Modello murino di sindrome da distress respiratorio acuto indotto da acido oleico

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un modello di danno polmonare nei topi che utilizza acido oleico per imitare la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS). Questo modello aumenta i mediatori dell'infiammazione sull'edema e diminuisce la compliance polmonare. L'acido oleico viene utilizzato sotto forma di sale (oleato) poiché questa forma fisiologica evita il rischio di embolia.

Abstract

La sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) è una minaccia significativa per i pazienti critici con un alto tasso di mortalità. L'esposizione agli inquinanti, il fumo di sigaretta, gli agenti infettivi e gli acidi grassi possono indurre ARDS. I modelli animali possono imitare il complesso meccanismo patotico dell'ARDS. Tuttavia, ognuno di essi ha dei limiti. In particolare, l'acido oleico (OA) è aumentato nei pazienti in condizioni critiche con effetti dannosi sul polmone. L'OA può indurre lesioni polmonari attraverso emboli, interrompendo il tessuto, alterando il pH e compromettendo la clearance dell'edema. Il modello di danno polmonare indotto da OA assomiglia a varie caratteristiche dell'ARDS con danno endoteliale, aumento della permeabilità alveolare, infiammazione, formazione di ialina di membrana e morte cellulare. In questo caso, l'induzione del danno polmonare è descritta iniettando l'OA (in forma di sale) direttamente nel polmone e per via endovenosa in un topo poiché è la forma fisiologica dell'OA a pH 7. Pertanto, l'iniezione di OA sotto forma di sale è un modello animale utile per studiare il danno polmonare/ARDS senza causare emboli o alterare il pH, avvicinandosi così a ciò che sta accadendo nei pazienti critici.

Introduzione

Ashbaugh et ^al.1, nel 1967, descrissero per la prima volta la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) e da allora sono stati sottoposti a molteplici revisioni. Secondo la definizione di Berlino, l'ARDS è un'infiammazione polmonare che porta a un'insufficienza respiratoria acuta e all'ipossiemia (PaO 2 / FiO 2 > 300 mm Hg) a causa di uno squilibrio nel rapporto ventilazione/perfusione, danno alveolare bilaterale diffuso (DAD) e infiltrato, aumento del peso polmonare ed edema ^2,3. Il parenchima polmonare è un ambiente cellulare complesso composto da cellule epiteliali, endoteliali e di altro tipo. Queste cellule formano barriere e strutture responsabili dello scambio gassoso e dell'omeostasi negli alveoli³. Le cellule più abbondanti all'interno della barriera epiteliale sono le cellule alveolari di tipo I (AT1) con una superficie più ampia per lo scambio gassoso e la gestione dei fluidi attraverso Na/K-ATPasi. Inoltre, le cellule alveolari di tipo II (AT2) producono tensioattivo, riducendo la tensione superficiale negli alveoli⁴. Al di sotto, le cellule endoteliali formano una barriera semipermeabile che separa la circolazione polmonare dall'interstizio. Le sue funzioni includono il rilevamento degli stimoli, il coordinamento delle risposte infiammatorie e la trasmigrazione cellulare⁵. Le cellule endoteliali regolano anche lo scambio gassoso, il tono vascolare e la coagulazione⁵. Pertanto, i disturbi della funzione endoteliale ed epiteliale possono esacerbare un fenotipo proinfiammatorio, causando danni polmonari che portano all'ARDS⁵.

