri kabı ve 1 L damıtılmış su ile bir adet 2 L beheri otoklav yapın. 200 mL'lik %95 EtOH çözeltisi ve 200 mL'lik %15'lik ticari ağartıcı çözeltisi hazırlayın.
   2. Bezelye tohumu kullanın (bakınız Malzeme Tablosu). Bir laboratuvar tezgahında bir Bunsen brülör alevinin yakınında bir karıştırma çubuğu bulunan steril bir 2 L beherine 150 tohum dökün.
   3. Beher içindeki tohumlara 200 mL% 95 EtOH ekleyin, karıştırma plakasında 5 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın ve ardından EtOH'yi bir atık kabına dökün.
   4. Tohumları tamamen batırmak için beherin içine çamaşır suyu çözeltisi dökün. Bir karıştırma plakasında 20 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın, ardından çamaşır suyunu bir atık kabına dökün.
   5. Tohumları batırmak için beherin içine damıtılmış su dökün ve 20 dakika boyunca bir karıştırma tabağında kuvvetlice karıştırın. Su yıkamalarını üç kez tekrarlayın, her yıkamadan sonra damıtılmış suyu dökün. Son su yıkamadan sonra, sterilize edilmiş tohumları cam Petri kabına dökün.
   6. Kirlenmeyi kontrol etmek için, sterilize forseps kullanarak laminer sel davlumbazındaki her 10 cm'lik NA plakasına (adım 1.1.1'de hazırlanan) 6 tohum aktarın. Tohumları plakanın çevresine yerleştirin (dolgun tohumlar en iyi sonucu verir). Plakaları laboratuvar ambalaj filmine ayrı ayrı sarın ve karanlıkta 26 ° C'de 3 gün boyunca inkübe edin.
      NOT: İhtiyaçtan daha fazla tohumun kaplanması, kirlenmemiş tohumların seçici kullanımına izin verecektir.
3. Aşağıdaki adımı izleyerek filiz aktarımı gerçekleştirin.
   1. Laminer akışlı bir davlumbazda, her GA plakasında 2 kirlenmemiş tohumu plakalamak için sterilize forseps kullanın (adım 1.1.2'de hazırlanmıştır). Plakaları ayrı ayrı laboratuvar ambalaj filmine sarın ve tohumların filizlenmesini sağlamak için oda sıcaklığında 7-10 gün boyunca inkübe edin.
4. Önceki bir çalışmadan değiştirilmiş bir yöntemi izleyerek in vitro yetiştirme gerçekleştirin ¹⁵.
   1. 50 mL 20 g / L sakkaroz çözeltisi hazırlayın. Filtre sakkaroz çözeltisini sterilize edin ve bir kenara koyun.
   2. Laminer bir akış başlığında, mevcut bir kültür plakasından kök dokusu (~ 2^cm3) içeren bir agar parçasını kesin. Bezelye fideleri ile yeni GA plakasına 500 μL sakkaroz çözeltisi pipet yerleştirin ve sakkarozun üzerine agar küpü yerleştirin. Plakaları laboratuvar ambalaj filmine ayrı ayrı sarın ve kültürü oda sıcaklığında (~ 22 ° C) alüminyum folyo ile kaplı bir kutuda tutun.
   3. Kültürü korumak için her 8-9 haftada bir taze GA plakalarındaki alt kültür nematodları. Nematodlar ~ 8 hafta sonra ekstrakte edilmeye hazırdır.

