Modèle murin du syndrome de détresse respiratoire aiguë induit par l’acide oléique

Résumé

Le présent protocole décrit un modèle de lésion pulmonaire chez la souris utilisant de l’acide oléique pour imiter le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Ce modèle augmente les médiateurs inflammatoires de l’œdème et diminue la compliance pulmonaire. L’acide oléique est utilisé sous forme de sel (oléate) car cette forme physiologique évite le risque d’embolie.

Résumé

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est une menace importante pour les patients gravement malades avec un taux de mortalité élevé. L’exposition aux polluants, à la fumée de cigarette, aux agents infectieux et aux acides gras peut induire le SDRA. Les modèles animaux peuvent imiter le mécanisme pathologique complexe du SDRA. Cependant, chacun d’entre eux a des limites. Notamment, l’acide oléique (OA) est augmenté chez les patients gravement malades avec des effets nocifs sur les poumons. L’arthrose peut induire des lésions pulmonaires par embolie, perturbant les tissus, modifiant le pH et altérant la clairance de l’œdème. Le modèle de lésion pulmonaire induite par l’arthrose ressemble à diverses caractéristiques du SDRA avec des lésions endothéliales, une perméabilité alvéolaire accrue, une inflammation, la formation d’hyalines membranaires et la mort cellulaire. Dans ce document, l’induction d’une lésion pulmonaire est décrite par injection d’arthrose (sous forme de sel) directement dans le poumon et par voie intraveineuse chez une souris, car il s’agit de la forme physiologique de l’arthrose à pH 7. Ainsi, l’injection d’arthrose sous forme de sel est un modèle animal utile pour étudier les lésions pulmonaires/SDRA sans provoquer d’emboles ni modifier le pH, se rapprochant ainsi de ce qui se passe chez les patients gravement malades.

Introduction

Ashbaugh et ^al.1, en 1967, ont décrit pour la première fois le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) et depuis lors, ils ont fait l’objet de multiples révisions. Selon la définition de Berlin, le SDRA est une inflammation pulmonaire qui entraîne une insuffisance respiratoire aiguë et une hypoxémie (PaO 2/FiO 2 > 300 mm Hg) en raison d’un déséquilibre du rapport ventilation/perfusion, d’une lésion alvéolaire bilatérale diffuse (DAD) et d’un infiltrat, d’une augmentation du poids pulmonaire et d’un œdème ^2,3. Le parenchyme pulmonaire est un environnement cellulaire complexe composé de cellules épithéliales, endothéliales et autres. Ces cellules forment des barrières et des structures responsables des échanges gazeux et de l’homéostasie dans les alvéoles³. Les cellules les plus abondantes au sein de la barrière épithéliale sont les cellules alvéolaires de type I (AT1) avec une plus grande surface pour l’échange gazeux et la gestion des fluides par Na/K-ATPase. De plus, les cellules alvéolaires de type II (AT2) produisent un tensioactif, ce qui réduit la tension superficielle dans les alvéoles⁴. En dessous, les cellules endothéliales forment une barrière semi-perméable séparant la circulation pulmonaire de l’interstitium. Ses fonctions comprennent la détection des stimuli, la coordination des réponses inflammatoires et la transmigration cellulaire⁵. Les cellules endothéliales régulent également les échanges gazeux, le tonus vasculaire et la coagulation⁵. Par conséquent, les troubles de la fonction endothéliale et épithéliale peuvent exacerber un phénotype pro-inflammatoire, causant des lésions pulmonaires conduisant au SDRA⁵.

