Modelo de Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo Induzido por Ácido Oleico em Camundongos

Resumo

O presente protocolo descreve um modelo de lesão pulmonar em camundongos utilizando ácido oleico para mimetizar a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). Esse modelo aumenta os mediadores inflamatórios no edema e diminui a complacência pulmonar. O ácido oleico é usado na forma de sal (oleato), uma vez que esta forma fisiológica evita o risco de embolia.

Resumo

A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é uma ameaça significativa para pacientes gravemente enfermos com alta taxa de letalidade. Exposição a poluentes, fumaça de cigarro, agentes infecciosos e ácidos graxos podem induzir SDRA. Modelos animais podem mimetizar o complexo patomecanismo da SDRA. No entanto, cada um deles tem limitações. Notavelmente, o ácido oleico (OA) está aumentado em pacientes gravemente enfermos com efeitos nocivos no pulmão. A OA pode induzir lesão pulmonar por êmbolos, rompendo tecidos, alterando o pH e prejudicando a depuração do edema. O modelo de lesão pulmonar induzida por OA assemelha-se a várias características da SDRA com lesão endotelial, aumento da permeabilidade alveolar, inflamação, formação hialina da membrana e morte celular. Neste estudo, a indução de lesão pulmonar é descrita pela injeção de AO (na forma de sal) diretamente no pulmão e por via intravenosa em camundongos, uma vez que é a forma fisiológica da OA em pH 7. Assim, a injeção de AO na forma de sal é um modelo animal útil para estudar a lesão pulmonar/SDRA sem causar êmbolos ou alterar o pH, aproximando-se assim do que está acontecendo em pacientes criticamente enfermos.

Introdução

Ashbaugh et ^al.1, em 1967, descreveram pela primeira vez a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) e, desde então, passaram por múltiplas revisões. De acordo com a definição de Berlim, SDRA é uma inflamação pulmonar que leva a insuficiência respiratória aguda e hipoxemia (PaO 2/FiO 2 > 300 mmHg) devido a desequilíbrio na relação ventilação/perfusão, dano alveolar bilateral difuso (DAD) e infiltrado, aumento do peso pulmonar e edema ^2,3. O parênquima pulmonar é um ambiente celular complexo composto por células epiteliais, endoteliais e outras. Essas células formam barreiras e estruturas responsáveis pelas trocas gasosas e homeostase nos^alvéolos3. As células mais abundantes dentro da barreira epitelial são as células alveolares do tipo I (AT1) com maior área superficial para trocas gasosas e manejo de fluidos através da Na/K-ATPase. Além disso, as células alveolares tipo II (AT2) produzem surfactante, reduzindo a tensão superficial nos^alvéolos4. Abaixo, as células endoteliais formam uma barreira semipermeável que separa a circulação pulmonar do interstício. Suas funções incluem detectar estímulos, coordenar respostas inflamatórias e transmigração celular⁵. As células endoteliais também regulam as trocas gasosas, o tônus vascular e a coagulação⁵. Portanto, distúrbios da função endotelial e epitelial podem exacerbar um fenótipo pró-inflamatório, causando dano pulmonar levando à SDRA⁵.

O desenvolvimento da SDRA está associado ao risco de pneumonia bacteriana e viral ou de fatores indiretos, como sepse não pulmonar, trauma, transfusões de sangue e^pancreatite6. Essas condições causam a liberação de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e padrões moleculares associados a danos (DAMPs), induzindo citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8⁵. O TNF-α está ligado à degradação da caderina vásculo-endotelial (VE-caderina) na ruptura da barreira endotelial e infiltração leucocitária no parênquima pulmonar. Os neutrófilos são as primeiras células a migrar, atraídos por IL-8 e LTB₄ ^5,7,8. Os neutrófilos aumentam ainda mais as citocinas pró-inflamatórias, as espécies reativas de oxigênio (EROs)⁹ e a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), gerando dano extra endotelial e epitelial¹⁰. O dano epitelial provoca inflamação e ativação de receptores Toll-like em células AT2 e macrófagos residentes, induzindo a liberação de quimiocinas que atraem células inflamatórias para os pulmões⁴. Além disso, a produção de citocinas como o interferon-β (INF_β) causa receptores indutores de apoptose relacionados ao TNF (TRAIL), levando as células ATII à apoptose, prejudicando a clarência de fluidos e íons⁴. A ruptura da estrutura da barreira endotelial e epitelial permite o influxo de fluidos, proteínas, hemácias e leucócitos para o espaço alveolar, causando edema. Com o edema estabelecido, o esforço pulmonar para manter a respiração e as trocas gasosas é alterado¹¹. A hipercapnia e a hipoxemia induzem morte celular e distúrbio no transporte de sódio, agravando o edema alveolar devido à baixa capacidade de depuração¹⁰. A SDRA também apresenta níveis elevados de IL-17A, associados a disfunção orgânica, aumento da porcentagem de neutrófilos alveolares e permeabilidade alveolar⁹.

