Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme

Özet

Burada, tek hücrelerde mutlak mitokondriyal (mt) DNA kopya sayısını ve mtDNA delesyon heteroplazmi seviyelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Memeli mitokondriyal (mt) DNA'sı, elektron taşıma zincirinin 13 alt birimini kodlayan küçük, dairesel, çift sarmallı, mitokondriyal bir DNA molekülüdür. Diploid nükleer genomun aksine, çoğu hücre, hücre tipine bağlı olarak 100'den az ila 200.000'den fazla kopya arasında değişen mtDNA'nın çok daha fazla kopyasını içerir. MtDNA kopya sayısı, yaşa bağlı bir dizi dejeneratif durum ve hastalık için bir biyobelirteç olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır ve bu nedenle, mtDNA kopya sayısının doğru ölçümü hem araştırma hem de teşhis ortamlarında önemli bir araç haline gelmektedir. Genellikle tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler) veya delesyonlar olarak ortaya çıkan mtDNA'daki mutasyonlar, hücre içindeki mtDNA'nın tüm kopyalarında (homoplazmi olarak adlandırılır) veya mutasyona uğramış ve WT mtDNA kopyalarının (heteroplazmi olarak adlandırılır) bir karışımı olarak bulunabilir. Heteroplazmik mtDNA mutasyonları, nadir hastalıklarda veya Parkinson hastalığı gibi giderek artan sayıda yaygın geç başlangıçlı hastalıkta klinik mitokondriyal patolojinin önemli bir nedenidir. Hücrelerde bulunan heteroplazmi seviyesinin belirlenmesi, nadir görülen mitokondriyal hastalıkların tanısında ve mitokondrinin rol oynayabileceği yaygın geç başlangıçlı bozuklukları anlamayı amaçlayan araştırmalarda kritik bir adımdır. MtDNA kopya sayısı ve heteroplazmi geleneksel olarak kantitatif (q) PCR tabanlı testler veya derin dizileme ile ölçülmüştür. Bununla birlikte, ddPCR teknolojisinin yakın zamanda tanıtılması, her iki parametreyi ölçmek için alternatif bir yöntem sağlamıştır. Mutlak mtDNA kopya sayısını ölçme yeteneği ve düşük kopya sayılarında bile tek hücrelerden doğru ölçümler yapmak için yeterli hassasiyet de dahil olmak üzere mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajlar sunar. Burada, ddPCR kullanılarak tek hücrelerde mtDNA kopya sayısının ölçümünü açıklayan ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır, bundan böyle damlacık üretimi PCR olarak adlandırılacaktır ve mtDNA delesyonlu hücrelerde heteroplazmilerin eşzamanlı olarak ölçülmesi seçeneği sunulmaktadır. Bu yöntemin mtDNA SNP'li hücrelerde heteroplazmiyi ölçmek için genişletilmesi olasılığı da tartışılmaktadır.

Giriş

Memeli mitokondriyal (mt) DNA'sı, iki rRNA, 22 tRNA ve 13 protein kodlayan gen 1'den oluşan 37 geni kodlayan mitokondriyal matriste bulunan küçük (yaklaşık 16.5 Kb), dairesel bir DNA genomudur^. Hücre başına her genin bir (haploid) veya iki (diploid) kopyasını içeren nükleer genomun aksine, mtDNA, her hücrenin mitokondrisinde, onlarca kopyadan (örneğin, olgun spermatositler) yüz binlerce kopyaya (örneğin, oositler) kadar değişen çoklu kopyalarda ^bulunur2,3. Bu çok kopyalı doğanın bir sonucu, mtDNA genomundaki tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), delesyonlar veya duplikasyonlar olarak var olabilen mutasyonların, herhangi bir hücrede değişen seviyelerde bulunabilmesidir ve hücrenin toplam mtDNA popülasyonunun% 0 ila% 100'ünü oluşturur. Aynı hücrede vahşi tip ve mutant mtDNA genomlarının varlığı heteroplazmi olarak adlandırılır ve patojenik heteroplazmik mtDNA mutasyonları, altta yatan heteroplazmik mtDNA mutasyonlarına bağlı birkaç yaygın nörolojik sendromla mitokondriyal hastalığın önemli bir nedenidir⁴.

