Mausmodell des Ölsäure-induzierten akuten Atemnotsyndroms

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Lungenverletzungsmodell bei Mäusen, bei dem Ölsäure verwendet wird, um das akute Atemnotsyndrom (ARDS) nachzuahmen. Dieses Modell erhöht die Entzündungsmediatoren auf Ödeme und verringert die Lungencompliance. Ölsäure wird in der Salzform (Oleat) verwendet, da diese physiologische Form das Risiko einer Embolie vermeidet.

Zusammenfassung

Das akute Atemnotsyndrom (ARDS) stellt eine erhebliche Bedrohung für kritisch kranke Patienten mit einer hohen Sterblichkeitsrate dar. Schadstoffbelastung, Zigarettenrauch, Infektionserreger und Fettsäuren können ARDS auslösen. Tiermodelle können den komplexen Pathomechanismus des ARDS nachahmen. Jeder von ihnen hat jedoch seine Grenzen. Bemerkenswert ist, dass Ölsäure (OA) bei kritisch kranken Patienten mit schädlichen Auswirkungen auf die Lunge erhöht ist. Arthrose kann Lungenschäden durch Embolien, Zerstörung des Gewebes, Veränderung des pH-Werts und Beeinträchtigung der Ödembeseitigung induzieren. Das OA-induzierte Lungenverletzungsmodell ähnelt verschiedenen Merkmalen des ARDS mit Endothelschädigung, erhöhter alveolärer Permeabilität, Entzündung, Membranhyalinbildung und Zelltod. Hier wird die Induktion einer Lungenschädigung beschrieben, indem OA (in Salzform) direkt in die Lunge und intravenös in eine Maus injiziert wird, da es sich um die physiologische Form von OA bei pH 7 handelt. Daher ist die Injektion von OA in Salzform ein hilfreiches Tiermodell, um Lungenverletzungen/ARDS zu untersuchen, ohne Embolien zu verursachen oder den pH-Wert zu verändern, und so nahe an das heranzukommen, was bei kritisch kranken Patienten passiert.

Einleitung

Ashbaugh et ^al.1 beschrieben erstmals 1967 das akute Atemnotsyndrom (ARDS) und haben seitdem mehrere Revisionen durchlaufen. Nach der Berliner Definition handelt es sich bei ARDS um eine Lungenentzündung, die aufgrund eines Ungleichgewichts im Verhältnis von Ventilation zu Perfusion, diffuser bilateraler alveolärer Schädigung (DAD) und Infiltrat, erhöhtem Lungengewicht und Ödemen zu einer akuten Ateminsuffizienz und Hypoxämie (PaO 2/FiO₂ > 300 mm Hg) ^führt. Das Lungenparenchym ist eine komplexe zelluläre Umgebung, die aus Epithel-, Endothel- und anderen Zellen besteht. Diese Zellen bilden Barrieren und Strukturen, die für den Gasaustausch und die Homöostase in den Alveolen verantwortlich^{sind 3}. Die am häufigsten vorkommenden Zellen innerhalb der Epithelbarriere sind alveoläre Typ-I-Zellen (AT1) mit einer größeren Oberfläche für den Gasaustausch und das Flüssigkeitsmanagement durch Na/K-ATPase. Außerdem produzieren die alveolären Typ-II-Zellen (AT2) Tensid, wodurch die Oberflächenspannung in den Alveolen reduziert^{wird 4}. Darunter bilden Endothelzellen eine semipermeable Barriere, die den Lungenkreislauf vom Interstitium trennt. Zu seinen Funktionen gehören die Erkennung von Reizen, die Koordination von Entzündungsreaktionen und die zelluläre Transmigration⁵. Die Endothelzellen regulieren auch den Gasaustausch, den Gefäßtonus und die Gerinnung⁵. Daher können Endothel- und Epithelfunktionsstörungen einen proinflammatorischen Phänotyp verschlimmern und Lungenschäden verursachen, die zu ARDS⁵ führen.