2. D. dipsaci'nin çıkarılması ve toplanması

1. Aşağıdaki adımları izleyerek D. dipsaci ekstraksiyonunu gerçekleştirin.
   1. Otoklav 50 mL beher, 80 mm huni, 150 mL damıtılmış su ve kahve filtreleri. Huni beher içine yerleştirin ve huniyi steril kahve filtresiyle hizalayın.
   2. Laminer bir akış başlığında, steril bir neşter kullanarak agar ve kök dokusunu 1^cm3'e kesin. Agar küplerini kahve filtresiyle kaplı huniye aktarın ve kahve filtresini nemlendirmek için yavaşça agar üzerine damıtılmış su dökün.
   3. Kahve filtresiyle kaplı huniyi beherden çıkarın ve kahve filtresiyle kaplı huni değiştirildikten sonra su seviyesi filtrenin dibine dokunana kadar beheri damıtılmış suyla doldurun.
   4. Kahve filtresi kaplı huniyi ve beheri alüminyum folyo ile örtün. Solucanların kahve filtresinden toplama kabına geçmesine izin vermek için tezgahın üstünde gece boyunca (16 saat) bırakın.
      NOT: Bir nematod kültürü plakası, bir diseksiyon mikroskobu ile incelendiğinde solucanlar agarın içine girdiğinde ekstraksiyon için hazırdır. Tipik olarak, bir plaka ilk aşılamasından 6-8 hafta sonra ekstraksiyon için hazırdır.
2. D. dipsaci koleksiyonunu gerçekleştirin.
   NOT: Ertesi gün, D. dipsaci solucanları beherin dibine yerleşmiş olacaktır.
   1. Kahve filtreli huniyi çıkarın ve toplama kabından üstteki 40 mL suyu aspire edin; yerleşmiş solucanları bozmadığınızdan emin olun. 10 mL'lik plastik serolojik pipet kullanarak, kalan sıvıyı 15 mL'lik konik santrifüj tüpünde toplayın.
      NOT: Bu koleksiyon doğrudan tahlillerde kullanılabilir. 24 saat içinde kullanılmayacaklarsa 4 ° C'ye yerleştirin. Solucanlar, hareketlilik üzerinde gözle görülür bir etkisi olmadan 4 ° C'de 3 gün boyunca bırakılabilir. Huni'nin çıkarılması, toplama kabındaki solucanları rahatsız edebilir. Toplamadan önce dibe çökelmelerine izin verin.

3. In vitro küçük moleküllü ekran

1. Aşağıdaki adımları izleyerek tahlil plakalarını hazırlayın.
   1. Otoklavlanmış damıtılmış suyu steril bir oluğa dökün ve çok kanallı bir pipet kullanarak, oluktan 40 μL damıtılmış suyu düz tabanlı 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna dağıtın.
2. Sabitleme aletini hazırlayın ve kimyasalları ekleyin
   1. Bir laboratuvar tezgahındaki Bunsen brülör alevinin yanına iğneleyici tepsileri yerleştirin (bkz. Birbirini izleyen pimleyici tepsilerine aşağıdakileri ekleyin: 25 mL pim temizleme çözeltisi, 35 mL %50 DMSO (suda), 45 mL damıtılmış su, 55 mL %70 EtOH ve 65 mL %95 EtOH. Her tepsinin önüne bir parça kurutma kağıdı yerleştirin
   2. Temizleme çözeltisindeki pimleri emzirerek ve pimleri çözelti içinde üç kez (3x) yukarı ve aşağı hareket ettirerek sabitleme aletini temizleyin. Bu protokolde, '3x' ve '10x', pinner'ı bir çözelti içinde sırasıyla üç veya on kez yukarı ve aşağı hareket ettirmek olarak tanımlanır. Leke kağıdındaki pimleri lekeleyin. Bu prosedürü bir kez daha tekrarlayın.
      1. Daha sonra, pimleri damıtılmış suda 3 kat durulayın, ardından pimleri lekeleyin. Prosedürü bir kez daha tekrarlayın.
      2. Son olarak, pimleri% 95 EtOH'de 3 kat durulayın, ardından pimleri lekeleyin. Bir kez daha tekrarlayın. Pinner'ı alevlendirin ve etanolün buharlaşmasına izin verin.
   3. 96 delikli kimyasal stok plakalarından kimyasalları, kimyasal plakaya 3x sabitleyerek tahlil plakalarına ekleyin, ardından pimleri 10X'i tahlil plakasına aktarın. Temizleme solüsyonunun önündeki kağıda dökün.
   4. Plakalar arasındaki iğneleme aletini aşağıdaki sırayla yıkayarak temizleyin, lekeleme kağıdı üzerinde aralarında leke yapın: %50 DMSO'da 3x (bir kez), damıtılmış suda 3x (bir kez), %75 EtOH'de 3x (bir kez), %95 EtOH'de 3x (iki kez). Pinner'ı alevlendirin ve etanolün buharlaşmasına izin verin.
   5. Tüm sabitleme tamamlandığında adım 3.2.2'yi yineleyin.
      NOT: Tarama, 60 μM'lik son konsantrasyonda gerçekleştirilmiştir.
3. Solucanların eklenmesi
   1. Önce yeniden askıya alarak ve ardından gözlem için bir slayta düşük tutma uçları kullanarak 5 μL'yi pipetleyerek koleksiyondaki nematodların sayısını sayın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak 5 μL'deki nematod sayısını sayın.
      1. Steril damıtılmış su kullanarak konsantrasyonu 2 solucan / μL'ye ayarlayın. Çok kanallı bir pipet ve bir oluk kullanarak, 96 delikli plakaların her bir oluğuna 10 μL (~ 20 solucan) ekleyin.
         NOT: Tarif edilen kültür ve toplama yöntemi kullanılarak kültür plakası başına yaklaşık 15.000 D. dipsaci nematodu toplanacaktır. Kuyu başına yirmi solucan kullanılır, çünkü küçük sayı, mobil ve hareketsiz olanların net bir şekilde görselleştirilmesini ve muhasebeleştirilmesini kolaylaştırır.
   2. Plakaları laboratuvar ambalaj filmine kapatın ve nemli bir kağıt havluyla sarın. Kutuya yerleştirin ve 200 rpm'de ayarlanmış 20 °C sallama inkübatöründe yapışkan bir ped üzerine yapıştırın. Plakaların minimum hareketini sağlamak için ekstra nemli bir kağıt havlu ekleyerek plakaların kutuda stabilize edildiğinden emin olun.