Klinik hastalığa neden olan heteroplazmik mtDNA mutasyonu olasılığına katkıda bulunan iki anahtar parametre, heteroplazmi seviyesi ve mtDNA kopya sayısıdır. Birçok heteroplazmik mutasyon bir eşik etkisi gösterir, biyokimyasal ve klinik fenotipler sadece belirli bir heteroplazmi seviyesinin üzerinde, tipik olarak% 80 ^civarında5 belirginleşir ve daha sonra heteroplazmi daha da arttıkça kötüleşir⁴. Bununla birlikte, hücrede bulunan mtDNA'nın kopyalarının sayısını da dikkate almak önemlidir, çünkü bu, belirli bir heteroplazmi seviyesinde bulunan vahşi tip (yani 'sağlıklı') mtDNA genomlarının sayısını etkileyecektir. Mitokondriyal hastalık hastalarında yapılan çalışmalar, heteroplazmi ile kopya sayısı^5,6 arasındaki bu etkileşimin önemini vurgulamıştır ve Filograna ve ark. yakın zamanda^, mitokondriyal hastalığın bir fare modelinde değişmemiş heteroplazmiye rağmen semptomları hafifleten mtDNA kopya sayısında bir artış olduğunu bildirmiştir⁷.

Son yıllarda mtDNA heteroplazmisinin neden olduğu hastalıkların patogenezi ve iletiminin anlaşılmasını geliştirmek için çok şey yapılmış olsa da, bu çalışmanın çoğu, ortalama doku heteroplazmi seviyelerini ve toplu doku biyopsilerinden ve kan örneklerinden elde edilen kopya sayısı ölçümlerini karşılaştırarak, hücrelerden ziyade dokular düzeyinde gerçekleştirilmiştir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu gibi bazı köklü teknikler, hücresel düzeyde bu tür ölçümlere izin verir ^8,9; Bununla birlikte, yüksek verimli tek hücreli analiz yöntemlerinin veya "Tek Hücreli Omics"¹⁰ olarak adlandırılan son patlaması, bu önemli mtDNA parametrelerini tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçebilen yöntemler için bir gereklilik yaratmıştır.

Damlacık üretimi PCR yöntemi, örnek DNA^11'deki spesifik hedef amplikonların PCR amplifikasyonu yoluyla bilinmeyen DNA konsantrasyonlarını ölçmek için mevcut yöntemleri geliştirmek için mikroakışkan teknolojisindeki son gelişmelerden yararlanır. Numune DNA'sının tek bir reaksiyonda güçlendirildiği qPCR'den farklı olarak, PCR ürününün göreceli birikim hızı okuma görevi görür, bu yöntem ilk numuneyi binlerce bireysel damlacığa böler, böylece numune DNA moleküllerini mekansal olarak ayrı reaksiyonlara bölümlere ayırır¹². Sonraki PCR reaksiyonu her bir damlacıkta ilerler, PCR ürünü sadece hedef DNA'yı içeren damlacıklarda birikir. Bu reaksiyonun sonucu, hedef DNA'nın ve güçlendirilmiş PCR ürününün bir kopyasını içeren veya hedef DNA içermeyen bir damlacık havuzu şeklinde dijital bir çıktıdır. Floresan DNA probları veya çift sarmallı (ds) DNA bağlayıcı boya kullanılarak, güçlendirilmiş ürün içeren damlacıklar sayılabilir ve ilk numunede bulunan DNA kopyalarının mutlak sayısını hesaplamak için 'pozitif' ila 'negatif' damlacıkların oranı kullanılabilir. Bu mutlak ölçüm, bir qPCR reaksiyonundan elde edilen bağıl ölçümün aksine, bu metodolojinin tek hücrelerde mtDNA kopya sayısının ve heteroplazminin doğru ölçümü için kullanılmasına izin veren anahtar faktördür¹¹ ve son zamanlarda yapılan birkaç çalışmada damlacık üretimi PCR teknolojisi bu amaçla kullanılmıştır^13,14 . Bu makalede, hem insan hem de fare dokusundan tek hücrelerde mtDNA kopya sayısını ve delesyon heteroplazmisini ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır.