Die Entwicklung eines ARDS ist risikoassoziiert mit einer bakteriellen und viralen Lungenentzündung oder indirekten Faktoren wie nicht-pulmonaler Sepsis, Trauma, Bluttransfusionen und Pankreatitis⁶. Diese Bedingungen verursachen die Freisetzung von pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMPs) und schadensassoziierten molekularen Mustern (DAMPs), die proinflammatorische Zytokine und Chemokine wie TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-8⁵ induzieren. TNF-α ist mit dem Abbau von vaskulär-endothelialem Cadherin (VE-Cadherin) bei der Störung der endothelialen Barriere und der Leukozyteninfiltration in das Lungenparenchym verbunden. Neutrophile Granulozyten sind die ersten Zellen, die von IL-8 und LTB₄ ^5,7,8 angezogen werden. Neutrophile Granulozyten erhöhen die Bildung von proinflammatorischen Zytokinen, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)⁹ und neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs), die zusätzliche Endothel- und Epithelschäden verursachen¹⁰. Eine epitheliale Schädigung führt zu einer Entzündung und Aktivierung von Toll-like-Rezeptoren in AT2-Zellen und residenten Makrophagen, die die Freisetzung von Chemokinen induzieren, die Entzündungszellen in die Lunge locken⁴. Auch die Produktion von Zytokinen wie Interferon-β (INF_β) verursacht TNF-verwandte Apoptose-induzierende Rezeptoren (TRAIL), die ATII-Zellen zur Apoptose führen und die Flüssigkeits- und Ionenclarenz beeinträchtigen⁴. Die Störung der endothelialen und epithelialen Barrierestruktur ermöglicht den Einstrom von Flüssigkeit, Proteinen, roten Blutkörperchen und Leukozyten in den Alveolarraum, was zu Ödemen führt. Wenn sich ein Ödem etabliert hat, ist die pulmonale Anstrengung zur Aufrechterhaltung der Atmung und des Gasaustauschs verändert¹¹. Hyperkapnie und Hypoxämie induzieren den Zelltod und eine Störung des Natriumtransports, was das Alveolarödem aufgrund der schlechten Clearance-Kapazität verschlimmert¹⁰. ARDS weist auch erhöhte IL-17A-Spiegel auf, die mit Organfunktionsstörungen, einem erhöhten Prozentsatz alveolärer Neutrophilen und einer alveolären Permeabilität verbunden^{sind 9}.

In den letzten Jahren gab es kontinuierliche Fortschritte in der Forschung zur Pathophysiologie, Epidemiologie und Behandlung von ARDS^12,13. ARDS ist jedoch ein heterogenes Syndrom, trotz der Fortschritte in der therapeutischen Forschung, die zu einer Optimierung der mechanischen Beatmung und der Flüssigkeitstherapie führen. Daher ist nach wie vor eine wirksamere direkte pharmakologische Behandlung erforderlich¹⁰, und Tierversuche können dazu beitragen, ARDS-Mechanismen und -Ziele für die Intervention zu enthüllen.

Derzeitige ARDS-Modelle sind nicht in der Lage, die Pathologie vollständig zu replizieren. Daher wählen Forscher oft das Modell, das ihren Interessen besser entsprechen könnte. Zum Beispiel induziert das Lipopolysaccharid (LPS)-Induktionsmodell ARDS durch einen endotoxischen Schock, der hauptsächlich durch TLR4¹⁴ ausgelöst wird. Die HCl-Induktion ahmt die Säureaspiration nach, und die Schädigung ist neutrophil-abhängig¹⁴. Auf der anderen Seite induziert das derzeitige Natriumoleat-Modell eine Endothelschädigung, die die Gefäßpermeabilität und das Ödem erhöht. Darüber hinaus vermeidet die Verwendung von Natriumoleat anstelle von Ölsäure in flüssiger Form Embolierisiken und Veränderungen des Blut-pH-Werts¹⁵.

