Oleik Asit Kaynaklı Akut Solunum Sıkıntısı Sendromunun Fare Modeli

Özet

Mevcut protokol, akut solunum sıkıntısı sendromunu (ARDS) taklit etmek için oleik asit kullanan farelerde bir akciğer hasarı modelini açıklamaktadır. Bu model ödem üzerindeki inflamatuar mediyatörleri arttırır ve akciğer kompliyansını azaltır. Oleik asit, tuz formunda (oleat) kullanılır, çünkü bu fizyolojik form emboli riskini ortadan kaldırır.

Özet

Akut respiratuar distres sendromu (ARDS), yüksek ölüm oranı ile kritik hastalar için önemli bir tehdittir. Kirletici maruziyeti, sigara dumanı, bulaşıcı ajanlar ve yağ asitleri ARDS'yi indükleyebilir. Hayvan modelleri, ARDS'nin karmaşık patomekanizmasını taklit edebilir. Ancak, her birinin sınırlamaları vardır. Özellikle, oleik asit (OA), akciğer üzerinde zararlı etkileri olan kritik hastalarda artar. OA, emboli ile akciğer hasarına neden olabilir, dokuyu bozabilir, pH'ı değiştirebilir ve ödem klirensini bozabilir. OA'ya bağlı akciğer hasarı modeli, endotel hasarı, artmış alveoler geçirgenlik, inflamasyon, membran hiyalin oluşumu ve hücre ölümü ile ARDS'nin çeşitli özelliklerine benzemektedir. Burada, akciğer hasarının indüksiyonu, OA'nın (tuz formunda) doğrudan akciğere enjekte edilmesiyle ve pH 7'de OA'nın fizyolojik formu olduğu için bir farede intravenöz olarak tanımlanmaktadır. Bu nedenle, OA'nın tuz formunda enjeksiyonu, emboliye neden olmadan veya pH'ı değiştirmeden akciğer hasarını / ARDS'yi incelemek ve böylece kritik hastalarda olanlara yaklaşmak için yararlı bir hayvan modelidir.

Giriş

Ashbaugh ve ^ark.1, 1967'de ilk olarak akut solunum sıkıntısı sendromunu (ARDS) tanımladılar ve o zamandan beri birçok revizyondan geçtiler. Berlin tanımına göre ARDS, ventilasyon-perfüzyon oranındaki dengesizlik, diffüz bilateral alveoler hasar (DAD) ve infiltrasyon, artmış akciğer ağırlığı ve^{ödem 2,3} nedeniyle akut solunum yetmezliği ve hipoksemiye (PaO 2/FiO₂ > 300 mm Hg) yol açan bir akciğer inflamasyonudur. Pulmoner parankim, epitelyal, endotel ve diğer hücreler tarafından birleştirilen karmaşık bir hücresel ortamdır. Bu hücreler, alveollerde gaz değişimi ve homeostazdan sorumlu bariyerler ve yapılar oluşturur³. Epitel bariyeri içinde en bol bulunan hücreler, Na/K-ATPaz yoluyla gaz değişimi ve sıvı yönetimi için daha geniş bir yüzey alanına sahip alveolar tip I hücrelerdir (AT1). Ayrıca, alveolar tip II hücreler (AT2), alveoller^4'teki yüzey gerilimini azaltarak yüzey aktif madde üretir. Altında, endotel hücreleri, pulmoner dolaşımı interstisyumdan ayıran yarı geçirgen bir bariyer oluşturur. İşlevleri arasında uyaranları tespit etmek, inflamatuar yanıtları koordine etmek ve hücresel transmigrasyon^{yer alır 5}. Endotel hücreleri ayrıca gaz değişimini, vasküler tonusu ve pıhtılaşmayı^{düzenler 5}. Bu nedenle, endotelyal ve epitelyal fonksiyon bozuklukları proinflamatuar bir fenotipi şiddetlendirerek ARDS^5'e yol açan akciğer hasarına neden olabilir.