Protokol

Tüm deneyler ARRIVE yönergelerini takip etti ve Cambridge Üniversitesi Hayvan Refahı Etik İnceleme Organı (AWERB) tarafından onaylandı.

NOT: Damlacık oluşturmadan önceki tüm numune hazırlama adımları, temiz bir PCR öncesi çalışma alanında, ideal olarak mümkün olduğunda UV sterilize edilmiş bir kabinde gerçekleştirilmelidir. Burada açıklanan protokol, belirli damlacık üretimi PCR ekipmanı kullanır ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve genel yöntemin diğer sistemlere uygulanabilir olması gerekirken, burada açıklananlardan farklı olabileceğinden, üreticinin astar / prob konsantrasyonları, PCR döngü koşulları vb. İle ilgili yönergelerine başvurulması önerilir. Bu çalışmada kullanılan hücre hatları / birincil hücreler aşağıdaki gibidir: İnsan HeLa hücreleri (ticari olarak elde edilen), insan HEK 293T hücreleri (ticari olarak elde edilen), birincil insan dermal fibroblast hücreleri (Newcastle Biobank'tan elde edilen), insan cybridleri (C. Moraes, Miami Üniversitesi'nden elde edilen WT & ΔH2.1 delesyon¹⁵), fare embriyonik fibroblastları (ölümsüzleştirilmiş, J. Stewart'tan elde edilen C57Bl / 6 farelerden, Newcastle Üniversitesi), fare ilkel germ hücreleri (C57Bl / 6 fare embriyolarından elde edilen) ve fare MII oositleri (yetişkin dişi C57Bl / 6 farelerden elde edilen). Tüm kültürlenmiş hücreler Yüksek Glukoz (4.5g / L) DMEM'de tutuldu ve %5 CO₂ ile 37 °C'de %10 fetal sığır serumu desteklendi. Bu çalışmada kullanılan birincil fare hücreleri, İçişleri Bakanlığı Proje Lisansı P6C97520A kapsamında 1986 tarihli Hayvan (Bilimsel Prosedürler) Yasası'na göre tutulan hayvanlardan izole edilmiştir.

1. İlgilenilen DNA dizilerini hedefleyen astar ve prob setleri tasarlayın ve sentezleyin

NOT: Damlacık üretimi PCR, amplikona özgü probların yerine dsDNA bağlayıcı bir boya kullanılarak da gerçekleştirilebilir.

1. Astar ve prob dizilerini sistem üreticisi tarafından verilen yönergelere göre tasarlayın. Hem insan ^16,17 hem de fare¹⁸ hücrelerinde tek hücreli mtDNA kopya sayısı/delesyon heteroplazmisini ölçmek için uygun doğrulanmış primer ve prob dizileri Tablo 1'de verilmiştir. Alternatif hedef dizileri seçerken, aşağıdaki noktaları göz önünde bulundurun.
   1. Tek bir PCR testinde iki astar/prob setini çoğaltın, ancak iki tahlilin bir FAM etiketli prob ve bir HEX etiketli prob kullandığından emin olun, böylece hedef amplikonlar damlacık okuyucu tarafından ayırt edilebilir. Bu protokol çift yönlü bir prob testi sunar. Dikkatli deneysel tasarımla, çoklama dört hedefe kadar artırılabilir ve alternatif platformlar daha yüksek boyutlu çoklama elde edebilir.
   2. Ayrı mtDNA dizilerini hedefleyen astar/prob setlerini çoğaltırken, iki astar seti tarafından üretilen amplikonların üst üste binmediğinden emin olun.
   3. MtDNA delesyonları taşıyan örneklerde heteroplazmi ölçerken, bir hedef amplikonun beklenen silinmiş bölge içinde ve diğerinin beklenen silinen bölgenin dışında kaldığından emin olun.
      NOT: Alternatif testler için optimal PCR döngü koşulları, Adım 5.1'de belirtilenlerden farklı olabilir; Tahlil optimizasyonu hakkında daha fazla ayrıntı için Tartışma'ya bakın.

2. DNA'nın tek hücrelerden izolasyonu

NOT: Bu yöntem, 100 hücreye kadar küçük toplu numuneler için de kullanılabilir.