Le développement du SDRA est associé à un risque de pneumonie bactérienne et virale ou à des facteurs indirects tels que la septicémie non pulmonaire, les traumatismes, les transfusions sanguines et la pancréatite⁶. Ces conditions provoquent la libération de motifs moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) et de motifs moléculaires associés aux dommages (DAMP), induisant des cytokines et des chimiokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α, l’IL-1β, l’IL-6 et l’IL-8⁵. Le TNF-α est lié à la dégradation de la cadhérine endothéliale vasculaire (VE-cadhérine) dans la perturbation de la barrière endothéliale et l’infiltration des leucocytes dans le parenchyme pulmonaire. Les neutrophiles sont les premières cellules à migrer, attirées par l’IL-8 et LTB₄ ^5,7,8. Les neutrophiles augmentent encore les cytokines pro-inflammatoires, les espèces réactives de l’oxygène (ROS)⁹ et la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), générant des dommages endothéliaux et épithéliaux supplémentaires¹⁰. Les lésions épithéliales provoquent l’inflammation et l’activation des récepteurs de type Toll dans les cellules AT2 et les macrophages résidents, induisant la libération de chimiokines attirant les cellules inflammatoires vers les poumons⁴. De plus, la production de cytokines comme l’interféron-β (INF_β) provoque des récepteurs inducteurs d’apoptose liés au TNF (TRAIL), conduisant les cellules ATII à l’apoptose, altérant le liquide et la clarté ionique⁴. La perturbation de la structure de la barrière endothéliale et épithéliale permet l’afflux de liquide, de protéines, de globules rouges et de leucocytes dans l’espace alvéolaire, provoquant un œdème. Une fois l’œdème établi, l’effort pulmonaire pour maintenir la respiration et les échanges gazeux sont altérés¹¹. L’hypercapnie et l’hypoxémie induisent la mort cellulaire et la perturbation du transport du sodium, aggravant l’œdème alvéolaire dû à une faible capacité de clairance¹⁰. Le SDRA présente également des taux élevés d’IL-17A, associés à un dysfonctionnement des organes, à une augmentation du pourcentage de neutrophiles alvéolaires et à une perméabilité alvéolaire⁹.

Il y a eu des progrès continus dans la recherche sur la physiopathologie, l’épidémiologie et le traitement du SDRA au cours des dernières années^12,13. Cependant, le SDRA est un syndrome hétérogène malgré les progrès de la recherche thérapeutique aboutissant à l’optimisation de la ventilation mécanique et de la fluidothérapie. Ainsi, un traitement pharmacologique direct plus efficace est encore nécessaire¹⁰, et les études animales peuvent aider à dévoiler les mécanismes du SDRA et les cibles d’intervention.

Les modèles actuels de SDRA ne sont pas en mesure de reproduire complètement la pathologie. Ainsi, les chercheurs choisissent souvent le modèle qui pourrait le mieux correspondre à leurs intérêts. Par exemple, le modèle d’induction des lipopolysaccharides (LPS) induit le SDRA par choc endotoxique déclenché principalement par TLR4¹⁴. L’induction de HCl imite l’aspiration de l’acide, et les dommages sont neutrophies¹⁴. D’autre part, le modèle actuel d’oléate de sodium induit des lésions endothéliales qui augmentent la perméabilité vasculaire et l’œdème. De plus, l’utilisation d’oléate de sodium au lieu de l’acide oléique sous forme liquide permet d’éviter les risques d’embolie et d’altération du pH sanguin¹⁵.

Modèles d’animaux pour le SDRA
Les études précliniques sur des modèles animaux aident à comprendre la pathologie et sont essentielles pour la recherche sur les nouveaux traitements du SDRA. Le modèle animal idéal doit présenter des caractéristiques ressemblant à la situation clinique et une bonne reproductibilité des mécanismes de la maladie avec des caractéristiques physiopathologiques pertinentes pour chaque stade, évolution et réparation de la maladie¹⁴. Plusieurs modèles animaux sont utilisés pour évaluer les lésions pulmonaires aiguës dans le SDRA de manière préclinique. Cependant, comme tous les modèles ont des limites, ils ne reproduisent pas entièrement la pathologie humaine 6,14,16. Le SDRA induit par l’acide oléique est utilisé chez différentes espèces animales¹⁷. Les porcs¹⁸, les moutons¹⁹ et les chiens²⁰ soumis à l’injection d’arthrose présentent de nombreuses caractéristiques cliniques de la maladie avec un dysfonctionnement de la membrane alvéolaire-capillaire et une perméabilité accrue avec l’infiltration des protéines et des cellules.

