올레산 유도 급성 호흡곤란 증후군의 마우스 모델

요약

본 프로토콜은 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 모방하기 위해 올레산을 사용하는 마우스의 폐 손상 모델을 설명합니다. 이 모델은 부종에 대한 염증 매개체를 증가시키고 폐 순응도를 감소시킵니다. 올레산은 소금 형태(올레산염)로 사용되는데, 이 생리학적 형태가 색전증의 위험을 피하기 때문입니다.

초록

급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 치사율이 높은 중환자에게 심각한 위협이 됩니다. 오염 물질 노출, 담배 연기, 감염원, 지방산 등이 ARDS를 유발할 수 있습니다. 동물 모델은 ARDS의 복잡한 병리기전을 모방할 수 있습니다. 그러나 각각에는 한계가 있습니다. 특히 올레산(OA)은 중증 환자에서 증가하여 폐에 해로운 영향을 미칩니다. 골관절염은 색전, 조직 파괴, pH 변화, 부종 제거 손상 등을 통해 폐 손상을 유발할 수 있습니다. OA 유발 폐 손상 모델은 내피 손상, 폐포 투과성 증가, 염증, 막 유리질 형성 및 세포 사멸을 동반한 ARDS의 다양한 특징과 유사합니다. 본원에서, 폐 손상의 유도는 pH 7에서 OA의 생리학적 형태이기 때문에 OA(염 형태)를 폐에 직접 주입하고 마우스에 정맥 주사함으로써 설명된다. 따라서 소금 형태의 OA 주입은 색전을 유발하거나 pH를 변경하지 않고 폐 손상/ARDS를 연구하는 데 유용한 동물 모델이며, 이를 통해 중증 환자에서 일어나는 일에 근접할 수 있습니다.

서문

Ashbaugh et ^al.1은 1967년에 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 처음 기술했으며 그 이후로 여러 차례 개정되었습니다. 베를린의 정의에 따르면, ARDS는 환기 대 관류 비율의 불균형, 미만성 양측 폐포 손상(DAD) 및 침윤, 폐 무게 증가, 부종 ^2,3으로 인해 급성 호흡 부전 및 저산소혈증(PaO2/_FiO2 > 300mmHg)을 유발하는 폐 염증입니다. 폐 실질은 상피, 내피 및 기타 세포가 복합된 복잡한 세포 환경입니다. 이 세포들은 허파꽈리에서 가스 교환과 항상성을 담당하는 장벽과 구조를 형성한다³. 상피 장벽 내에서 가장 풍부한 세포는 Na/K-ATPase를 통한 가스 교환 및 체액 관리를 위한 더 큰 표면적을 가진 폐포 유형 I 세포(AT1)입니다. 또한, 폐포 II형 세포(AT2)는 계면활성제를 생산하여 허파꽈리의 표면장력을 감소시킨다⁴. 그 아래에는 내피 세포가 반투과성 장벽을 형성하여 폐 순환과 간질을 분리합니다. 그 기능에는 자극 감지, 염증 반응 조정, 세포 이동이 포함됩니다⁵. 내피세포는 또한 가스 교환, 혈관 긴장도, 응고를 조절한다⁵. 따라서 내피 및 상피 기능 장애는 전염증성 표현형을 악화시켜 폐 손상을 일으켜 ARDS를 유발할 수^{있다 5}.