1. Floresanla Aktive Edilmiş Hücre Sıralama (FACS)¹⁹ veya lazer yakalama mikrodiseksiyonu²⁰ gibi uygun bir yöntem kullanarak tek hücreleri, uygun bir kapta (örneğin, 96 delikli plaka) mümkün olduğunca küçük bir hacimde toplayın. Tek hücreli izolasyondan önce veya sırasında bir hücre canlılığı boyasının kullanılması, ölü hücrelerin izole edilme olasılığını en aza indirecektir. İsterseniz tek hücreleri doğrudan lizis tamponuna ayırın ve analizden önce -80 ° C'de (6 aya kadar) saklayın.
2. Hücreleri uygun bir lizis tamponunun küçük bir hacminde (<10 μL) lize edin (bu çalışmada kullanılan tampon adım 2.2.1'de açıklanmıştır).
   NOT: Bu çalışmada hücrelerden elde edilen tüm veriler, tek hücreli lizatlardan veya 20 hücreli havuzlardan elde edilmiştir (örnek büyüklükleri şekil açıklamalarında belirtilmiştir). Damlacık üretimi PCR protokolünün damlacık oluşturma adımı sırasında bir yağ/damlacık emülsiyonunun verimli oluşumu, numunedeki deterjanların varlığından önemli ölçüde etkilenebilir; bu nedenle, deneysel numunelere devam etmeden ve en küçük pratik lizis tamponu hacmini kullanmadan önce, tüm hücre lizis tamponlarının amaçlanan giriş konsantrasyonunda damlacık üretimi ile uyumluluğunun doğrulanması önerilir. Aşağıdaki lizis protokolü, damlacık üretim verimliliği üzerinde minimum etki ile sonuçlanır.
   1. 50 mM Tris-HCl pH 8.3,% 1 ARA-20 ve 200 μg / mL Proteinaz K içeren lizis tamponunu hazırlayın.
   2. Her numuneye 2,5 μL lizis tamponu ekleyin, plakayı yapışkan bir plaka contasıyla kapatın ve ardından numuneleri 4 ° C'de 1 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin.
   3. Plaka kapağında sıvının yoğuşmasını önlemek için numuneleri termosikler üzerinde 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin, ısıtmalı kapak 105 °C'ye ayarlanmıştır.
   4. 10 μL'lik son numune hacmi elde etmek için her numuneye 7,5 μL nükleaz içermeyen su ekleyin, plakayı yeniden kapatın ve ardından numuneleri 4 ° C'de 1 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin.
   5. Proteinaz K'yı inaktive etmek için termosikler üzerinde 15 dakika boyunca 80 ° C'de (ısıtılmış kapak 105 ° C'ye ayarlanmış) inkübe edin.
   6. Numuneleri 4 ° C'de 1 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın ve ardından buz üzerinde tutun.
3. Aşağıdaki 3. adıma geçin.
   NOT: Hücre lizatları, adım 3'e devam etmeden önce -20 ° C'de saklanabilir; Bununla birlikte, DNA bozulmasına neden olan donma-çözülme döngüleri riskini ortadan kaldırmak için mümkün olduğunca taze salınımlı DNA kullanın.

3. Numunelerin hazırlanması

NOT: Sonuçların doğruluğunu sağlamak için numunelerin ve şablon dışı kontrollerin (NTC'ler) teknik kopyalarının her bir tahlil plakasına dahil edildiğinden emin olun. Damlacık üretimi PCR testinin dinamik aralığı, reaksiyon başına hedef amplikon'un 120.000 kopyasına kadardır. Tek hücreli veya küçük hacimli numune lizatları için, seyreltmenin gerekli olması muhtemel değildir ve lizat karışımı, mtDNA kopya sayısının ölçümü için doğrudan reaksiyona girilebilir (örneğin; 10 μL'lik bir lizat numunesi, her tahlilde doğrudan 3 μL girişi ile bölünebilir ve üçlü olarak çalıştırılabilir). Bununla birlikte, çok yüksek kopya mtDNA numaralarına (örneğin, oositler) sahip hücrelerden seyreltilmemiş lizat kullanmak veya daha fazla sayıda hücre içeren (örneğin, 50-100) bu dinamik aralığı aşabilir. Bu gibi durumlarda, söz konusu spesifik hücre tipi/hücre numarası için tahlilin doygunluğunu önleyen uygun bir seyreltme faktörünü tanımlamak için ilk seri seyreltme gereklidir (daha fazla ayrıntı için Temsili Sonuçlar'a bakın).