ARDS gelişimi, bakteriyel ve viral pnömoni veya pulmoner olmayan sepsis, travma, kan transfüzyonu ve pankreatit gibi dolaylı faktörlerle ilişkili risklidir⁶. Bu koşullar, TNF-α, IL-1β, IL-6 ve IL-8⁵ gibi proinflamatuar sitokinleri ve kemokinleri indükleyen patojenlerle ilişkili moleküler modellerin (PAMP'ler) ve hasarla ilişkili moleküler modellerin (DAMP'ler) salınmasına neden olur. TNF-α, endotel bariyeri bozulması ve akciğer parankimine lökosit infiltrasyonunda vasküler-endotelyal kaderin (VE-kaderin) bozulması ile bağlantılıdır. Nötrofiller, IL-8 ve LTB₄ ^5,7,8 tarafından çekilen göç eden ilk hücrelerdir. Nötrofiller ayrıca proinflamatuar sitokinleri, reaktif oksijen türlerini (ROS)⁹ ve nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) oluşumunu artırarak ekstra endotel ve epitelyal hasara neden olur¹⁰. Epitel hasarı, AT2 hücrelerinde ve yerleşik makrofajlarda Toll benzeri reseptörlerin iltihaplanmasına ve aktivasyonuna yol açarak, enflamatuar hücreleri akciğerlere çeken kemokinlerin salınmasına neden olur⁴. Ayrıca, interferon-β (INF_β) gibi sitokinlerin üretimi, TNF ile ilişkili apoptozu indükleyen reseptörlere (TRAIL) neden olarak ATII hücrelerini apoptoza götürür, sıvı ve iyon berraklığını bozar⁴. Endotel ve epitelyal bariyer yapısının bozulması, sıvının, proteinlerin, kırmızı kan hücrelerinin ve lökositlerin alveoler boşluğa akmasına izin vererek ödeme neden olur. Ödem oluştuğunda, solunum ve gaz değişimini sürdürmek için pulmoner çaba değişir¹¹. Hiperkapni ve hipoksemi, hücre ölümüne ve sodyum taşıma bozukluğuna neden olarak, zayıf temizleme kapasitesi nedeniyle alveolar ödemi şiddetlendirir¹⁰. ARDS ayrıca organ disfonksiyonu, artmış alveoler nötrofil yüzdesi ve alveolar geçirgenlik⁹ ile ilişkili yüksek IL-17A seviyelerine sahiptir.

Son yıllarda ARDS'nin patofizyolojisi, epidemiyolojisi ve tedavisi ile ilgili araştırmalarda ilerlemeler olmuştur^12,13. Bununla birlikte, ARDS, mekanik ventilasyon ve sıvı tedavisi optimizasyonu ile sonuçlanan terapötik araştırmalardaki ilerlemeye rağmen heterojen bir sendromdur. Bu nedenle, daha etkili bir doğrudan farmakolojik tedaviye hala ihtiyaç vardır¹⁰ ve hayvan çalışmaları, ARDS mekanizmalarının ve müdahale hedeflerinin ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir.

Mevcut ARDS modelleri patolojiyi tam olarak kopyalayamamaktadır. Bu nedenle, araştırmacılar genellikle ilgi alanlarına daha uygun modeli seçerler. Örneğin, lipopolisakkarit (LPS) indüksiyon modeli, esas olarak TLR4¹⁴ tarafından tetiklenen endotoksik şokla ARDS'yi indükler. HCl indüksiyonu asit aspirasyonunu taklit eder ve hasar nötrofilik bağımlıdır¹⁴. Öte yandan, mevcut sodyum oleat modeli, vasküler geçirgenliği ve ödemi artıran endotel hasarına neden olur. Ayrıca, sıvı formda oleik asit yerine sodyum oleat kullanılması, emboli risklerini ve kan pH'ındaki değişiklikleri^{önler 15}.

ARDS için hayvan modelleri
Hayvan modellerinde yapılan klinik öncesi çalışmalar, patolojinin anlaşılmasına yardımcı olur ve yeni ARDS tedavileri araştırmaları için gereklidir. İdeal hayvan modeli, klinik duruma benzeyen özelliklere ve her hastalık evresinin, evriminin ve onarımının ilgili patofizyolojik özellikleri ile hastalık mekanizmalarının iyi tekrarlanabilirliğine sahip olmalıdır¹⁴. ARDS'de akut akciğer hasarını klinik öncesi değerlendirmek için çeşitli hayvan modelleri kullanılmaktadır. Bununla birlikte, tüm modellerin sınırlamaları olduğundan, insan patolojisini tam olarak yeniden üretmezler 6,14,16. Oleik asit kaynaklı ARDS, farklı hayvan türlerinde^{kullanılır 17}. OA enjeksiyonuna tabi tutulan domuzlar¹⁸, koyunlar¹⁹ ve^{köpekler 20}, alveolar-kapiller membran disfonksiyonu ve protein ve hücre infiltrasyonu ile artmış geçirgenlik ile hastalığın çok sayıda klinik özelliğini gösterir.