Lo sviluppo dell'ARDS è associato al rischio di polmonite batterica e virale o a fattori indiretti come sepsi non polmonare, traumi, trasfusioni di sangue e pancreatite⁶. Queste condizioni causano il rilascio di pattern molecolari associati a patogeni (PAMP) e pattern molecolari associati al danno (DAMPs), inducendo citochine e chemochine proinfiammatorie come TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8⁵. Il TNF-α è legato alla degradazione della caderina vascolare-endoteliale (VE-caderina) nella rottura della barriera endoteliale e nell'infiltrazione dei leucociti nel parenchima polmonare. I neutrofili sono le prime cellule a migrare, attratte da IL-8 e LTB₄ ^5,7,8. I neutrofili aumentano ulteriormente le citochine proinfiammatorie, le specie reattive dell'ossigeno (ROS)⁹ e la formazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET) generando un danno endoteliale ed epiteliale extra¹⁰. Il danno epiteliale provoca l'infiammazione e l'attivazione dei recettori Toll-like nelle cellule AT2 e nei macrofagi residenti, inducendo il rilascio di chemochine che attirano le cellule infiammatorie nei polmoni⁴. Inoltre, la produzione di citochine come l'interferone-β (INF_β) provoca recettori che inducono l'apoptosi correlati al TNF (TRAIL), portando le cellule ATII all'apoptosi, compromettendo la chiarezza del fluido e degli ioni⁴. La rottura della struttura della barriera endoteliale ed epiteliale consente l'afflusso di liquidi, proteine, globuli rossi e leucociti nello spazio alveolare, causando edema. Con l'edema stabilitosi, lo sforzo polmonare per mantenere la respirazione e lo scambio di gas è alterato¹¹. L'ipercapnia e l'ipossiemia inducono la morte cellulare e disturbi del trasporto del sodio, aggravando l'edema alveolare a causa della scarsa capacità di clearance¹⁰. L'ARDS ha anche livelli elevati di IL-17A, associati a disfunzione d'organo, aumento della percentuale di neutrofili alveolari e permeabilità alveolare⁹.

Negli ultimi anni sono stati compiuti progressi nella ricerca sulla fisiopatologia, l'epidemiologia e il trattamento dell'ARDS^12,13. Tuttavia, l'ARDS è una sindrome eterogenea, nonostante i progressi della ricerca terapeutica che hanno portato alla ventilazione meccanica e all'ottimizzazione della fluidoterapia. Pertanto, è ancora necessario un trattamento farmacologico diretto più efficace¹⁰ e gli studi sugli animali possono aiutare a svelare i meccanismi dell'ARDS e gli obiettivi per l'intervento.

Gli attuali modelli di ARDS non sono in grado di replicare completamente la patologia. Pertanto, i ricercatori spesso scelgono il modello che potrebbe adattarsi meglio ai loro interessi. Ad esempio, il modello di induzione dei lipopolisaccaridi (LPS) induce ARDS per shock endotossico innescato principalmente da TLR4¹⁴. L'induzione dell'HCl imita l'aspirazione acida e il danno è neutrofilo-dipendente¹⁴. D'altra parte, l'attuale modello di oleato di sodio induce danni endoteliali che aumentano la permeabilità vascolare e l'edema. Inoltre, l'utilizzo dell'oleato di sodio al posto dell'acido oleico in forma liquida evita i rischi di embolia e l'alterazione del pH¹⁵ del sangue.

Modelli di animali per ARDS
Gli studi preclinici in modelli animali aiutano a comprendere la patologia e sono essenziali per la ricerca di nuovi trattamenti per l'ARDS. Il modello animale ideale deve avere caratteristiche simili alla situazione clinica e una buona riproducibilità dei meccanismi della malattia con caratteristiche fisiopatologiche rilevanti di ogni stadio, evoluzione e riparazione^{della malattia 14}. Diversi modelli animali sono utilizzati per valutare il danno polmonare acuto nell'ARDS in fase preclinica. Tuttavia, poiché tutti i modelli hanno dei limiti, non riproducono completamente la patologia umana 6,14,16. L'ARDS indotta dall'acido oleico è utilizzata in diverse specie animali¹⁷. I suini¹⁸, gli ovini¹⁹ e i cani²⁰ sottoposti a iniezione di OA presentano numerose caratteristiche cliniche della malattia con disfunzione della membrana alveolare-capillare e aumento della permeabilità con l'infiltrazione di proteine e cellule.