1. Buz, girdap üzerindeki tüm reaktiflerin buzunu çözün ve kullanmadan önce kısa bir süre aşağı doğru döndürün.
2. Ana karışımı (eksi örnek DNA) buz üzerinde açıklandığı gibi hazırlayın (Tablo 2).
   NOT: Yalnızca bir hedef amplikon ölçülüyorsa, 22 μL'lik nihai hacme ulaşmak için numune başına ilave 2,55 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. analiz edilecek numune ve NTC sayısı için yeterli ana karışım hazırlayın, ayrıca damlacık üretimi PCR plakasında gerekli olan 'boş' kuyucukları hesaba katacak kadar (bir sonraki adıma bakın).
3. Vorteks, gerekli hacmi (22 μL eksi giriş DNA hacmi) bir damlacık üretimi PCR 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna karıştırmak ve aliquot etmek için hazırlanan ana karışımı kısaca karıştırın. Numuneleri 96 delikli plaka üzerinde tam sütunlar halinde düzenleyin; eksik sütunlardaki boş kuyucukları ana karışımla doldurun ve NTC olarak kullanın.
4. Her numune kuyucuğuna giriş DNA'sını ve NTC kuyularına nükleaz içermeyen su/elüsyon tamponunu ekleyerek her birinin toplam hacmini 22 μL'ye çıkarın.
5. Plakayı yapışkan bir plaka contasıyla kapatın ve 1 dakika boyunca 2.000 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin ve ardından 4 ° C'de bir dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın.
6. Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve Adım 4'e geçin.
   NOT: Hazırlanan plakalar buz üzerinde saklanabilir ve damlacık üretimine geçmeden önce kısa süreler (örneğin, 1-2 saat) ışıktan korunabilir.

4. Damlacık oluşumu

NOT: Bu bölümde atıfta bulunulan damlacık jeneratörü cihaz güvertesinin şeması için Şekil 1A'ya bakın.