Tiermodelle für ARDS
Präklinische Studien in Tiermodellen helfen, die Pathologie zu verstehen und sind für die Erforschung neuer ARDS-Behandlungen unerlässlich. Das ideale Tiermodell muss Merkmale aufweisen, die der klinischen Situation ähneln, und eine gute Reproduzierbarkeit der Krankheitsmechanismen mit relevanten pathophysiologischen Merkmalen jedes Krankheitsstadiums, jeder Evolution und jeder Reparatur^{aufweisen 14}. Mehrere Tiermodelle werden verwendet, um eine akute Lungenschädigung bei ARDS präklinisch zu beurteilen. Da jedoch alle Modelle Einschränkungen aufweisen, reproduzieren sie die menschliche Pathologie nicht vollständig 6,14,16. Das Ölsäure-induzierte ARDS wird bei verschiedenen Tierarten eingesetzt¹⁷. Schweine¹⁸, Schafe¹⁹ und Hunde²⁰, die einer OA-Injektion unterzogen wurden, weisen zahlreiche klinische Merkmale der Erkrankung mit Dysfunktion der alveolären Kapillarmembran und erhöhter Permeabilität mit Protein- und Zellinfiltration auf.

Zum Beispiel blockierte die intravenös injizierte OA bei 1,25 μM den transepithelialen Transport, was zu einem Alveolarödem^{führte 15}. Im In-vitro-Modell mit A549-Zellen veränderte OA in einer Konzentration von 10 μM weder den epithelialen Natriumkanal (eNAC) noch die Expression der Na/K-ATPase. OA scheint jedoch mit beiden Kanälen zu assoziieren und ihre Aktivität direkt zu hemmen²¹. Die intravenöse Injektion von OA in einer Dosierung von 0,1 ml/kg verursachte eine Stauung und Schwellung des Lungengewebes, reduzierte Alveolarräume mit verdickten Alveolarsepten und erhöhte entzündliche und rote Blutkörperchenzahlen²². Außerdem induzierte OA Apoptose und Nekrose in Endothel- und Epithelzellen in der Lunge¹⁵. Die intratracheale Injektion einer Tris-Oleat-Lösung bei Mäusen verstärkte die Infiltration und das Ödem von Neutrophilen bereits 6 Stunden nach der Stimulation²³. Die OA-Injektion nach 24 Stunden erhöhte die proinflammatorischen Zytokinspiegel (d. h. TNF-α, IL-6 und IL-1β)²³. Darüber hinaus hemmt die intravenöse Injektion (orbitaler Plexus) von 10 μM eines Tris-Oleats die pulmonale Na/K-ATPase-Aktivität, ähnlich wie Ouabain bei ^10-3 μM, einem selektiven Enzyminhibitor. Außerdem induziert OA Entzündungen mit Zellinfiltration, Bildung von Lipidkörpern und Produktion von Leukotrien-B4 (LTB₄) und Prostaglandin E2 (PGE₂)^22,24. Daher erzeugt Ölsäure-induziertes ARDS Ödeme, Blutungen, Neutrophileninfiltration, erhöhte Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität und ROS²⁴. Daher ist die OA-Verabreichung ein etabliertes Modell für Lungenverletzungen^22,25. Alle in diesem Artikel vorgestellten Ergebnisse, die OA enthalten, repräsentieren die Salzform Natriumoleat.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Verfahren wurden von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren der Oswaldo-Cruz-Stiftung genehmigt (CEUA-Lizenzen Nr. 002-08, 36/10 und 054/2015). Für die Experimente wurden männliche Schweizer Webster-Mäuse mit einem Gewicht zwischen 20 und 30 g verwendet, die vom Institute of Science and Technology in Biomodels (ICTB) der Oswaldo-Cruz-Stiftung (FIOCRUZ) zur Verfügung gestellt wurden. Die Tiere wurden in belüfteten Isolatoren im Vivarium des Pavilhão Ozório de Almeida gehalten, Wasser und Futter standen ad libitum zur Verfügung. Sie wurden einem 12 h/12 h alten Hell-Dunkel-Zyklus ausgesetzt.