Nos últimos anos, houve avanços contínuos nas pesquisas sobre fisiopatologia, epidemiologia e tratamento da SDRA^12,13. No entanto, a SDRA é uma síndrome heterogênea, apesar do progresso nas pesquisas terapêuticas, resultando em ventilação mecânica e otimização da fluidoterapia. Assim, um tratamento farmacológico direto mais efetivo ainda é necessário¹⁰, e estudos em animais podem ajudar a desvendar mecanismos e alvos de intervenção na SDRA.

Os modelos atuais de SDRA não são capazes de replicar completamente a patologia. Assim, os pesquisadores muitas vezes escolhem o modelo que melhor se adequa aos seus interesses. Por exemplo, o modelo de indução de lipopolissacarídeo (LPS) induz SDRA por choque endotóxico desencadeado principalmente por TLR4¹⁴. A indução do HCl mimetiza a aspiração ácida, e o dano é neutrofílico-dependente¹⁴. Por outro lado, o atual modelo de oleato de sódio induz dano endotelial que aumenta a permeabilidade vascular e o edema. Além disso, o uso de oleato de sódio em substituição ao ácido oleico na forma líquida evita riscos de embolia e alteração do pH sanguíneo¹⁵.

Modelos animais para SDRA
Estudos pré-clínicos em modelos animais ajudam a entender a patologia e são essenciais para novas pesquisas de tratamentos da SDRA. O modelo animal ideal precisa ter características semelhantes à situação clínica e boa reprodutibilidade dos mecanismos da doença, com características fisiopatológicas relevantes de cada estágio, evolução e reparo^{da doença14}. Vários modelos animais são utilizados para avaliar a lesão pulmonar aguda na SDRA pré-clinicamente. Entretanto, como todos os modelos apresentam limitações, não reproduzem completamente a patologia humana 6,14,16. A SDRA induzida pelo ácido oleico é utilizada em diferentes espécies animais¹⁷. Suínos¹⁸, ovinos¹⁹ e cães²⁰ submetidos à injeção de AO apresentam inúmeras características clínicas da doença com disfunção de membrana alvéolo-capilar e aumento da permeabilidade com infiltração proteica e celular.

Por exemplo, a OA de 1,25 μM injetada por via intravenosa bloqueou o transporte transepitelial levando a edema alveolar¹⁵. Alternativamente, no modelo in vitro usando células A549, a OA na concentração de 10 μM não alterou o canal de sódio epitelial (eNAC) ou a expressão de Na/K-ATPase. No entanto, os AO parecem associar-se a ambos os canais, inibindo diretamente sua atividade²¹. A injeção intravenosa de OA na concentração de 0,1 mL/kg causou congestão e edema do tecido pulmonar, reduziu os espaços alveolares com septos alveolares espessados e aumentou a contagem de hemácias e inflamatórias²². Além disso, a OA induziu apoptose e necrose em células endoteliais e epiteliais do pulmão¹⁵. A injeção de uma solução de tris-oleato, intratraquealmente em camundongos, aumentou a infiltração neutrofílica e o edema já 6 h após a estimulação²³. A injeção de AO em 24 h aumentou os níveis de citocinas pró-inflamatórias (isto é, TNF-α, IL-6 e IL-1β)²³. Além disso, a injeção intravenosa (plexo orbital) de 10 μM de um tris-oleato inibe a atividade da Na/K-ATPase pulmonar, semelhante à ouabaína em ^10-3 μM, um inibidor seletivo da enzima. Além disso, a OA induz inflamação com infiltração celular, formação de corpos lipídicos e produção de leucotrieno B4 (LTB₄) e prostaglandina E2 (PGE₂)^22,24. Portanto, a SDRA induzida pelo ácido oleico gera edema, hemorragia, infiltração neutrofílica, aumento da atividade da mieloperoxidase (MPO) e ROS²⁴. Assim, a administração de AO é um modelo bem estabelecido para lesão pulmonar^22,25. Todos os resultados apresentados neste artigo que tem AO representa a forma salina, oleato de sódio.

Protocolo

Os procedimentos utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Fundação Oswaldo Cruz (CEUA licenças n°002-08, 36/10 e 054/2015). Camundongos Swiss Webster machos, pesando entre 20-30 g, fornecidos pelo Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos (ICTB) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), foram utilizados para os experimentos. Os animais foram mantidos em isoladores ventilados no biotério do Pavilhão Ozório de Almeida e água e ração disponíveis ad libitum. Eles foram expostos a um ciclo claro e escuro de 12 h/12 h.