1. Damlacık jeneratörünü açın.
2. Gösterge güvertesinin E konumuna bir şişe damlacık üreten yağ yüklendiğini kontrol edin. İstenirse, şişeyi değiştirmek için ekrandaki talimatları izleyin.
3. Dokunmatik ekranda Örnek Plakayı Yapılandır'ı tıklatın. Numune plakasında numune/boşluk içeren tüm sütunları seçin.
   NOT: Bu adımda plaka adının ve denemenin ayrıntılarının girilmesi isteğe bağlıdır ve denemeyi kurmaya devam etmek için gerekli değildir.
4. Plaka yapılandırmasını onaylamak için Tamam'ı tıklatın; Sarf malzemelerinin yüklenmesi gereken konumları belirtmek için gösterge güvertesinde turuncu ışıklar yanar.
5. Tüm ışıkların yeşile dönmesi için damlacık jeneratörü kartuşlarını gösterge güvertesinde B konumuna getirin.
6. Boş bir uç atık oluğunu, enstrüman güvertesindeki C konumuna yerleştirin.
7. Filtre ucu kutularındaki kapakları çıkarın ve tüm ışıkların yeşile dönmesi için cihaz sahnesindeki D konumuna yükleyin.
8. Yapışkan plaka contasını numune plakasından çıkarın ve ışığın yeşile dönmesi için alet güvertesinin F konumuna getirin.
9. Boş bir damlacık toplama 96 delikli plakayı serin bir bloğa yerleştirin (-20 ° C'de önceden soğutulmuş) ve ışığın yeşile dönmesi için enstrüman güvertesinin G konumuna yükleyin.
10. Cihazın dokunmatik ekranında Damlacık Oluşturmayı Başlat'a tıklayın.
11. Cihazın dokunmatik ekranında Start Run (Çalıştırmayı Başlat ) düğmesini tıklatın. Cihaz kapağı otomatik olarak kapanacaktır. Başlattıktan sonra, damlacık oluşumu tamamlanana kadar kalan süre cihazın dokunmatik ekranında görüntülenecektir.
12. Damlacık üretimi tamamlandıktan sonra, her bir kuyucukta yağ fazının üzerinde bir damlacık emülsiyon tabakasının bulunduğunu doğrulamak için numune toplama plakasını görsel olarak kontrol edin (Şekil 1B).
    NOT: Bir damlacık emülsiyon tabakası görünmüyorsa, deneye devam etmeyin ve protokolün önceki adımlarında oluşmuş olabilecek hataları kontrol edin.
13. Kullanılan sarf malzemelerini cihaz güvertesinden temizleyin ve uç atık oluğunu boşaltın.
14. Plaka kapatıcıyı çalıştırın, sıcaklığı 180 ° C'ye ayarlayın ve sızdırmazlık süresini 5 s'ye ayarlayın ve makinenin çalışma sıcaklığına ulaşmasına izin verin.
15. Numune toplama plakasını plaka kapatıcı plaka tutucusuna yerleştirin ve plakanın üzerine, kırmızı çizgi yukarı bakacak şekilde taze bir folyo conta yerleştirin. Folyo contanın alt tarafına dokunmamaya dikkat edin.
    NOT: Plaka tutucu oda sıcaklığında (RT) saklanmalı ve sadece numune toplama plakasına ısı transferini önlemek için bir folyo conta uygulanırken plaka sızdırmazlık çekmecesine yerleştirilmelidir.
16. Plaka sızdırmazlık elemanı çalışma sıcaklığına ulaştığında, cihazın dokunmatik ekranında Çıkar düğmesine basın; çekmece otomatik olarak açılacaktır.
17. Plaka tutucuyu plaka sızdırmazlık çekmecesine yerleştirin ve Conta'ya basın. Çekmece otomatik olarak kapanacak ve sızdırmazlık tamamlandıktan sonra tekrar açılacaktır.
18. Soğuk blok üzerindeki kapalı plakayı değiştirin, plaka kapatıcıyı kapatın ve hemen Adım 5'e geçin.
    NOT: Bu aşamada, damlacıklar kararsızdır, bu nedenle PCR adımının damlacık oluşturma işleminin tamamlanmasından sonraki 1 saat içinde başlatıldığından emin olun.

5. PCR

1. Kapalı damlacık toplama plakasını, 96 derinliğinde bir kuyucuk bloğu ile donatılmış bir PCR bisikletçisine yerleştirin ve Tablo 3'te açıklanan termal döngü protokolünü çalıştırın.
   NOT: Isıtmalı kapak sıcaklığını 105 °C'ye ve numune hacmini 40 μL'ye ayarlayın.
2. Adım 6'ya geçin.
   NOT: Termal döngü protokolü tamamlandıktan sonra, damlacıklar daha kararlıdır ve plaka bir sonraki adıma geçmeden önce 4 ° C'de 4 güne kadar saklanabilir.