1. Herstellung einer Natriumoleatlösung

1. Verwenden Sie Ölsäure, um eine 100 mmol/l Natriumoleat-Stammlösung in einem sterilen Röhrchen oder Glaskolben herzustellen.
   HINWEIS: Für die vorliegende Arbeit wurde eine 50-ml-Lösung (Endvolumen) hergestellt, aber das Volumen muss je nach experimentellem Bedarf angepasst werden. Die Lösung muss immer in sterilen Röhrchen oder Glasbehältern zubereitet werden.
   1. Fügen Sie zunächst NaOH-Tabletten oder -Lösung in Reinstwasser hinzu, um den pH-Wert zu erhöhen. Ein pH-Wert von 12-13 wird für ein Volumen von 25 ml empfohlen.
      HINWEIS: Alternativ kann Tris-Base zur Herstellung der Tris-Oleat-Lösung verwendet werden.
   2. Die Ölsäure (siehe Materialtabelle) wird sehr langsam, Tropfen für Tropfen, unter ständigem Rühren in einem Ultraschallbad bei 37 °C zugegeben.
      HINWEIS: Wenn eine Ölsäureausfällung auftritt, beginnen Sie von vorne.
   3. Sobald die Ölsäure vollständig aufgelöst ist, stellen Sie den pH-Wert unter Rühren mit hochreinem verdünntem HCl Tropfen für Tropfen vorsichtig auf 7,4 ein und stellen Sie ihn dann auf das Endvolumen von 50 ml ein.
      HINWEIS: Bereiten Sie die Arbeitsoleatlösungen frisch vor. Alternativ kann die Lösung aliquotiert, gelagert und bei -20 °C in einer mit Stickstoff angereicherten Umgebung aufbewahrt werden, um eine Oxidation nicht länger als einen Monat zu vermeiden. Vermeiden Sie gefrorene und wieder eingefrorene Zyklen.

2. Induktion einer Lungenschädigung durch Ölsäure

1. Führen Sie die intratracheale Verabreichung von Ölsäure durch.
   1. Betäubung der Mäuse mit 5% Isofluran mit 2 l/min_O2 unter Verwendung eines veterinärmedizinischen Anästhesie-Verdampfers (Abbildung 1A). Entfernen Sie das Fell an der Einschnittsstelle mit Enthaarungscreme und desinfizieren Sie den Bereich mit drei abwechselnden Runden Betadin-Peeling und Alkohol mit steriler Gaze. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen zusammendrücken.
      HINWEIS: Verwenden Sie während des Eingriffs sterile Handschuhe und Instrumente. Verwenden Sie ein Tuch, um das Tier abzudecken und legen Sie nur die Einschnittsstelle frei. Führen Sie das Experiment in einer biologischen Sicherheitswerkbank durch, um zu vermeiden, dass Isofluoran in die Umwelt entweicht. Analgetika werden nicht verabreicht, da sie die Entzündungsreaktion hemmen können.
   2. Nach der Narkose legen Sie das Tier in eine dorsale Dekubitusposition und machen einen V-förmigen Schnitt (0,5-1 cm) auf Schilddrüsenhöhe. Verschieben Sie vorsichtig die Schilddrüse, um die Luftröhre freizulegen (Abbildung 1B), und injizieren Sie 50 μl der zubereiteten Oleatlösung (Schritt 1).
      HINWEIS: Die Mäuse wurden in zwei Gruppen mit jeweils acht Tieren aufgeteilt. Die Lungenverletzungsgruppe erhält Natrium-Oleat-Lösung in einer Menge von 25 mM (1,25 μmol), und die Kontrollgruppe erhält 50 μl sterile Kochsalzlösung durch Instillation in die Luftröhre jeder Maus mit einer Insulinspritze (Volumen 300 μl, 30 g) (Abbildung 1C).
   3. Vernähen Sie die Inzisionsstelle der Mäuse mit einem synthetischen, nicht resorbierbaren monofilen Nahtmaterial, führen Sie es in ihren Käfig zurück und überwachen Sie es bis zur vollständigen Genesung von der Operation. Halten Sie die Tiere während aller Eingriffe auf einem Heizkissen bei 37 °C.
      HINWEIS: Mäuse brauchen in der Regel bis zu 15 Minuten, um sich von der Operation zu erholen.
2. Führen Sie die intravenöse Verabreichung von Ölsäure durch.
   1. Nach der Anästhesie (Schritt 2.1.1, Abbildung 2A) intravenös in den Plexus orbitalis injizieren, indem die ultrafeine Nadel (siehe Materialtabelle) in den medialen Kanthus der Augenhöhle eingeführt wird (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Die Mäuse wurden in zwei Gruppen mit jeweils acht Tieren aufgeteilt. Jede Gruppe erhält 100 μl der Natrium-Oleat-Lösung mit 10 μmol OA pro Tier, während die Kontrollgruppe 100 μl sterile Kochsalzlösung erhält.
3. Überwachen Sie die Tiere nach der Operation täglich auf Nebenwirkungen. Humane Endpunkte für Euthanasie sind Nebenwirkungen, Krämpfe und Koma.