Par exemple, l’arthrose à 1,25 μM injectée par voie intraveineuse a bloqué le transport transépithélial, ce qui a conduit à un œdème alvéolaire¹⁵. Alternativement, dans le modèle in vitro utilisant des cellules A549, l’arthrose à une concentration de 10 μM n’a pas modifié le canal sodique épithélial (eNAC) ou l’expression de la Na/K-ATPase. Cependant, l’arthrose semble s’associer aux deux canaux, inhibant directement leur activité²¹. L’injection intraveineuse d’arthrose à raison de 0,1 mL/kg a provoqué une congestion et un gonflement des tissus pulmonaires, une réduction des espaces alvéolaires avec un épaississement des cloisons alvéolaires et une augmentation du nombre de globules inflammatoires et de globules rouges²². De plus, l’arthrose induit l’apoptose et la nécrose dans les cellules endothéliales et épithéliales du poumon¹⁵. L’injection d’une solution de tris-oléate, par voie intratrachéale chez la souris, a favorisé l’infiltration des neutrophiles et l’œdème dès 6 h après la stimulation²³. L’injection d’arthrose à 24 h a augmenté les taux de cytokines pro-inflammatoires (c’est-à-dire le TNF-α, l’IL-6 et l’IL-1β)²³. De plus, l’injection intraveineuse (plexus orbitaire) de 10 μM d’un tris-oléate inhibe l’activité pulmonaire de la Na/K-ATPase, similaire à celle de l’ouabaïne à ^10-3 μM, un inhibiteur enzymatique sélectif. De plus, l’arthrose induit une inflammation avec infiltration cellulaire, formation de corps lipidiques et production de leucotriène B4 (LTB₄) et de prostaglandine E2 (PGE₂)^22,24. Par conséquent, le SDRA induit par l’acide oléique génère un œdème, une hémorragie, une infiltration de neutrophiles, une augmentation de l’activité myéloperoxydase (MPO) et des ROS²⁴. Par conséquent, l’administration d’arthrose est un modèle bien établi pour les lésions pulmonaires^22,25. Tous les résultats présentés dans cet article qui contiennent de l’arthrose représentent la forme saline, l’oléate de sodium.

Protocole

Les procédures utilisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique sur l’utilisation des animaux de la Fondation Oswaldo Cruz (licences CEUA n°002-08, 36/10 et 054/2015). Des souris Webster suisses mâles pesant entre 20 et 30 g, fournies par l’Institut des sciences et de la technologie des biomodèles (ICTB) de la Fondation Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), ont été utilisées pour les expériences. Les animaux étaient gardés dans des isolateurs ventilés dans le vivarium du Pavilhão Ozório de Almeida, et de l’eau et de la nourriture étaient disponibles ad libitum. Ils ont été exposés à un cycle de lumière et d’obscurité de 12 h/12 h.

1. Préparation d’une solution d’oléate de sodium

1. Utiliser de l’acide oléique pour préparer une solution mère d’oléate de sodium de 100 mmol/L dans un tube stérile ou une fiole en verre.
   NOTA : Une solution de 50 mL (volume final) a été préparée pour le présent travail, mais le volume doit être ajusté en fonction des besoins expérimentaux. La solution doit toujours être préparée dans des tubes stériles ou des récipients en verre.
   1. Tout d’abord, ajoutez des comprimés ou une solution de NaOH dans de l’eau ultra-pure pour élever le pH. Un pH de 12-13 est recommandé pour un volume de 25 mL.
      REMARQUE : Alternativement, la base Tris peut être utilisée pour préparer la solution de tris-oléate.
   2. Ajouter l’acide oléique (voir tableau des matériaux) très lentement, goutte à goutte, sous agitation constante dans un bain à ultrasons à 37 °C.
      REMARQUE : Si une précipitation d’acide oléique se produit, recommencez depuis le début.
   3. Une fois que l’acide oléique est complètement dissous, ajustez soigneusement le pH à 7,4, goutte à goutte sous agitation, avec du HCl dilué ultra-pur, puis ajustez au volume final de 50 ml.
      REMARQUE : Préparez fraîchement les solutions d’oléate de travail. Alternativement, la solution peut être aliquote, stockée et maintenue à -20 °C dans un environnement enrichi en azote pour éviter l’oxydation pendant un mois maximum. Évitez les cycles de congélation-recongélation.