Ad esempio, l'OA a 1,25 μM iniettato per via endovenosa ha bloccato il trasporto transepiteliale portando all'edema alveolare¹⁵. In alternativa, nel modello in vitro che utilizzava cellule A549, l'OA a una concentrazione di 10 μM non ha modificato il canale epiteliale del sodio (eNAC) o l'espressione di Na/K-ATPasi. Tuttavia, l'OA sembra associarsi a entrambi i canali, inibendo direttamente la loro attivitಹ. L'iniezione endovenosa di OA a 0,1 ml/kg ha causato congestione e gonfiore del tessuto polmonare, riduzione degli spazi alveolari con setti alveolari ispessiti e aumento della conta infiammatoria e dei globuli rossi²². Inoltre, l'OA ha indotto l'apoptosi e la necrosi nelle cellule endoteliali ed epiteliali del polmone¹⁵. L'iniezione di una soluzione di tris-oleato, per via intratracheale nei topi, ha migliorato l'infiltrazione dei neutrofili e l'edema già 6 ore dopo la stimolazione²³. L'iniezione di OA a 24 ore ha aumentato i livelli di citochine proinfiammatorie (cioè TNF-α, IL-6 e IL-1β)²³. Inoltre, l'iniezione endovenosa (plesso orbitale) di 10 μM di un tris-oleato inibisce l'attività polmonare Na/K-ATPasi, simile all'ouabaina a ^10-3 μM, un inibitore enzimatico selettivo. Inoltre, l'OA induce infiammazione con infiltrazione cellulare, formazione di corpi lipidici e produzione di leucotriene B4 (LTB₄) e prostaglandina E2 (PGE₂)^22,24. Pertanto, l'ARDS indotta dall'acido oleico genera edema, emorragia, infiltrazione di neutrofili, aumento dell'attività della mieloperossidasi (MPO) e ROS²⁴. Pertanto, la somministrazione di OA è un modello consolidato per il danno polmonare^22,25. Tutti i risultati presentati in questo articolo che hanno OA rappresentano la forma del sale, oleato di sodio.

Protocollo

Le procedure utilizzate in questo studio sono state approvate dal Comitato Etico per l'Uso degli Animali della Fondazione Oswaldo Cruz (licenze CEUA n°002-08, 36/10 e 054/2015). Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi Webster svizzeri maschi di peso compreso tra 20 e 30 g, forniti dall'Istituto di Scienza e Tecnologia in Biomodelli (ICTB) della Fondazione Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Gli animali erano tenuti in isolatori ventilati nel vivaio del Pavilhão Ozório de Almeida, e acqua e cibo erano disponibili ad libitum. Sono stati esposti a un ciclo di luce e buio di 12 ore/12 ore.

1. Preparazione della soluzione di oleato di sodio

1. Utilizzare l'acido oleico per preparare 100 mmol/L di soluzione madre oleata di sodio in qualsiasi provetta sterile o pallone di vetro.
   NOTA: Per il presente lavoro è stata preparata una soluzione da 50 mL (volume finale), ma il volume deve essere regolato secondo le esigenze sperimentali. La soluzione deve essere sempre preparata in provette sterili o contenitori di vetro.
   1. Innanzitutto, aggiungi compresse o soluzioni di NaOH in acqua ultrapura per aumentare il pH. Si consiglia un valore di pH di 12-13 per un volume di 25 mL.
      NOTA: In alternativa, la base Tris può essere utilizzata per preparare la soluzione Tris-oleato.
   2. Aggiungere l'acido oleico (vedi tabella dei materiali) molto lentamente, goccia a goccia, sotto agitazione costante in un bagno ad ultrasuoni a 37 °C.
      NOTA: Se si verifica una precipitazione dell'acido oleico, ricominciare dall'inizio.
   3. Una volta che l'acido oleico è completamente disciolto, regolare attentamente il pH a 7,4, goccia a goccia sotto agitazione, con HCl diluito ultrapuro e quindi regolare al volume finale di 50 mL.
      NOTA: Preparare di fresco le soluzioni di lavoro dell'oleato. In alternativa, la soluzione può essere aliquotata, immagazzinata e mantenuta a -20 °C in un ambiente arricchito di azoto per evitare l'ossidazione per non più di un mese. Evitare cicli congelati-ricongelati.