ARDS의 발병은 세균성 및 바이러스성 폐렴 또는 비폐패혈증, 외상, 수혈, 췌장염과 같은 간접적인 요인과 관련이 있다⁶. 이러한 조건은 병원체 관련 분자 패턴(PAMP) 및 손상 관련 분자 패턴(DAMP)의 방출을 유발하여 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-8과 같은 전염증성 사이토카인 및 케모카인을 유도합니다⁵. TNF-α는 내피 장벽 파괴 및 폐 실질로의 백혈구 침윤에서 혈관-내피 카데린(VE-cadherin) 분해와 관련이 있습니다. 호중구는 IL-8 및 LTB₄ ^5,7,8에 의해 유도되어 이동하는 첫 번째 세포입니다. 호중구는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine), 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)⁹ 및 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular trap, NET) 형성을 증가시켜 추가적인 내피 및 상피 손상을 발생시킨다¹⁰. 상피 손상은 AT2 세포와 상주 대식세포에서 염증과 톨 유사 수용체의 활성화를 촉진하여 염증 세포를 폐로 끌어들이는 케모카인의 방출을 유도한다⁴. 또한 인터페론-β(INF_β)과 같은 사이토카인의 생성은 TNF 관련 세포사멸 유도 수용체(TRAIL)를 유발하여 ATII 세포를 세포사멸로 유도하여 체액 및 이온 클라렌스를 손상시킵니다⁴. 내피 및 상피 장벽 구조의 파괴로 인해 체액, 단백질, 적혈구 및 백혈구가 폐포 공간으로 유입되어 부종을 유발합니다. 부종이 생기면 호흡과 가스 교환을 유지하려는 폐의 노력이 바뀐다¹¹. 고탄산혈증과 저산소혈증은 세포 사멸과 나트륨 수송 장애를 유발하여 불량한 제거 능력으로 인한 폐포 부종을 악화시킨다¹⁰. ARDS는 또한 장기 기능 장애, 폐포 호중구 비율 증가, 폐포 투과성과 관련된 IL-17A 수치 상승을 나타낸다⁹.

최근 몇 년 동안 ARDS의 병태생리학, 역학 및 치료에 대한 연구가 지속적으로 발전하고 있습니다^12,13. 그러나 ARDS는 기계적 환기 및 수액 치료 최적화를 초래하는 치료 연구의 진전에도 불구하고 이질적인 증후군입니다. 따라서 보다 효과적인 직접 약물 치료가 여전히 필요하며¹⁰ 동물 연구는 ARDS 메커니즘과 중재 대상을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.

현재의 ARDS 모델은 병리학을 완전히 복제할 수 없습니다. 따라서 연구자들은 종종 자신의 관심사에 더 잘 맞을 수 있는 모델을 선택합니다. 예를 들어, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 유도 모델은 주로 TLR4에 의해 유발되는 내독성 쇼크에 의해 ARDS를 유도한다¹⁴. HCl 유도는 산 흡인을 모방하며, 손상은 호중구에 의존한다¹⁴. 한편, 현재의 올레산나트륨 모델은 혈관 투과성과 부종을 증가시키는 내피 손상을 유발합니다. 또한 액체 형태의 올레산 대신 올레산 나트륨을 사용하면 색전증 위험과 혈액 pH¹⁵의 변화를 피할 수 있습니다.

ARDS용 동물 모델
동물 모델을 이용한 전임상 연구는 병리학을 이해하는 데 도움이 되며 새로운 ARDS 치료 연구에 필수적입니다. 이상적인 동물모델은 임상적 상황과 유사한 특성과 각 질병 단계, 진화 및 복구의 관련 병태생리학적 특징과 함께 질병 기전의 우수한 재현성을 가져야 한다¹⁴. ARDS의 급성 폐 손상을 전임상적으로 평가하기 위해 여러 동물 모델이 사용됩니다. 그러나 모든 모델에는 한계가 있기 때문에 인간 병리학 6,14,16을 완전히 재현하지는 못한다. 올레산-유도 ARDS는 다른 동물 종에서 사용된다¹⁷. 골관절염 주사를 맞은 돼지¹⁸, 양¹⁹, 개²⁰은 폐포-모세혈관막 기능 장애, 단백질 및 세포 침윤으로 인한 투과성 증가 등 질병의 다양한 임상적 특징을 나타낸다.