Örneğin, 1.25 μM'de OA, intravenöz olarak enjekte edilen transepitelyal taşımayı bloke ederek alveolar ödem^15'e yol açtı. Alternatif olarak, A549 hücreleri kullanan in vitro modelde, 10 μM konsantrasyondaki OA, epitelyal sodyum kanalını (eNAC) veya Na/K-ATPaz ekspresyonunu değiştirmedi. Bununla birlikte, OA her iki kanalla da ilişkili görünmektedir ve aktivitelerini doğrudan inhibe etmektedir²¹. 0.1 mL/kg'da OA intravenöz enjeksiyon, akciğer dokusu tıkanıklığına ve şişliğine, kalınlaşmış alveolar septa ile alveolar boşlukların azalmasına ve inflamatuar ve kırmızı kan hücresi sayımının artmasına neden oldu²². Ayrıca, OA, akciğerdeki endotel ve epitel hücrelerinde apoptoz ve nekroza neden oldu¹⁵. Farelerde intratrakeal olarak bir tris-oleat çözeltisinin enjeksiyonu, stimülasyondan 6 saat sonra nötrofil infiltrasyonunu ve ödemi arttırdı²³. 24 saatte OA enjeksiyonu proinflamatuar sitokin düzeylerini arttırdı (ör., TNF-α, IL-6 ve IL-1β)²³. Ek olarak, 10 μM'lik bir tris-oleatın intravenöz (orbital pleksus) enjeksiyonu, seçici bir enzim inhibitörü olan 10-3 μM'de ouabain'e benzer şekilde pulmoner Na / ^K-ATPaz aktivitesini inhibe eder. Ayrıca, OA, hücre infiltrasyonu, lipid cisimciklerinin oluşumu ve lökotrien B4 (LTB₄) ve prostaglandin E2 (PGE₂) üretimi ile inflamasyonu indükler22,24. Bu nedenle, oleik asit kaynaklı ARDS ödem, kanama, nötrofil infiltrasyonu, artmış miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi ve ROS²⁴ üretir. Bu nedenle, OA uygulaması akciğer hasarı için iyi bilinen bir modeldir^22,25. OA'ya sahip bu makalede sunulan tüm sonuçlar, tuz formu olan sodyum oleatı temsil eder.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan prosedürler, Oswaldo Cruz Vakfı Hayvanların Kullanımına İlişkin Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (CEUA lisansları n°002-08, 36/10 ve 054/2015). Deneyler için Oswaldo Cruz Vakfı'nın (FIOCRUZ) Biyomodellerde Bilim ve Teknoloji Enstitüsü (ICTB) tarafından sağlanan 20-30 g ağırlığındaki erkek İsviçre Webster fareleri kullanıldı. Hayvanlar, Pavilhão Ozório de Almeida'nın vivaryumunda havalandırmalı izolatörlerde tutuldu ve su ve yiyecek ad libitum olarak mevcuttu. 12 saat / 12 saat aydınlık ve karanlık döngüsüne maruz bırakıldılar.

1. Sodyum oleat çözeltisinin hazırlanması

1. Herhangi bir steril tüp veya cam şişede 100 mmol / L sodyum oleat stok çözeltisi hazırlamak için oleik asit kullanın.
   NOT: Bu çalışma için 50 mL'lik (son hacim) bir çözelti hazırlandı, ancak hacim deneysel ihtiyaca göre ayarlanmalıdır. Çözelti her zaman steril tüplerde veya cam kaplarda hazırlanmalıdır.
   1. İlk olarak, pH'ı yükseltmek için ultra saf suya NaOH tabletleri veya çözeltisi ekleyin. 25 mL'lik bir hacim için 12-13'lük bir pH değeri önerilir.
      NOT: Alternatif olarak, Tris-oleate çözeltisini hazırlamak için Tris bazı kullanılabilir.
   2. Oleik asidi (Malzeme Tablosuna bakınız) çok yavaş, 37 ° C'de ultrasonik bir banyoda sürekli çalkalama altında damla damla ekleyin.
      NOT: Oleik asit çökelmesi meydana gelirse, baştan başlayın.
   3. Oleik asit tamamen çözüldüğünde, pH'ı dikkatlice 7.4'e ayarlayın, ultra saf seyreltilmiş HCl ile karıştırarak damla damla ayarlayın ve ardından 50 mL'lik son hacme ayarlayın.
      NOT: Çalışma oleat çözeltilerini taze olarak hazırlayın. Alternatif olarak, çözelti bir aydan daha uzun süre oksidasyonu önlemek için nitrojenle zenginleştirilmiş bir ortamda -20 ° C'de tutulabilir, stoklanabilir ve muhafaza edilebilir. Dondurulmuş-yeniden dondurulmuş döngülerden kaçının.