6. Damlacık okuma

1. Damlacık okuyucuyu ve bağlı bilgisayarı açın.
2. Damlacık okuyucu yağı ve damlacık okuyucu atık şişelerindeki sıvı seviyelerini kontrol edin ve gerekirse bunları sırasıyla doldurun / boşaltın.
3. PCR sonrası numuneleri içeren plakayı damlacık okuyucu plakası tutucusuna yerleştirin, kapağı tutucunun üstüne yerleştirin ve siyah kilitleme klipsleriyle yerine sabitleyin. Folyo kapağını numune plakasından çıkarmayın.
4. Damlacık okuyucuyu açmak için kapağındaki Aç/Kapat düğmesine basın.
5. Numune plakasını içeren damlacık okuyucu plakası tutucusunu okuyucu odasına yükleyin ve manyetik tabana güvenli bir şekilde yerleştirin.
6. Damlacık okuyucuyu kapatmak için kapağındaki Aç/Kapat düğmesine basın.
7. Analiz yazılımı arayüzünü açın, Plaka Ekle sekmesini seçin ve aşağıdaki gibi yeni bir numune plakası hazırlayın:
   1. Plaka Ekle'yi ve ardından Plakayı Yapılandır'ı tıklatın.
   2. Plaka Bilgileri sekmesinde bir Plaka Adı girin, Supermix açılır menüsünden Problar için Supermix'i seçin (dUTP yok) ve Veri Dosyasını Farklı Kaydet altına bir dosya adı girin.
   3. Kuyu Seçimi sekmesinde analiz edilecek kuyuları vurgulayın ve Seçili Kuyuları Dahil Et'i tıklatın.
      NOT: 6.7.4 – 6.7.7 arasındaki adımlar isteğe bağlıdır.
   4. Kuyu Bilgileri sekmesinde, açıklama eklenecek kuyuları seçin.
      NOT: Kuyu Bilgileri sekmesi arabiriminin bir örneği için Şekil 1B'ye bakın.
   5. Deneme Türü açılır menüsünden Doğrudan Niceleme (DQ) öğesini seçin, Örnek Açıklaması, Örnek Türü ve Hedef Adı kutularını doldurun ve gerektiğinde Kuyu Notları ve/veya Plaka Notları ekleyin.
   6. Apply'ı (Uygula) tıklayın. Alanlardaki bilgiler seçilen kuyucuklara uygulanacaktır.
   7. Tüm numune kuyularına açıklama eklenene kadar 6.7.4–6.7.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
8. Plaka yapılandırması tamamlandıktan sonra, Çalıştırmayı Başlat'ı tıklatın.
9. Çalıştırma tamamlandığında, boş numune plakasını atın ve gerekirse damlacık okuyucu atık şişesini boşaltın.
10. Adım 7'ye geçin.

7. Sonuçların analizi

NOT: Damlacık okuyucu, bir numunedeki her damlacık için FAM ve HEX kanalındaki floresan yoğunluğunu ölçer. Başarılı bir tahlilde, damlacıklar her bir prob için iki kategoriden birine girer: Negatif (hedefin damlacıkta bulunmadığı anlamına gelir) veya Pozitif (hedefin damlacıkta mevcut olduğu anlamına gelir). Numuneleri analiz etmeden önce, her bir kuyucuğun >10.000 damlacık içerdiğinden ve her kanalda düşük floresan (negatif) ve yüksek floresan (pozitif) damlacıklardan oluşan açıkça ayrı iki popülasyona sahip olduğundan emin olun (Şekil 2A).

1. Veri Analizi sekmesini seçin ve analiz edilecek dosyayı Veri Dosyalarım menüsünden açın.
2. Tek renkli denemeler için 1B Genlik sekmesini veya iki renkli denemeler için 2B Genlik sekmesini tıklatın.
3. Pozitif ve negatif damlacıkları ayırt etmek için her kanala bir floresan eşiği uygulayın. Analiz yazılımı, numune bazında ve kanal bazında otomatik bir eşik uygulamaya çalışır, ancak bu başarısız olmuş gibi görünüyorsa veya yanlış görünüyorsa, eşiği aşağıdaki gibi el ile uygulayın:
   1. Eşik gerektiren kuyucukları seçin.
   2. Eşik Çizgisi Modu aracını kullanarak genlik grafiğindeki pozitif ve negatif popülasyonlar arasındaki boş alana eşiği el ile uygulayın. 2B görünümde manuel eşikler ayarlarken, artı işaretinin dört damlacık popülasyonunun (çift negatif, tek pozitif FAM, tek pozitif HEX ve çift pozitif) açıkça ayrılacağı şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
      NOT: Eşikleme ya iyi bir şekilde yapılabilir ya da aynı anda birden fazla kuyuya uygulanabilir.
4. Tüm örneklere bir eşik uygulandıktan sonra, Veri Tablosu sekmesini tıklatıp, İçeri/Dışa Aktar'ı tıklatıp Görünür Verileri CSV'ye Aktar'ı seçerek sonuçları daha fazla analiz için .csv dosyası olarak dışa aktarın. Uygun bir dosya adı girin ve Kaydet'i tıklatın.
5. İlk örneklemdeki mtDNA kopya numarasını aşağıdaki gibi hesaplayın:
   Kopya Sayısı = mtDNA hedef konsantrasyonu × 22 × toplam lizat girişinin 1/fraksiyonu
   NOT: İki mitokondriyal prob kullanılıyorsa, hesaplama yapılmadan önce iki hedefin konsantrasyonunun ortalaması alınır. Birden fazla hücre içeren örnekler için, hücre başına kopya sayısı, örnekteki hücre sayısına bölünerek hesaplanır. .csv dosyasında hesaplanan '20 μL başına kopyalar' değeri yerine, 22 μL'lik ilk numune hacmi ile çarpılan 'Konsantrasyon' değerinin (yani, mikrolitre başına kopya sayısı) kullanılması önemlidir, çünkü damlacık üretecinin gerektirdiği 2 μL fazlalıkta bırakılan mtDNA kopyaları, ilk numunenin mutlak kopya sayısı hesaplanırken dikkate alınmalıdır.
6. Heteroplazmik mtDNA delesyonları taşıyan hücreler için, silinen bölgenin dışındaki mtDNA hedefinden elde edilen sonuçları kullanarak kopya sayısını hesaplayın (yani, hem silinmiş hem de WT mtDNA moleküllerinde bulunan hedef). Delesyon heteroplazmi, hedefin silinen bölge içindeki ve silinen bölgenin dışındaki hedef konsantrasyonları kullanılarak aşağıdaki gibi hesaplanır:
   