예를 들어, 1.25μM의 OA를 정맥 주사하면 경상피 수송이 차단되어 폐포 부종이^{발생한다 15}. 대안적으로, A549 세포를 사용한 시험관 내 모델에서, 10μM 농도의 OA는 상피 나트륨 채널(eNAC) 또는 Na/K-ATPase의 발현을 변화시키지 않았다. 그러나, OA는 두 채널 모두와 연관되어 그들의 활동을 직접적으로 억제하는 것으로 보인다²¹. 0.1mL/kg의 OA 정맥 주사는 폐 조직의 울혈과 부종을 유발하고, 폐포 중격이 두꺼워지면서 폐포 공간이 줄어들고, 염증성 및 적혈구 수가 증가했다²². 또한, OA는 폐의 내피 및 상피 세포에서 세포 사멸과 괴사를 유도했다¹⁵. 생쥐에서 기관내로 트리스-올레이트 용액을 주입하면 자극 후 6시간 이내에 호중구 침윤 및 부종이 증가한다²³. 24시간 OA 주사는 전염증성 사이토카인 수치(즉, TNF-α, IL-6 및 IL-1β)를 증가시켰습니다²³. 또한 트리스-올레에이트 10μM의 정맥 주사(안와신경총)는 선택적 효소 억제제인 10-3μM의 우아바인과 유사한 폐 Na/^K-ATPase 활성을 억제합니다. 또한 OA는 세포 침투, 지질체 형성, 류코트리엔 B4(LTB₄) 및 프로스타글란딘 E2(PGE₂)의 생성으로 염증을 유발합니다.^22,24. 따라서 올레산 유도 ARDS는 부종, 출혈, 호중구 침윤, 골수화효소(MPO) 활성 증가 및 ROS²⁴를 생성합니다. 따라서 OA 투여는 폐 손상에 대한 잘 확립된 모델입니다^22,25. OA가 있는 이 기사에 제시된 모든 결과는 소금 형태인 올레산나트륨을 나타냅니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 절차는 Oswaldo Cruz Foundation의 동물 사용에 관한 윤리 위원회(CEUA 라이선스 n°002-08, 36/10 및 054/2015)의 승인을 받았습니다. 오스왈도 크루즈 재단(FIOCRUZ)의 생체모델 과학기술연구소(ICTB)에서 제공한 20-30g 무게의 수컷 스위스 웹스터 마우스를 실험에 사용했다. 동물들은 Pavilhão Ozório de Almeida의 vivarium에 있는 환기가 잘 되는 격리 장치에 보관되었으며 물과 음식은 즉시 사용할 수 있었습니다. 그들은 12시간/12시간의 빛과 어둠 주기에 노출되었습니다.

1. 올레산 나트륨 용액의 제조

1. 올레산을 사용하여 멸균 튜브 또는 유리 플라스크에 100mmol/L의 올레산나트륨 원액을 준비합니다.
   참고: 본 작업을 위해 50mL(최종 부피) 용액을 준비했지만 실험적 필요에 따라 부피를 조정해야 합니다. 용액은 항상 멸균 튜브 또는 유리 용기에 준비해야 합니다.
   1. 먼저 초순수에 NaOH 정제 또는 용액을 첨가하여 pH를 높입니다. 25mL 용량에 대해 12-13의 pH 값이 권장됩니다.
      알림: 또는 Tris 베이스를 사용하여 Tris-oleate 용액을 준비할 수 있습니다.
   2. 올레산( 재료 표 참조)을 37°C의 초음파 수조에서 일정한 교반 하에 한 방울씩 매우 천천히 첨가합니다.
      알림: 올레산 침전이 발생하면 처음부터 다시 시작하십시오.
   3. 올레산이 완전히 용해되면 pH를 7.4로 조심스럽게 조정하고 초순수 희석된 HCl을 사용하여 교반하면서 한 방울씩 떨어뜨린 다음 최종 부피인 50mL로 조정합니다.
      알림: 작업 올레이트 용액을 새로 준비하십시오. 대안적으로, 용액은 질소가 풍부한 환경에서 -20°C에서 분취, 비축 및 유지되어 한 달 이상 산화를 피할 수 없습니다. 냉동-재냉동 주기를 피하십시오.