1. Preparação de solução de oleato de sódio

1. Utilizar ácido oleico para preparar uma solução-mãe de oleato de sódio a 100 mmol/L em qualquer tubo estéril ou balão de vidro.
   NOTA: Uma solução de 50 mL (volume final) foi preparada para o presente trabalho, mas o volume deve ser ajustado de acordo com a necessidade experimental. A solução deve ser sempre preparada em tubos estéreis ou recipientes de vidro.
   1. Primeiro, adicione comprimidos ou solução de NaOH em água ultrapura para elevar o pH. Um valor de pH de 12-13 é recomendado para um volume de 25 mL.
      NOTA: Alternativamente, a base de Tris pode ser usada para preparar a solução de Tris-oleato.
   2. Adicionar o ácido oleico (ver Tabela de Materiais) muito lentamente, gota a gota, sob agitação constante num banho ultra-sónico a 37 °C.
      NOTA: Se ocorrer precipitação de ácido oleico, comece tudo de novo desde o início.
   3. Uma vez que o ácido oleico esteja completamente dissolvido, ajuste cuidadosamente o pH para 7,4, gota a gota sob agitação, com HCl diluído ultrapuro e, em seguida, ajuste para o volume final de 50 mL.
      NOTA: Preparar recentemente as soluções de oleato de trabalho. Alternativamente, a solução pode ser aliquotada, armazenada e mantida a -20 °C num ambiente enriquecido com azoto para evitar a oxidação durante um período não superior a um mês. Evite ciclos congelados.

2. Indução de lesão pulmonar pelo ácido oleico

1. Realizar a administração intratraqueal de ácido oleico.
   1. Anestesiar os camundongos com isoflurano a 5% com 2 L/min de O₂ empregando vaporizador de anestésico veterinário (Figura 1A). Retire o pelo na área da incisão com creme depilatório e desinfete a área com três rodadas alternadas de esfoliação de betadina e álcool usando gaze estéril. Confirme a profundidade da anestesia por pinça dos dedos.
      OBS: Utilizar luvas e instrumentos estéreis durante o procedimento. Use um pano para cobrir o animal e expor apenas o local da incisão. Realizar o experimento em um gabinete de segurança biológica para evitar a fuga de isofluorano para o meio ambiente. Os analgésicos não são administrados, pois podem inibir a resposta inflamatória.
   2. Após a anestesia, colocar o animal em decúbito dorsal e realizar uma incisão (0,5-1 cm) em V ao nível da tireoide. Deslocar suavemente a tireoide para expor a traqueia (Figura 1B) e injetar 50 μL da solução de oleato preparada (passo 1).
      OBS: Os camundongos foram divididos em dois grupos, com oito animais em cada grupo. O grupo lesão pulmonar recebe solução de sódio-oleato a 25 mM (1,25 μmol), e o grupo controle recebe 50 μL de solução salina estéril por instilação na traqueia de cada camundongo com uma seringa de insulina (volume 300 μL, 30 G) (Figura 1C).
   3. Sutura o local da incisão dos camundongos com uma sutura sintética monofilamentar não absorvível, devolvê-lo à gaiola e monitorá-lo até a recuperação completa da cirurgia. Durante todos os procedimentos, manter os animais numa almofada de aquecimento a 37 °C.
      NOTA: Os ratos geralmente levam até 15 minutos para se recuperar da cirurgia.
2. Realizar a administração intravenosa de ácido oleico.
   1. Após a anestesia (passo 2.1.1, Figura 2A), injetar por via intravenosa no plexo orbitário inserindo a agulha ultrafina (ver Tabela de Materiais) no canto medial da cavidade ocular (Figura 2B).
      OBS: Os camundongos foram divididos em dois grupos, com oito animais em cada grupo. Cada grupo recebe 100 μL da solução de sódio-oleato a 10 μmol de AO por animal, enquanto o grupo controle recebe 100 μL de solução salina estéril.
3. Após a cirurgia, monitorar os animais diariamente quanto a reações adversas. Os desfechos humanos para a eutanásia incluem reações adversas, convulsões e coma.

3. Coleta de lavado broncoalveolar (lavado broncoalveolar)

1. Eutanásia dos ratinhos com uma dose letal intraperitoneal de cetamina (300 mg/Kg) e xilazina (30 mg/Kg) (ver Tabela de Materiais).
2. Deitar o animal em decúbito dorsal, fazer uma incisão de aproximadamente 1 cm com tesoura cirúrgica na região anterior do animal, expor a traqueia e fazer um pequeno corte para introduzir um cateter intravenoso (20 G).
3. Conecte o cateter a uma seringa estéril de 1 mL, injete lenta e gradualmente 0,5 mL de solução salina estéril nos pulmões e, em seguida, aspirar o líquido do lavado broncoalveolar com a mesma seringa. Repita de 3 a 5 vezes e transfira para um microtubo estéril, colocando-os no gelo.
   NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -20 °C por até 6 meses.