4. Veri toplama ve analizi

1. 5. günde plakaları diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin. DMSO solvent kontrollerindeki ve ilaçla tedavi edilen kuyulardaki mobil ve toplam D. dipsaci sayısını sayın.
   1. Solucanlar nispeten hareketsizse, ^19,20 hareketini uyarmak için kuyuya 40 mM'lik son konsantrasyona ² μL¹ M NaOH ekleyin.
      NOT: NaOH eklendikten sonra, solucanlar anında hareket eder ve 5 dakika içinde görüntülenmesi gerekir. Mobil solucanların oranını hesaplamak için mobil solucanların sayısı ve toplam solucan sayısı kullanılacaktır. Tahlilin uzunluğu, ekranın amacına bağlı olarak değişebilir.
2. Mobil solucanların oranını hesaplayın. D. dipsaci ekranlarında, tekrarlanabilir bir şekilde% 0 mobil solucan veren kuyular güçlü vuruşlar olarak kategorize edilir.
   NOT: Diseksiyon mikroskopları aşamasında plakaların uzun süre maruz kalması önlenir, çünkü ışık kaynağı plakaları ısıtabilir ve biyotahlil üzerinde değişken etkilere neden olabilir.

Sonuçlar

Bağımsız replikalar tekrarlanabilir isabetleri ortaya çıkarır
Çoğaltma ekranları arasında beklenen varyasyonu göstermek için, numune hareketliliğindeki araçlar ve varyasyon, yakın tarihli bir ekrandan üç temsili plakadan çizilmiştir (Şekil 1). Ekranın üç kopyası üç farklı günde gerçekleştirildi. Her üç plakanın da negatif (yalnızca çözücü) kontrolleri (daha koyu çubuklar) vardır ve set içindeki numuneler yerleşik nematisitler içeriyordu. Kalan bileşikler şu anda Roy laboratuvarında karakterize edilen özel bir kütüphanedendir. Aynı moleküllere sahip C. elegans ile yapılan benzer ekranlara kıyasla (SC, JK, PJR, yayınlanmamış sonuçlar), D. dipsaci ile vuruş oranı önemli ölçüde daha düşüktür ve birçok ilaç plakası hiçbir aktivite göstermez (Şekil 1A). Bazı plakalar tamamen tekrarlanabilir vuruşlara sahiptir (Şekil 1B, C), diğerleri ise aktiviteye göre değişir (Şekil 1C). Taranan diğer türlere göre (gösterilmemiştir), D. dipsaci bileşiklere tepkisinde daha az değişkenlik gösterir. Ne olursa olsun, tekrarlanabilir isabetlerin tanımlanmasında replikaların gerekli olduğu düşünülmektedir.