2. Induction d’une lésion pulmonaire par l’acide oléique

1. Effectuer l’administration intratrachéale d’acide oléique.
   1. Anesthésier les souris à l’aide d’isoflurane à 5 % avec 2 L/min_d’O2 à l’aide d’un vaporisateur anesthésique vétérinaire (Figure 1A). Retirez la fourrure au niveau de la zone d’incision avec de la crème dépilatoire et désinfectez la zone avec trois cycles alternés de gommage à la bétadine et d’alcool à l’aide d’une gaze stérile. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par pincement des orteils.
      REMARQUE : Utilisez des gants et des instruments stériles pendant la procédure. Utilisez un champ pour couvrir l’animal et n’exposer que le site d’incision. Réaliser l’expérience dans une enceinte de sécurité biologique pour éviter que l’isofluorane ne s’échappe dans l’environnement. Les analgésiques ne sont pas administrés car ils peuvent inhiber la réponse inflammatoire.
   2. Après l’anesthésie, allongez l’animal en position de décubitus dorsal et faites une incision (0,5 à 1 cm) en forme de V au niveau de la thyroïde. Déplacez doucement la thyroïde pour exposer la trachée (Figure 1B) et injectez 50 μL de la solution d’oléate préparée (étape 1).
      REMARQUE : Les souris ont été divisées en deux groupes, avec huit animaux dans chaque groupe. Le groupe lésionné pulmonaire reçoit une solution d’oléate de sodium à 25 mM (1,25 μmol) et le groupe témoin reçoit 50 μL de solution saline stérile par instillation dans la trachée de chaque souris à l’aide d’une seringue à insuline (volume 300 μL, 30 G) (Figure 1C).
   3. Suturez le site d’incision des souris avec une suture synthétique non résorbable, remettez-la dans leur cage et surveillez-la jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement de la chirurgie. Pendant toutes les procédures, maintenez les animaux sur un coussin chauffant à 37 °C.
      REMARQUE : Les souris prennent généralement jusqu’à 15 minutes pour se remettre de la chirurgie.
2. Effectuer l’administration intraveineuse d’acide oléique.
   1. Après l’anesthésie (étape 2.1.1, Figure 2A), injecter par voie intraveineuse dans le plexus orbitaire en insérant l’aiguille ultrafine (voir Tableau des matériaux) dans le canthus médial de l’orbite (Figure 2B).
      REMARQUE : Les souris ont été divisées en deux groupes, avec huit animaux dans chaque groupe. Chaque groupe reçoit 100 μL de solution d’oléate de sodium à raison de 10 μmol d’OA par animal, tandis que le groupe témoin reçoit 100 μL de solution saline stérile.
3. Après l’opération, surveillez quotidiennement les animaux pour détecter tout effet indésirable. Les critères d’évaluation humains de l’euthanasie comprennent les effets indésirables, les convulsions et le coma.

3. Collecte de liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF)

1. Euthanasier les souris avec une dose létale intrapéritonéale de kétamine (300 mg/kg) et de xylazine (30 mg/kg) (voir le tableau des matériaux).
2. Posez l’animal en position de décubitus dorsal, faites une incision d’environ 1 cm avec des ciseaux chirurgicaux dans la région antérieure de l’animal, exposez la trachée et faites une petite incision pour introduire un cathéter intraveineux (20 G).
3. Connectez le cathéter à une seringue stérile de 1 ml, injectez lentement et progressivement 0,5 mL de solution saline stérile dans les poumons, puis aspirez le liquide du BALF avec la même seringue. Répétez-le 3 à 5 fois et transférez-le dans un microtube stérile, en les plaçant dans de la glace.
   REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés à -20 °C jusqu’à 6 mois.

4. Analyse des cellules totales et différentielles dans le BALF

1. Pour le nombre total de cellules, diluer 20 μL de BALF dans 180 μL (dilution 10x) de solution de Turk (voir le tableau des matériaux). Effectuez le comptage à l’aide d’une chambre Neubauer sous un microscope optique avec un objectif 40x.
2. Pour la numération différentielle, mettre 100 μL de BALF dans l’entonnoir cellulaire contenant les lames et le centrifuger à 22,86 x g pendant 5 min à 4 °C dans un cytocentrifugeuse, et colorer avec May-Grunwald (15%, pH 7,2)-Giemsa (1 :10) (voir Table des matériaux). Procéder à la numération cellulaire dans un microscope optique avec objectif d’immersion.