2. Induzione del danno polmonare da parte dell'acido oleico

1. Eseguire la somministrazione intratracheale di acido oleico.
   1. Anestetizzare i topi utilizzando isoflurano al 5% con 2 L/min di O₂ utilizzando un vaporizzatore anestetico veterinario (Figura 1A). Rimuovere il pelo nell'area dell'incisione con una crema depilatoria e disinfettare l'area con tre cicli alternati di scrub betadine e alcol utilizzando una garza sterile. Confermare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi.
      NOTA: Utilizzare guanti e strumenti sterili durante la procedura. Usa un telo per coprire l'animale ed esporre solo il sito dell'incisione. Eseguire l'esperimento in una cabina di sicurezza biologica per evitare la fuoriuscita di isofluorano nell'ambiente. Gli analgesici non vengono somministrati in quanto possono inibire la risposta infiammatoria.
   2. Dopo l'anestesia, adagiare l'animale in posizione di decubito dorsale ed eseguire un'incisione (0,5-1 cm) a forma di V a livello della tiroide. Spostare delicatamente la tiroide per esporre la trachea (Figura 1B) e iniettare 50 μL della soluzione oleata preparata (fase 1).
      NOTA: I topi sono stati divisi in due gruppi, con otto animali in ciascun gruppo. Il gruppo con lesione polmonare riceve una soluzione di sodio-oleato a 25 mM (1,25 μmol) e il gruppo di controllo riceve 50 μL di soluzione fisiologica sterile per instillazione nella trachea di ciascun topo con una siringa da insulina (volume 300 μL, 30 G) (Figura 1C).
   3. Suturare il sito di incisione dei topi con una sutura sintetica monofilamento non assorbibile, riportarla nella gabbia e monitorarla fino al completo recupero dall'intervento chirurgico. Durante tutte le procedure, mantenere gli animali su un termoforo a 37 °C.
      NOTA: I topi di solito impiegano fino a 15 minuti per riprendersi dall'intervento chirurgico.
2. Eseguire la somministrazione endovenosa di acido oleico.
   1. Dopo l'anestesia (passaggio 2.1.1, Figura 2A), iniettare per via endovenosa nel plesso orbitale inserendo l'ago ultrasottile (vedere Tabella dei materiali) nel canto mediale dell'orbita oculare (Figura 2B).
      NOTA: I topi sono stati divisi in due gruppi, con otto animali in ciascun gruppo. Ogni gruppo riceve 100 μL di soluzione di sodio-oleato a 10 μmol di OA per animale, mentre il gruppo di controllo riceve 100 μL di soluzione fisiologica sterile.
3. Dopo l'intervento chirurgico, monitorare quotidianamente gli animali per verificare la presenza di reazioni avverse. Gli endpoint umani per l'eutanasia includono reazioni avverse, convulsioni e coma.

3. Raccolta del liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF)

1. Sopprimere i topi con una dose letale intraperitoneale di ketamina (300 mg/Kg) e xilazina (30 mg/Kg) (vedi Tabella dei materiali).
2. Adagiare l'animale in posizione di decubito dorsale, praticare un'incisione di circa 1 cm con forbici chirurgiche nella regione anteriore dell'animale, esporre la trachea ed eseguire un piccolo taglio per introdurre un catetere endovenoso (20 G).
3. Collegare il catetere a una siringa sterile da 1 mL, iniettare lentamente e gradualmente 0,5 mL di soluzione fisiologica sterile nei polmoni, quindi aspirare il liquido dal BALF con la stessa siringa. Ripetilo 3-5 volte e trasferiscilo in una microprovetta sterile, mettendoli nel ghiaccio.
   NOTA: I campioni possono essere conservati a -20 °C per un massimo di 6 mesi.

4. Analisi cellulare totale e differenziale in BALF

1. Per la conta cellulare totale, diluire 20 μL di BALF in 180 μL (diluizione 10x) di soluzione di Turk (vedere Tabella dei materiali). Eseguire il conteggio utilizzando una camera Neubauer al microscopio ottico con un obiettivo 40x.
2. Per la conta differenziale, mettere 100 μL di BALF nell'imbuto cellulare contenente i vetrini e centrifugarlo a 22,86 x g per 5 minuti a 4 °C in una citocentrifuga, e colorare con May-Grunwald (15%, pH 7,2)-Giemsa (1:10) (vedi Tabella dei materiali). Procedere con la conta cellulare al microscopio ottico con obiettivo ad immersione.