2. Oleik asit ile akciğer hasarının indüksiyonu

1. Oleik asidin intratrakeal uygulamasını gerçekleştirin.
   1. Bir veteriner anestezik buharlaştırıcı kullanarak fareleri 2 L / dak_O2 ile% 5 izofluran kullanarak uyuşturun (Şekil 1A). Kesi bölgesindeki tüyleri tüy dökücü kremle çıkarın ve steril gazlı bez kullanarak bölgeyi üç alternatif betadin ovma ve alkol ile dezenfekte edin. Anestezi derinliğini ayak parmağınızı sıkıştırarak onaylayın.
      NOT: İşlem sırasında steril eldiven ve aletler kullanın. Hayvanı örtmek ve sadece kesi bölgesini ortaya çıkarmak için bir örtü kullanın. İzofloranın çevreye kaçmasını önlemek için deneyi biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirin. Analjezikler, inflamatuar yanıtı inhibe edebilecekleri için uygulanmaz.
   2. Anesteziden sonra hayvanı dorsal dekübit pozisyonuna getirin ve tiroid seviyesinde V şeklinde bir kesi (0.5-1 cm) yapın. Trakeayı ortaya çıkarmak için tiroidi hafifçe değiştirin (Şekil 1B) ve hazırlanan oleat çözeltisinden 50 μL enjekte edin (adım 1).
      NOT: Fareler, her grupta sekiz hayvan olacak şekilde iki gruba ayrıldı. Akciğer hasarı grubu 25 mM'de (1.25 μmol) sodyum-oleat çözeltisi alır ve kontrol grubu, her farenin trakeasına bir insülin şırıngası (hacim 300 μL, 30 G) ile damlatılarak 50 μL steril salin alır (Şekil 1C).
   3. Farelerin kesi bölgesini sentetik, emilmeyen monofilament bir sütür ile dikin, kafeslerine geri koyun ve ameliyattan tamamen iyileşene kadar izleyin. Tüm prosedürler sırasında hayvanları 37 °C'de bir ısıtma yastığı üzerinde tutun.
      NOT: Farelerin ameliyattan sonra iyileşmesi genellikle 15 dakika kadar sürer.
2. İntravenöz oleik asit uygulaması yapın.
   1. Anesteziden sonra (adım 2.1.1, Şekil 2A), ultra ince iğneyi (bkz. Malzeme Tablosu) göz yuvasının medial kantusuna sokarak orbital pleksusa intravenöz olarak enjekte edin (Şekil 2B).
      NOT: Fareler, her grupta sekiz hayvan olacak şekilde iki gruba ayrıldı. Her grup, hayvan başına 10 μmol OA'da 100 μL sodyum-oleat çözeltisi alırken, kontrol grubu 100 μL steril salin alır.
3. Ameliyattan sonra, olumsuz reaksiyonlar için hayvanları günlük olarak izleyin. Ötenazi için insancıl son noktalar arasında advers reaksiyonlar, konvülsiyonlar ve koma bulunur.

3. Bronkoalveoler lavaj sıvısı toplanması (BALF)

1. Fareleri intraperitoneal öldürücü dozda ketamin (300 mg / Kg) ve ksilazin (30 mg / Kg) ile ötenazi yapın (bkz.
2. Hayvanı dorsal dekübit pozisyonuna yatırın, hayvanların ön bölgesinde cerrahi makasla yaklaşık 1 cm'lik bir kesi yapın, trakeayı ortaya çıkarın ve intravenöz kateter (20 G) yerleştirmek için küçük bir kesi yapın.
3. Kateteri 1 mL'lik steril bir şırıngaya bağlayın, akciğerlere yavaşça ve kademeli olarak 0.5 mL steril salin enjekte edin ve ardından sıvıyı aynı şırınga ile BALV'den aspire edin. 3-5 kez tekrarlayın ve steril bir mikrotüpe aktarın ve buza yerleştirin.
   NOT: Numuneler -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.

4. BALBS'de toplam ve diferansiyel hücre analizi

1. Toplam hücre sayımı için, 20 μL BALB'yi 180 μL (10x seyreltme) Turk çözeltisinde seyreltin (bkz. Sayımı, 40x objektifli optik mikroskop altında bir Neubauer odası kullanarak gerçekleştirin.
2. Diferansiyel sayım için, slaytlar içeren hücresel huniye 100 μL BALF koyun ve bir sitosantrifüjde 4 ° C'de 5 dakika boyunca 22.86 x g'da santrifüjleyin ve May-Grunwald (% 15, pH 7.2) -Giemsa (1:10) ile boyayın (bkz. Daldırma objektifli bir ışık mikroskobunda hücre sayımına devam edin.