Sonuçlar

Damlacık oluşumunu takiben, her bir kuyucuktaki yağ fazının üstünde yüzen şeffaf bir opak damlacık tabakası görülebilir (Şekil 1B). Damlacık oluşumu, tek hücreler üzerinde deneyler yapılırken giriş lizatındaki deterjanların varlığından olumsuz etkilenebilir. 2.1.2.'de açıklanan lizis protokolü kullanılarak, son numunede küçük bir kalıntı miktarda TWEEN-20 bulunmasına rağmen, önerilen 10.000 seviyesinin üzerindeki damlacık verimleri rutin olarak elde ed...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol, yukarıda tartışılanlara ek olarak çok çeşitli hücre tipleri ve türleri arasında uygulanabilir, ancak yeni tahlil tasarımlarının dikkatli optimizasyonu, daha önce doğrulanmış primer / prob kombinasyonlarından uzaklaşırken yöntemin doğruluğunun ve tekrarlanabilirliğinin korunmasını sağlamak için anahtar olacaktır. Tek hücrelerle çalışırken, elde edilen sonuçların tek tek hücrelerinkileri gerçekten yansıttığından emin olmak için numune toplamanın mümk...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
50% Tween-20 solution	Novex	3005
Automated droplet-generating oil	Bio Rad	1864110	Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)
C1000 PCR machine with deep-well block	Bio Rad	1851197	PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)
Collection plate cooling block	Bio Rad	12002819	Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)
ddPCR 96-well plates	Bio Rad	12001925	96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)
ddPCR droplet reader oil	Bio Rad	1863004	Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio Rad	1863023	Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)
DG32 automated droplet generator cartridges	Bio Rad	1864108	Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)
Fetal bovine serum	Gibco	10270-106	Qualified fetal bovine serum
Foil plate covers	Bio Rad	1814040	Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)
HEK 293T cells	Takara	632180	Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen
HeLa cells	ECACC	93021013	Human cervix epitheloid carcinoma cells
High glucose DMEM	Gibco	13345364	4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate
Human cybrids	University of Miami
Mouse embryonic fibroblasts	Newcastle University	Immortalized from C57Bl/6 mice
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
PCR plate seals	Pierce	SP-0027	Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)
Pipet Tip Waste Bins	Bio Rad	1864125	Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)
Pipet tips for AutoDG system	Bio Rad	1864120	Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)
Primary human dermal fibroblast cells	Newcastle Biobank
Primers/Probes	IDT	N/A	Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1
Proteinase K 20 mg/mL solution	Ambion	AM2546
PX1 PCR plate sealer	Bio Rad	1814000	Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)
QX Manager software	Bio Rad	12012172	Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7)
QX200 AutoDG droplet generator	Bio Rad	1864101	Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)
QX200 droplet reader	Bio Rad	1864003	Droplet reader (used in Protocol Step 6)
Trizma pre-set crystals pH 8.3	Sigma	T8943-100G