5. Determinazione delle proteine totali in BALF

1. Determinare la proteina surnatante totale di BALF con un kit di quantificazione delle proteine commerciale e leggere l'assorbanza a 562 nm utilizzando uno spettrofotometro seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).

6. Saggi di immunoassorbimento enzimatico

1. Centrifugare BALF a 1.200 x g per 10 minuti a 4 °C. Quindi raccogliere il surnatante con una pipetta e conservarlo a -80 °C per i saggi di TNF-α, IL-1β, IL-6 e PGE2^15,23,25.
   NOTA: La centrifugazione al punto 6.1 rende il BALF privo di cellule.
   1. Eseguire i saggi delle citochine su BALF cell-free utilizzando un kit ELISA commerciale secondo le istruzioni del produttore. Eseguire il test PGE2 utilizzando un kit di immunodosaggio enzimatico (EIA) seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).

7. Colorazione e conteggio del corpo lipidico

1. Fissare i leucociti sui vetrini di citospin utilizzando il 3,7% di formaldeide in soluzione salina tamponata di Hank libera da Ca 2+, Mg²⁺ (HBSS, pH 7,4) e colorare con l'1,5% di OsO₄ mentre è ancora umido³ (vedi Tabella dei materiali). Quindi, contare i corpi lipidici per cellula in 50 leucociti consecutivi da ciascun vetrino utilizzando la lente dell'obiettivo a immersione in olio del microscopio.

8. Analisi statistica

1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software grafici e statistici (vedi Tabella dei materiali). Esprimere i risultati come media ± SEM e analizzarli con Anova unidirezionale seguito da un Newman-Keuls-Student^{post-test 26}. Si considerino le differenze significative quando P < 0,05.

Risultati

In un polmone non leso, la clearance del liquido alveolare avviene mediante il trasporto di ioni attraverso lo strato epiteliale alveolare intatto. Il gradiente osmotico trasporta il fluido dagli alveoli all'interstizio polmonare, dove viene drenato dai vasi linfatici o riassorbito. Na/K-ATPasi guida questo trasporto¹¹. L'OA è un inibitore della Na/K-ATPasi²⁷ e del canale del sodio 21, che può contribuire alla formazione dell'edema, come abbiamo già suggerito

Discussione

La selezione del modello ARDS corretto è essenziale per condurre gli studi preclinici e il valutatore deve considerare tutte le possibili variabili, come l'età, il sesso, le modalità di somministrazione e altre⁶. Il modello scelto deve riprodurre la malattia sulla base di fattori di rischio quali sepsi, embolia lipidica, ischemia-riperfusione del sistema vascolare polmonare e altri rischi clinici¹⁴. Tuttavia, nessun modello animale utilizzato per l'ARDS può ricreare tut...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic vaporizer	SurgiVet	model 100
Braided slik thread with needle number 5	Shalon medical	N/A
Cabinet vivarium	Insight	Model EB273
Centrifuge	Eppendorf	5430/5430R
Cytofunnel	ThermoFisher	11-025-48
Drontal puppy	Bayer	N/A
Hank's balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4981
Heatpad	tkreprodução	TK-500
Hydrocloric Acid	Sigma-Aldrich	30721
Insulin syringe Ultrafine	BD	328322
Isoforine 1mL/mL	Cristália	N/A
Ketamine	Syntec	N/A
May-Grunwald-Giemsa	Sigma-Aldrich	205435
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23235
Microscope  PrimoStar	Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA	R&D system	DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA	R&D system	DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA	R&D system	DY410
Neubauer chamber improved bright-line	Global optics
Oleic Acid (99%)	Sigma-Aldrich	O1008
Osmium tetroxide solution (4%)	Sigma-Aldrich	75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G	BD Angiocath	388333
Prism 8 (graphic and statistic software)	Graphpad	N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal	Cayman Chemical	514010
Shandon Cytospin 3	ThermoFisher	N/A
Sodium hydroxide	Merck	1,06,49,81,000
Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice	ICTB/FIOCRUZ	N/A
Syringe 1 mL	BD	990189
Tris-base	Bio Rad	161-0719	Electrophoresis purity reagent
Türk's solution	Sigma-Aldrich	93770
Xilazine	Syntec	N/A