5. BALBS'de toplam protein tayini

1. Ticari bir protein niceleme kiti ile toplam BALF süpernatan proteinini belirleyin ve üreticinin talimatlarını izleyerek bir spektrofotometre kullanarak 562 nm'de absorbansı okuyun (bkz.

6. Enzim immünosorbent testleri

1. BALM'ı 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı bir pipetle toplayın ve TNF-α, IL-1β, IL-6 ve PGE2 15,23,25 testleri için -80 °C'de saklayın.
   NOT: Adım 6.1'deki santrifüjleme, BALIF'ı hücresiz hale getirir.
   1. Sitokin tahlillerini, üreticinin talimatlarına göre ticari bir ELISA kiti kullanarak hücresiz BALF üzerinde gerçekleştirin. PGE2 tahlilini, üreticinin talimatlarını izleyerek bir enzim immünoassay (EIA) kiti kullanarak gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).

7. Lipid vücut boyama ve sayım

1. Lökositleri Ca 2 +, Mg^{2 +} serbest Hank tamponlu tuz çözeltisinde (HBSS, pH 7.4) %3.7 formaldehit kullanarak sitospin slaytlarına sabitleyin ve hala nemliyken %1.5 OsO₄ ile boyayın³ (bkz. Ardından, mikroskobun yağa daldırma objektif lensini kullanarak her slayttan 50 ardışık lökositte hücre başına lipid gövdelerini sayın.

8. İstatistiksel analiz

1. Grafik ve istatistik yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın (bkz. Sonuçları ortalama ± SEM olarak ifade edin ve tek yönlü Anova ve ardından son test Newman-Keuls-Student²⁶ ile analiz edin. P < 0.05 olduğunda farkları önemli olarak düşünün.

Sonuçlar

Yaralanmamış bir akciğerde, alveolar sıvı klirensi, iyonların sağlam alveolar epitel tabakasından taşınması ile meydana gelir. Ozmotik gradyan, sıvıyı alveollerden pulmoner interstisyuma taşır, burada lenfatik damarlar tarafından boşaltılır veya yeniden emilir. Na/K-ATPase bu taşımayı^{çalıştırır 11}. OA, daha önce önerdiğimiz gibi ödem oluşumuna katkıda bulunabilecek bir Na/K-ATPaz²⁷ ve sodyum kanalı 21 inhibitörüdür²³

Tartışmalar

Klinik öncesi çalışmaları yürütmek için doğru ARDS modelinin seçilmesi esastır ve değerlendirici yaş, cinsiyet, uygulama yöntemleri ve diğerleri gibi tüm olası değişkenleri göz önünde bulundurmalıdır⁶. Seçilen model, sepsis, lipid embolisi, pulmoner vaskülatür iskemi-reperfüzyonu ve diğer klinik riskler gibi risk faktörlerine dayalı olarak hastalığı yeniden üretmelidir¹⁴. Bununla birlikte, ARDS için kullanılan hiçbir hayvan modeli, insa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic vaporizer	SurgiVet	model 100
Braided slik thread with needle number 5	Shalon medical	N/A
Cabinet vivarium	Insight	Model EB273
Centrifuge	Eppendorf	5430/5430R
Cytofunnel	ThermoFisher	11-025-48
Drontal puppy	Bayer	N/A
Hank's balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4981
Heatpad	tkreprodução	TK-500
Hydrocloric Acid	Sigma-Aldrich	30721
Insulin syringe Ultrafine	BD	328322
Isoforine 1mL/mL	Cristália	N/A
Ketamine	Syntec	N/A
May-Grunwald-Giemsa	Sigma-Aldrich	205435
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23235
Microscope  PrimoStar	Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA	R&D system	DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA	R&D system	DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA	R&D system	DY410
Neubauer chamber improved bright-line	Global optics
Oleic Acid (99%)	Sigma-Aldrich	O1008
Osmium tetroxide solution (4%)	Sigma-Aldrich	75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G	BD Angiocath	388333
Prism 8 (graphic and statistic software)	Graphpad	N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal	Cayman Chemical	514010
Shandon Cytospin 3	ThermoFisher	N/A
Sodium hydroxide	Merck	1,06,49,81,000
Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice	ICTB/FIOCRUZ	N/A
Syringe 1 mL	BD	990189
Tris-base	Bio Rad	161-0719	Electrophoresis purity reagent
Türk's solution	Sigma-Aldrich	93770
Xilazine	Syntec	N/A