2. 올레산에 의한 폐 손상 유도

1. 올레산의 기관내 투여를 수행합니다.
   1. 수의학 마취 기화기를 사용하여_O2 2 L/min으로 5% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다(그림 1A). 절개 부위의 털을 제모 크림으로 제거하고 멸균 거즈를 사용하여 베타딘 스크럽과 알코올을 번갈아 3회 번갈아 가며 소독합니다. 발가락 꼬집으로 마취 깊이를 확인합니다.
      알림: 시술 중에는 멸균 장갑과 기구를 사용하십시오. 드레이프를 사용하여 동물을 덮고 절개 부위만 노출시킵니다. 이소불소가 환경으로 빠져나가는 것을 방지하기 위해 생물 안전 작업대에서 실험을 수행합니다. 진통제는 염증 반응을 억제할 수 있으므로 투여하지 않습니다.
   2. 마취 후 동물을 등쪽 욕창 자세로 눕히고 갑상선 수준에서 V자 모양으로 절개(0.5-1cm)합니다. 갑상선을 부드럽게 옮겨 기관을 노출시키고(그림 1B) 준비된 올레이트 용액 50μL를 주입합니다(1단계).
      참고: 쥐는 두 그룹으로 나뉘었고 각 그룹에는 8마리의 동물이 있었습니다. 폐 손상 그룹은 25mM(1.25μmol)의 나트륨-올레산염 용액을 투여받고, 대조군은 인슐린 주사기(부피 300μL, 30G)로 각 마우스의 기관에 점안하여 50μL의 멸균 식염수를 투여합니다(그림 1C).
   3. 합성 비흡수성 모노필라멘트 봉합사로 생쥐의 절개 부위를 봉합하고 케이지로 되돌려 놓고 수술에서 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다. 모든 절차 동안 동물을 37°C의 가열 패드에 유지하십시오.
      참고: 마우스는 일반적으로 수술 후 회복하는 데 최대 15분이 걸립니다.
2. 올레산의 정맥 투여를 수행합니다.
   1. 마취 후(단계 2.1.1, 그림 2A) 안와(eye socket)의 내측 안각(medial canthus)에 초미세 바늘(재료 표 참조)을 삽입하여 안와신경총에 정맥 주사합니다(그림 2B).
      참고: 쥐는 두 그룹으로 나뉘었고 각 그룹에는 8마리의 동물이 있었습니다. 각 그룹은 동물당 10μmol의 OA로 100μL의 나트륨-올레에이트 용액을 투여받는 반면, 대조군은 100μL의 멸균 식염수를 투여받습니다.
3. 수술 후에는 매일 동물의 부작용을 모니터링하십시오. 안락사에 대한 인도적 종점에는 부작용, 경련 및 혼수 상태가 포함됩니다.

3. 기관지 폐포 세척액 수집(BALF)

1. 케타민(300mg/Kg)과 자일라진(30mg/Kg)의 복강내 치사량으로 마우스를 안락사시킨다( 자료표 참조).
2. 동물을 등쪽 욕창 위치에 눕히고 동물의 앞쪽 부위에 수술용 가위로 약 1cm를 절개하고 기관을 노출시키고 정맥 카테터(20G)를 삽입하기 위해 작게 자릅니다.
3. 카테터를 1mL 멸균 주사기에 연결하고 0.5mL의 멸균 식염수를 폐에 천천히 점차적으로 주입한 다음 동일한 주사기로 BALF의 액체를 흡인합니다. 3-5회 반복하고 멸균 마이크로튜브에 옮겨 얼음에 넣습니다.
   참고: 샘플은 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.

4. BALF의 전체 세포 및 차등 세포 분석

1. 총 세포 수를 위해 20μL의 BALF를 180μL(10배 희석)의 Turk's 용액에 희석합니다( 재료 표 참조). 40x 대물렌즈가 있는 광학 현미경 아래의 Neubauer 챔버를 사용하여 계수를 수행합니다.
2. 차등 계수를 위해 슬라이드가 포함된 세포 깔때기에 100μL의 BALF를 넣고 세포 원심분리기에서 4°C에서 5분 동안 22.86 x g 으로 원심분리하고 May-Grunwald(15%, pH 7.2)-Giemsa(1:10)로 염색합니다( 재료 표 참조). 이멀젼 대물렌즈가 있는 광학 현미경에서 세포 계수를 진행합니다.