Nematisitler, Ditylenchus dipsaci'yi hareketsiz hale getirme yeteneklerinde farklılık gösterir.
D. dipsaci'ye karşı test edilen yedi karakterize nematisitten sadece Fluopyram, burada açıklanan tahlilde sağlam bir aktivite sergilemektedir (Şekil 1C). Bu, D. dipsaci'nin nematisitlere toleranslı olduğunu gösteren önceki çalışmalarla tutarlıdır^13,14. Fluopyram, elektron taşıma zincirinin kompleks II'sini nematod seçici bir şekilde inhibe eder ve Rotylenchulus reniformis ve Meloidogyne incognita^4,21,22 dahil olmak üzere çeşitli ^PPN'leri kontrol etmek için kullanılan ticari bir nematisittir. Fluopyram ve test edilen konsantrasyonda (Oksamil)^23'te aktivitesi olmayan nematisitlerden biri, D. dipsaci ile yapılan bir doz-yanıt analizi ile daha ayrıntılı olarak araştırılmıştır. Fluopyram, EC50 değeri 9,3 μM (8,2 ila 10,5 μM arasında %95 güven aralığıyla) ile D. dipsaci mobilitesi üzerinde doza bağımlı belirgin bir etkiye neden olur (Şekil 2A,B). Bu sonuç, Storelli ve ark., 2020^13'ün yayınlanan in vitro sonuçlarına dayanarak beklenmektedir. Oksamilin 120 μM konsantrasyona kadar hareketlilik üzerinde anlamlı bir etkisi yoktur (p = 0.3632, eşlenmemiş t-testi) (Şekil 2C, D).

Sodyum hidroksit tahlil hassasiyetini artırır
C. elegans'ın sıvı kültür^18'deki neredeyse sürekli yüzme aktivitesinin aksine, D. dipsaci hayvanları önemli ölçüde daha az hareketlidir. Bu, kültür^16'daki paraziter nematodlar arasında nadir değildir. 'Dinlendiren' solucanları hasta solucanlardan ayırt etmeye yardımcı olmak için, yetenekli bireylerde hareketi uyarmak için tahlil bitiş noktasında 40 mM NaOH kullanılır (Şekil 3)^19,20. Bu teknik, negatif kontrol kuyularındaki tüm solucanların ekranda son derece düşük bir yanlış pozitif arka plan oluşturması ve vermesi göz önüne alındığında, solucanları hareketsiz hale getiren küçük moleküllerin net bir şekilde tanımlanmasına izin verir.

Şekil 1: Ekran çıkışı örnekleri. D. dipsaci ile üç biyolojik replikasyon (açık daireler), gösterilen üç plakanın her birindeki küçük moleküllere (60 μM) karşı gerçekleştirildi. Her üç plaka da DMSO çözücü kontrollerinin% 0.6'sına sahiptir (daha koyu çubuklar). Solvent kontrolleri veya bilinen nematisitlerle aksi belirtilmedikçe, üç plakanın kuyuları, satıcılardan satın alınan nispeten karakterize edilmemiş ilaç benzeri bileşikler içerir (^bkz. (A) Küçük molekül kütüphanesinden 96 kuyucuklu bir plaka, D. dipsaci'ye karşı gözlemlenebilir biyoaktiviteye sahip herhangi bir molekülden yoksundur. (B) Küçük molekül kütüphanesinden bir 96 kuyu plakası, D. dipsaci hareketliliğini tekrar üretilebilir şekilde bozan tek bir moleküle sahiptir. (C) Karakterize nematisitler fluopiram (fluo), iprodion (ipro), abamectin (abam), fluensulfone (baca), tioxazafen (tiox), oxamyl (oxam) ve wact-11'i içeren 96 kuyucuklu bir ilaç plakası. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Hareketlilik testi kullanılarak pozitif ve negatif sonuçlara örnek . (A) D. dipsaci'nin NaOH'nin eklenmesinden 5 gün önce artan fluopiram konsantrasyonlarına maruz kalmasından sonra terminal fenotiplerine örnekler. (B) Belirtilen fluopiram konsantrasyonlarına 5 gün maruz kaldıktan sonra D. dipsaci'nin hareketinin doz-yanıt analizi. (C,D) Oksamil hariç, A, B ile aynıdır. Her grafik, her gün üç çoğaltma ile iki ayrı günde yapılan denemeleri gösterir. Her grafiğin y ekseni, kuyudaki toplam hayvan sayısına göre hareket eden hayvan sayısı olarak hesaplanan her kuyudaki solucanların hareketli fraksiyonunu gösterir. Her iki grafikteki hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. Ölçek çubuğu 1 mm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 3: 40 mM NaOH eklendikten sonra D. dipsaci'nin hareketliliği. NaOH ilavesinin D. dipsaci numunelerine 5 günlük ko-inkübasyondan sonra sadece çözücü kontrolü (A), tioksazafen (B) veya fluopyram (C) varlığında etkisi. Ölçek çubuğu 1 mm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Kritik adımlar
Protokolün basitliğine rağmen, protokolde başarı olasılığını en üst düzeye çıkarmak için ek dikkati hak eden kritik adımlar vardır. İlk olarak, tohumların aşırı ağartılması büyümelerini bozabilir. Bu nedenle, tohumların ağartma çözeltisindeki süresini 20 dakika veya daha kısa bir süre ile sınırlamak önemlidir. İkincisi, daha önce Storelli ve ark. tarafından belirtildiği gibi, nematodların görünür sağlığı, 4 ° C^16'da depolandığında zamanla azalır. Nematodların toplandıktan hemen sonra kullanılması, optimum tarama koşullarının sağlanabileceğine dair ek güven sağlar. Daha uzun süreli depolama gerekli olursa, tüpün kapağının oksijen değişimine izin verecek kadar sıkı olmadığından emin olun. Üçüncüsü, bezelyelerin önerilen süre boyunca NA plakalarında büyümesini sağlamak, deneycinin hangi tohumların kirlendiğini yargılamasını sağlar. Dördüncüsü, nematodları eklemeden önce GA plakalarındaki bezelyelerin aşırı büyütülmesi enfeksiyonu zayıflatacak ve nematod verimini azaltacaktır. Son olarak, kontrol edilmesi zor olan birçok faktör tarama sonuçlarını etkileyebilir. Bu nedenle, sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için farklı günlerde ve ideal olarak farklı kültür plakalarından toplanan PPN'lerle birden fazla bağımsız çoğaltma ekranı gerçekleştirmek önemlidir.