5. Détermination de la teneur totale en protéines dans le BALF

1. Déterminer la protéine surnageante totale de BALF à l’aide d’une trousse de quantification des protéines commerciale et lire l’absorbance à 562 nm à l’aide d’un spectrophotomètre en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).

6. Dosages immuno-enzymatiques

1. Centrifuger BALF à 1 200 x g pendant 10 min à 4 °C. Ensuite, prélever le surnageant à l’aide d’une pipette et le conserver à -80 °C pour les dosages de TNF-α, IL-1β, IL-6 et PGE2^15,23,25.
   REMARQUE : La centrifugation de l’étape 6.1 rend le BALF sans cellules.
   1. Effectuer les dosages de cytokines sur du BALF acellulaire à l’aide d’un kit ELISA commercial selon les instructions du fabricant. Effectuez le test PGE2 à l’aide d’un kit d’immunodosage enzymatique (EIA) en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).

7. Coloration et comptage des lipides corporels

1. Fixez les leucocytes sur des lames de cytospin en utilisant 3,7 % de formaldéhyde dans une solution saline tamponnée de Hank’s libre de Ca 2+, Mg²⁺ (HBSS, pH 7,4) et colorez avec 1,5 % d’OsO₄ alors qu’elles sont encore humides³ (voir le tableau des matériaux). Ensuite, comptez les corps lipidiques par cellule dans 50 leucocytes consécutifs de chaque lame à l’aide de la lentille de l’objectif à immersion dans l’huile du microscope.

8. Analyse statistique

1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et de statistiques (voir le tableau des matériaux). Exprimez les résultats sous forme de moyenne ± SEM et analysez-les par anova unidirectionnelle suivie d’un post-test Newman-Keuls-Student²⁶. Considérez les différences significatives lorsque P < 0,05.

Résultats

Dans un poumon non blessé, la clairance du liquide alvéolaire se produit par le transport d’ions à travers la couche épithéliale alvéolaire intacte. Le gradient osmotique transporte le liquide des alvéoles vers l’interstitium pulmonaire, où il est drainé par les vaisseaux lymphatiques ou réabsorbé. La Na/K-ATPase pilote ce transport¹¹. L’arthrose est un inhibiteur de la Na/K-ATPase²⁷ et du canal sodique 21, ce qui peut contribuer à la formation d’œdème...

Discussion

La sélection du bon modèle de SDRA est essentielle pour mener à bien les études précliniques, et l’évaluateur doit tenir compte de toutes les variables possibles, telles que l’âge, le sexe, les méthodes d’administration et autres⁶. Le modèle choisi doit reproduire la maladie en fonction des facteurs de risque tels que la septicémie, l’embolie lipidique, l’ischémie-reperfusion du système vasculaire pulmonaire et d’autres risques cliniques¹⁴. Cependant...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic vaporizer	SurgiVet	model 100
Braided slik thread with needle number 5	Shalon medical	N/A
Cabinet vivarium	Insight	Model EB273
Centrifuge	Eppendorf	5430/5430R
Cytofunnel	ThermoFisher	11-025-48
Drontal puppy	Bayer	N/A
Hank's balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4981
Heatpad	tkreprodução	TK-500
Hydrocloric Acid	Sigma-Aldrich	30721
Insulin syringe Ultrafine	BD	328322
Isoforine 1mL/mL	Cristália	N/A
Ketamine	Syntec	N/A
May-Grunwald-Giemsa	Sigma-Aldrich	205435
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23235
Microscope  PrimoStar	Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA	R&D system	DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA	R&D system	DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA	R&D system	DY410
Neubauer chamber improved bright-line	Global optics
Oleic Acid (99%)	Sigma-Aldrich	O1008
Osmium tetroxide solution (4%)	Sigma-Aldrich	75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G	BD Angiocath	388333
Prism 8 (graphic and statistic software)	Graphpad	N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal	Cayman Chemical	514010
Shandon Cytospin 3	ThermoFisher	N/A
Sodium hydroxide	Merck	1,06,49,81,000
Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice	ICTB/FIOCRUZ	N/A
Syringe 1 mL	BD	990189
Tris-base	Bio Rad	161-0719	Electrophoresis purity reagent
Türk's solution	Sigma-Aldrich	93770
Xilazine	Syntec	N/A