5. BALF의 총 단백질 측정

1. 상용 단백질 정량 분석 키트로 총 BALF 상층액 단백질을 측정하고 제조업체의 지침에 따라 분광 광도계를 사용하여 562nm에서 흡광도를 판독합니다( 재료 표 참조).

6. 효소 면역흡착 분석

1. BALF를 1,200 x g에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 피펫으로 상층액을 수집하고 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2 15,23,25 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.
   참고: 6.1단계의 원심분리는 BALF를 cell-free로 만듭니다.
   1. 제조업체의 지침에 따라 상용 ELISA 키트를 사용하여 cell-free BALF에 대한 사이토카인 분석을 수행합니다. 제조업체의 지침에 따라 효소 면역분석(EIA) 키트를 사용하여 PGE2 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).

7. 지질 체내 염색 및 계산

1. Ca 2+, Mg²⁺ free Hank의 완충염 용액(HBSS, pH 7.4)에서 3.7% 포름알데히드를 사용하여 cytospin 슬라이드에 백혈구를 고정하고 아직 촉촉한 상태에서 1.5% OsO₄로 염색합니다.³(재료 표 참조). 그런 다음 현미경의 오일 이멀젼 대물 렌즈를 사용하여 각 슬라이드에서 50개의 연속된 백혈구에서 세포당 지질체를 계산합니다.

8. 통계 분석

1. 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다( 재료 표 참조). 결과를 평균 ± SEM으로 표현하고 일원 분산 분석으로 분석한 후 사후 검정 Newman-Keuls-Student²⁶으로 분석합니다. P 가 0.05일 때 유의< 차이를 고려하십시오.

결과

손상되지 않은 폐에서 폐포액 청소는 온전한 폐포 상피층을 통한 이온의 이동에 의해 발생합니다. 삼투압 구배는 허파꽈리에서 폐간질로 체액을 운반하여 림프관에 의해 배출되거나 재흡수됩니다. Na/K-ATPase는 이 수송¹¹을 구동한다. OA는 Na/K-ATPase²⁷ 및 나트륨 채널 21의 억제제이며, 이는 이미 제안한 바와 같이 부종 형성에 기여할 수 있습니다²³...

토론

전임상 연구를 수행하기 위해서는 올바른 ARDS 모델을 선택하는 것이 필수적이며, 평가자는 연령, 성별, 투여 방법 등과 같은 가능한 모든 변수를 고려해야 한다⁶. 선택한 모델은 패혈증, 지질 색전증, 폐혈관 허혈 재관류 및 기타 임상적 위험과 같은 위험 요인에 따라 질병을 재현해야 한다¹⁴. 그러나 ARDS에 사용된 동물 모델은 인간 증후군의 모든 특징을 재현할 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic vaporizer	SurgiVet	model 100
Braided slik thread with needle number 5	Shalon medical	N/A
Cabinet vivarium	Insight	Model EB273
Centrifuge	Eppendorf	5430/5430R
Cytofunnel	ThermoFisher	11-025-48
Drontal puppy	Bayer	N/A
Hank's balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4981
Heatpad	tkreprodução	TK-500
Hydrocloric Acid	Sigma-Aldrich	30721
Insulin syringe Ultrafine	BD	328322
Isoforine 1mL/mL	Cristália	N/A
Ketamine	Syntec	N/A
May-Grunwald-Giemsa	Sigma-Aldrich	205435
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23235
Microscope  PrimoStar	Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA	R&D system	DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA	R&D system	DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA	R&D system	DY410
Neubauer chamber improved bright-line	Global optics
Oleic Acid (99%)	Sigma-Aldrich	O1008
Osmium tetroxide solution (4%)	Sigma-Aldrich	75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G	BD Angiocath	388333
Prism 8 (graphic and statistic software)	Graphpad	N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal	Cayman Chemical	514010
Shandon Cytospin 3	ThermoFisher	N/A
Sodium hydroxide	Merck	1,06,49,81,000
Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice	ICTB/FIOCRUZ	N/A
Syringe 1 mL	BD	990189
Tris-base	Bio Rad	161-0719	Electrophoresis purity reagent
Türk's solution	Sigma-Aldrich	93770
Xilazine	Syntec	N/A