Yöntemin sınırlamaları
Protokoldeki bir sınırlama, toplanan solucanların gençlerden yetişkinlere kadar değişen gelişim aşamasını senkronize edememesidir. Bu nedenle, herhangi bir ekran tarafından ortaya çıkarılan güçlü vuruşlar muhtemelen birden fazla aşamada etkilidir. Bununla birlikte, protokol etkili aşamaya özgü isabetleri gözden kaçırma riskini artırır. İkinci bir husus, in vitro taramanın bir nematisit keşif boru hattında ilk adım olarak düşünülmesi gerektiğidir; Toprak bazlı tahliller, isabetlerin çevrilebilirliğini test etmek için bir boru hattına mükemmel bir ektir.

Protokolün önemi ve uygulanması
Burada açıklanan protokoller basittir ve kolayca çoğaltılabilir. Ayrıca, bu protokol, Pratylenchus penetranları da dahil olmak üzere laboratuvardaki diğer PPN'lere sadece küçük değişiklikler yapılarak başarıyla uygulanmıştır. Küresel gıda güvenliğini sağlamak için yeni ve güvenli PPN kontrol önlemlerinin geliştirilmesi esastır. Bu, özellikle D. dipsaci gibi şu anda kabul edilebilir çok çeşitli kimyasal nematisitlere toleranslı olan türler için geçerlidir^13,14. Dolayısıyla burada özetlenen protokoller, küresel ölçekte insan sağlığına önemli bir katkı sağlama potansiyeline sahiptir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tube	Sarstedt	62.554.205
2 forceps	Almedic	7747-A10-108
2L beaker	Pyrex	CLS10002L
50mL beaker	Pyrex	CLS100050
96 well plate	Sarstedt	83.3924
aluminium foil	Alcan Plus
bacteriological agar	BioShop	AGR001.5
coffee filter	No name brand	716
commercial bleach 6%	Lavo Pro 6	DIN102358107
disposable petri dishes (10cm x 1.5cm)	Fisherbrand	FB0875712
disposable petri dishes (10cm x 2.5cm)	Sigma-Aldrich	Z358762
dissecting scope	Leica	Leica MZ75
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-500ML
Funnel	VWR	414004-270
Gamborg B5	Sigma-Aldrich	G5893-10L
glass petri dish	VWR	75845-546
glass slide	MAGNA	60-1200
Lint-Free Blotting Paper	V&P Scientific	VP 522-100
Low retention pipette tips (200uL)	LABFORCE	1159M44
mutlichannel pipette	Eppendorf research plus	3125000036
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045-500G
nutrient agar	Sigma-Aldrich	70148-100G
parafilm	Bemis	PM-996
pea seeds	Ontario Seed Company	D-1995-250G
pin cleaning solutions	V&P Scientific	VP110A
pinner	V&P Scientific	VP381N
pinner rinse trays	V&P Scientific	VP 421
reagent reservoir with lid for multichannel pipettes	Sigma-Aldrich	BR703459
shaking incubator	New Brunswick Scientific	I26
sterile surgical blade	MAGNA	sb21-100-a
stir bar	Fisherbrand	2109 - 1451359
sucrose	BioShop	SUC507.1