4. Análise celular total e diferencial em lavado broncoalveolar

1. Para a contagem total de células, diluir 20 μL de lavado em 180 μL (diluição de 10x) da solução de Turk (ver Tabela de Materiais). Realizar a contagem utilizando câmara de Neubauer sob microscópio óptico com objetiva de 40x.
2. Para contagem diferencial, colocar 100 μL de lavado no funil celular contendo lâminas e centrifugar a 22,86 x g por 5 min a 4 °C em citocentrífuga e corar com May-Grunwald (15%, pH 7,2)-Giemsa (1:10) (ver Tabela de Materiais). Prossiga com a contagem de células em um microscópio de luz com objetiva de imersão.

5. Determinação de proteína total em lavado broncoalveolar

1. Determinar a proteína sobrenadante total do lavado broncoalteado por um kit comercial de quantificação de proteínas e ler a absorbância a 562 nm utilizando um espectrofotómetro seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).

6. Ensaios imunoenzimáticos

1. Centrifugar BALF a 1.200 x g por 10 min a 4 °C. Em seguida, coletar o sobrenadante com pipeta e armazená-lo a -80 °C para dosagem de TNF-α, IL-1β, IL-6 e PGE2^15,23,25.
   NOTA: A centrifugação na etapa 6.1 torna o BALF livre de células.
   1. Realizar os ensaios de citocinas em lavado broncoalveolar livre de células usando um kit ELISA comercial de acordo com as instruções do fabricante. Realizar o ensaio PGE2 utilizando um kit de ensaio imunoenzimático (EIA) seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).

7. Coloração e contagem do corpo lipídico

1. Fixar os leucócitos em lâminas de cytospin usando formaldeído a 3,7% em solução tamponada de Hank Ca 2+, Mg²⁺ (HBSS, pH 7,4) e corar com OsO₄ a 1,5% ainda húmido³ (ver Tabela de Materiais). Em seguida, conte os corpos lipídicos por célula em 50 leucócitos consecutivos de cada lâmina usando a lente objetiva de imersão em óleo do microscópio.

8. Análise estatística

1. Realizar análise estatística utilizando softwares gráficos e estatísticos (vide Tabela de Materiais). Expresse os resultados como média ± MEV e analise por Anova one-Way seguida de um pós-teste Newman-Keuls-Student²⁶. Considere-se as diferenças significativas quando P < 0,05.

Resultados

Em um pulmão não lesado, a depuração do líquido alveolar ocorre pelo transporte de íons através da camada epitelial alveolar intacta. O gradiente osmótico transporta o líquido dos alvéolos para o interstício pulmonar, onde é drenado pelos vasos linfáticos ou reabsorvido. Na/K-ATPase conduz esse transporte¹¹. A OA é um inibidor da Na/K-ATPase²⁷ e do canal^{de sódio 21}, o que pode contribuir para a formação de edema, como já sugerimos

Discussão

A seleção do modelo correto de SDRA é essencial para a realização dos estudos pré-clínicos, e o avaliador deve considerar todas as variáveis possíveis, como idade, sexo, métodos de administração, entre^outras6. O modelo escolhido deve reproduzir a doença baseado em fatores de risco como sepse, embolia lipídica, isquemia-reperfusão da vasculatura pulmonar e outros riscos^clínicos14. No entanto, nenhum modelo animal usado para SDRA pode recriar todas as caracter...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic vaporizer	SurgiVet	model 100
Braided slik thread with needle number 5	Shalon medical	N/A
Cabinet vivarium	Insight	Model EB273
Centrifuge	Eppendorf	5430/5430R
Cytofunnel	ThermoFisher	11-025-48
Drontal puppy	Bayer	N/A
Hank's balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4981
Heatpad	tkreprodução	TK-500
Hydrocloric Acid	Sigma-Aldrich	30721
Insulin syringe Ultrafine	BD	328322
Isoforine 1mL/mL	Cristália	N/A
Ketamine	Syntec	N/A
May-Grunwald-Giemsa	Sigma-Aldrich	205435
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23235
Microscope  PrimoStar	Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA	R&D system	DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA	R&D system	DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA	R&D system	DY410
Neubauer chamber improved bright-line	Global optics
Oleic Acid (99%)	Sigma-Aldrich	O1008
Osmium tetroxide solution (4%)	Sigma-Aldrich	75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G	BD Angiocath	388333
Prism 8 (graphic and statistic software)	Graphpad	N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal	Cayman Chemical	514010
Shandon Cytospin 3	ThermoFisher	N/A
Sodium hydroxide	Merck	1,06,49,81,000
Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice	ICTB/FIOCRUZ	N/A
Syringe 1 mL	BD	990189
Tris-base	Bio Rad	161-0719	Electrophoresis purity reagent
Türk's solution	Sigma-Aldrich	93770
Xilazine	Syntec	N/A