3. Sammlung von bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF)

1. Euthanasieren Sie die Mäuse mit einer intraperitonealen letalen Dosis von Ketamin (300 mg/kg) und Xylazin (30 mg/kg) (siehe Materialtabelle).
2. Legen Sie das Tier in die dorsale Dekubitusposition, machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt von ca. 1 cm im vorderen Bereich des Tieres, legen Sie die Luftröhre frei und machen Sie einen kleinen Schnitt, um einen intravenösen Katheter (20 g) einzuführen.
3. Schließen Sie den Katheter an eine sterile 1-ml-Spritze an, injizieren Sie langsam und schrittweise 0,5 ml sterile Kochsalzlösung in die Lunge und saugen Sie dann die Flüssigkeit aus dem BALF mit derselben Spritze ab. Wiederholen Sie es 3-5 Mal und geben Sie es in ein steriles Mikroröhrchen, das Sie in Eis legen.
   HINWEIS: Die Proben können bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.

4. Gesamt- und Differentialzellanalyse bei BALF

1. Für die Gesamtzellzahl werden 20 μl BALF in 180 μl (10-fache Verdünnung) Turk-Lösung verdünnt (siehe Materialtabelle). Führen Sie die Zählung mit einer Neubauer-Kammer unter einem optischen Mikroskop mit einem 40-fach-Objektiv durch.
2. Für die Differenzialzählung werden 100 μl BALF in den Zelltrichter mit den Objektträgern gegeben und bei 22,86 x g für 5 Minuten bei 4 °C in einer Zytozentrifuge zentrifugiert und mit May-Grunwald (15%, pH 7,2)-Giemsa (1:10) gefärbt (siehe Materialtabelle). Fahren Sie mit der Zellzählung in einem Lichtmikroskop mit Immersionsobjektiv fort.

5. Bestimmung des Gesamtproteins in BALF

1. Bestimmen Sie das gesamte BALF-Überstandsprotein mit einem handelsüblichen Proteinquantifizierungskit und lesen Sie die Absorption bei 562 nm mit einem Spektralphotometer gemäß den Anweisungen des Herstellers ab (siehe Materialtabelle).

6. Enzym-Immunosorbent-Assays

1. BALF bei 1.200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Dann wird der Überstand mit einer Pipette aufgefangen und bei -80 °C gelagert, um TNF-α, IL-1β, IL-6 und PGE2^15,23,25 zu testen.
   HINWEIS: Durch die Zentrifugation in Schritt 6.1 wird der BALF zellfrei.
   1. Führen Sie die Zytokin-Assays an zellfreiem BALF mit einem handelsüblichen ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Führen Sie den PGE2-Assay mit einem Enzymimmunoassay-Kit (EIA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (siehe Materialtabelle).

7. Färbung und Zählung von Lipidkörpern

1. Fixieren Sie die Leukozyten auf Cytospin-Objektträgern mit 3,7 % Formaldehyd in^Ca2+, Mg²⁺ freier gepufferter Hank's-Salzlösung (HBSS, pH 7,4) und färben Sie sie mit 1,5 % OsO₄, während sie noch feucht^{sind 3} (siehe Materialtabelle). Zählen Sie dann die Lipidkörper pro Zelle in 50 aufeinanderfolgenden Leukozyten von jedem Objektträger mit der Ölimmersionsobjektivlinse des Mikroskops.

8. Statistische Analyse

1. Führen Sie statistische Analysen mit Hilfe von Grafik- und Statistiksoftware durch (siehe Materialtabelle). Drücken Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± SEM aus und analysieren Sie sie mittels One-Way-Anova, gefolgt von einem Newman-Keuls-Student²⁶ nach dem Test. Betrachten Sie die Unterschiede, die signifikant sind, wenn P 0,05 <.

Ergebnisse

In einer unverletzten Lunge erfolgt die Clearance der Alveolarflüssigkeit durch den Transport von Ionen durch die intakte Alveolarepithelschicht. Der osmotische Gradient transportiert Flüssigkeit aus den Lungenbläschen in das pulmonale Interstitium, wo sie von Lymphgefäßen abgeleitet oder resorbiert wird. Na/K-ATPase steuert diesen Transport¹¹. OA ist ein Inhibitor der Na/K-ATPase²⁷ und des Natriumkanals²¹, der, wie wir bereits vorgeschlagen hab...

Diskussion

Die Auswahl des richtigen ARDS-Modells ist für die Durchführung der präklinischen Studien von entscheidender Bedeutung, und der Bewerter muss alle möglichen Variablen wie Alter, Geschlecht, Verabreichungsmethoden und andere berücksichtigen⁶. Das gewählte Modell muss die Erkrankung auf der Grundlage von Risikofaktoren wie Sepsis, Lipidembolie, Ischämie-Reperfusion des Lungengefäßsystems und anderen klinischen Risiken reproduzieren¹⁴. Allerdings kann kein Tiermodell,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic vaporizer	SurgiVet	model 100
Braided slik thread with needle number 5	Shalon medical	N/A
Cabinet vivarium	Insight	Model EB273
Centrifuge	Eppendorf	5430/5430R
Cytofunnel	ThermoFisher	11-025-48
Drontal puppy	Bayer	N/A
Hank's balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4981
Heatpad	tkreprodução	TK-500
Hydrocloric Acid	Sigma-Aldrich	30721
Insulin syringe Ultrafine	BD	328322
Isoforine 1mL/mL	Cristália	N/A
Ketamine	Syntec	N/A
May-Grunwald-Giemsa	Sigma-Aldrich	205435
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23235
Microscope  PrimoStar	Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA	R&D system	DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA	R&D system	DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA	R&D system	DY410
Neubauer chamber improved bright-line	Global optics
Oleic Acid (99%)	Sigma-Aldrich	O1008
Osmium tetroxide solution (4%)	Sigma-Aldrich	75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G	BD Angiocath	388333
Prism 8 (graphic and statistic software)	Graphpad	N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal	Cayman Chemical	514010
Shandon Cytospin 3	ThermoFisher	N/A
Sodium hydroxide	Merck	1,06,49,81,000
Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice	ICTB/FIOCRUZ	N/A
Syringe 1 mL	BD	990189
Tris-base	Bio Rad	161-0719	Electrophoresis purity reagent
Türk's solution	Sigma-Aldrich	93770
Xilazine	Syntec	N/A