АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол измерения абсолютного числа копий митохондриальной (мт)ДНК и уровней гетероплазмы делеции мтДНК в отдельных клетках.

Аннотация

Митохондриальная (мт)ДНК млекопитающих представляет собой небольшую, круглую, двухцепочечную, внутримитохондриальную молекулу ДНК, кодирующую 13 субъединиц электронной транспортной цепи. В отличие от диплоидного ядерного генома, большинство клеток содержат гораздо больше копий мтДНК, от менее 100 до более чем 200 000 копий в зависимости от типа клетки. Число копий мтДНК все чаще используется в качестве биомаркера для ряда возрастных дегенеративных состояний и заболеваний, и, таким образом, точное измерение числа копий мтДНК становится ключевым инструментом как в исследовательских, так и в диагностических условиях. Мутации в мтДНК, часто встречающиеся в виде однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) или делеций, могут либо существовать во всех копиях мтДНК в клетке (называемые гомоплазмой), либо в виде смеси мутированных и WT-копий мтДНК (называемых гетероплазмой). Гетероплазматические мутации мтДНК являются основной причиной клинической митохондриальной патологии, либо при редких заболеваниях, либо при растущем числе распространенных заболеваний с поздним началом, таких как болезнь Паркинсона. Определение уровня гетероплазмы, присутствующей в клетках, является критическим шагом в диагностике редких митохондриальных заболеваний и в исследованиях, направленных на понимание распространенных поздних расстройств, где митохондрии могут играть определенную роль. Число копий мтДНК и гетероплазма традиционно измерялись с помощью количественных (q)ПЦР-анализов или глубокого секвенирования. Однако недавнее внедрение технологии ddPCR обеспечило альтернативный метод измерения обоих параметров. Он предлагает несколько преимуществ по сравнению с существующими методами, включая возможность измерения абсолютного числа копий мтДНК и достаточную чувствительность для проведения точных измерений из отдельных ячеек даже при низких числах копий. Здесь представлен подробный протокол, описывающий измерение числа копий мтДНК в отдельных клетках с использованием ddPCR, впредь называемой ПЦР капельной генерации, с возможностью одновременного измерения гетероплазмы в клетках с делециями мтДНК. Также обсуждается возможность расширения этого метода для измерения гетероплазмы в клетках с мтДНК SNP.

Введение

Митохондриальная (мт)ДНК млекопитающих представляет собой небольшой (около 16,5 Кб) круговой геном ДНК, находящийся в митохондриальной матрице, которая кодирует 37 генов, включающих две рРНК, 22 тРНК и 13 генов, кодирующих белки1. В отличие от ядерного генома, который содержит одну (гаплоидную) или две (диплоидные) копии каждого гена на клетку, мтДНК присутствует в нескольких копиях в митохондриях каждой клетки, начиная от десятков копий (например, зрелых сперматоцитов) до сотен тысяч копий (например, ооцитов)2,3. Следствием этой многокопийной природы является то, что мутации в геноме мтДНК, которые могут существовать в виде однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), делеций или дупликации, могут присутствовать на различных уровнях в любой данной клетке, составляя от 0% до 100% от общей популяции мтДНК клетки. Существование геномов мтДНК дикого типа и мутантных в одной и той же клетке называется гетероплазмой, а патогенные гетероплазматические мутации мтДНК являются основной причиной митохондриальных заболеваний, с несколькими распространенными неврологическими синдромами, связанными с основными гетероплазматическими мутациями мтДНК4.

Двумя ключевыми параметрами, которые способствуют вероятности гетероплазматической мутации мтДНК, вызывающей клиническое заболевание, являются уровень гетероплазмы и число копий мтДНК. Многие гетероплазматические мутации проявляют пороговый эффект, при этом биохимические и клинические фенотипы становятся очевидными только выше определенного уровня гетероплазмы, обычно около 80%5, и впоследствии ухудшаются по мере увеличения гетероплазмы еще4. Однако также важно учитывать количество копий мтДНК, присутствующих в клетке, поскольку это будет влиять на количество геномов мтДНК дикого типа (то есть «здоровых»), которые присутствуют на данном уровне гетероплазмы. Исследования у пациентов с митохондриальными заболеваниями подчеркнули важность этого взаимодействия между гетероплазмой и номером копии 5,6, а Filograna et al. недавно сообщили об увеличении числа копий мтДНК, облегчающих симптомы, несмотря на неизменную гетероплазму в мышиной модели митохондриального заболевания7.

Хотя в последние годы многое было сделано для улучшения понимания патогенеза и передачи заболеваний, вызванных гетероплазмой мтДНК, большая часть этой работы была проведена на уровне тканей, а не клеток, сравнивая средние уровни гетероплазмы тканей и измерения числа копий, полученные из объемных биопсий тканей и образцов крови. Некоторые хорошо зарекомендовавшие себя методы, такие, как микродиссекция лазерного захвата, позволяют проводить такие измерения на клеточном уровне 8,9; однако недавний взрыв высокопроизводительных одноклеточных методов анализа, или так называемой «одноклеточной омики»10, создал потребность в методах, которые могут точно измерять эти важнейшие параметры мтДНК на уровне одной клетки.

Метод ПЦР капельной генерации использует преимущества последних достижений в области микрофлюидной технологии для улучшения существующих методов количественного определения неизвестных концентраций ДНК с помощью ПЦР-амплификации конкретных целевых ампликонов в образце ДНК11. В отличие от qPCR, где образец ДНК амплифицируется в одной реакции, при этом относительная скорость накопления продукта ПЦР выступает в качестве считывания, этот метод разделяет исходный образец на тысячи отдельных капель, тем самым разделяя молекулы ДНК образца на пространственно разделенные реакции12. Последующая реакция ПЦР протекает в каждой отдельной капле, при этом продукт ПЦР накапливается только в каплях, которые содержат целевую ДНК. Результатом этой реакции является цифровой выход в виде пула капель, которые либо содержат копию целевой ДНК и амплифицированный продукт ПЦР, либо не содержат целевой ДНК. Используя флуоресцентные ДНК-зонды или двухцепочечный (ds)ДНК-связывающий краситель, капли, содержащие амплифицированный продукт, могут быть подсчитаны, а соотношение «положительных» и «отрицательных» капель может быть использовано для расчета абсолютного числа копий ДНК, которые присутствовали в исходном образце. Это абсолютное измерение, в отличие от относительного измерения, полученного в результате реакции qPCR, является ключевым фактором, который позволяет использовать эту методологию для точного измерения числа копий мтДНК и гетероплазмы в отдельных клетках11, и в нескольких недавних исследованиях уже использовалась технология ПЦР капельной генерации для этой цели13,14 . В этой статье представлен метод измерения числа копий мтДНК и гетероплазмы делеции в отдельных клетках как из ткани человека, так и из мыши.

протокол

Все эксперименты соответствовали рекомендациям ARRIVE и были одобрены Этическим обзорным органом благосостояния животных Кембриджского университета (AWERB).

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы пробоподготовки до образования капель должны выполняться в чистой рабочей зоне перед ПЦР, в идеале в УФ-стерилизованном шкафу, где это возможно. Протокол, описанный здесь, использует специальное оборудование для ПЦР для генерации капель (см. Таблицу материалов), и, хотя общий метод должен быть применим к другим системам, рекомендуется ознакомиться с руководящими принципами производителя относительно концентраций праймеров/зондов, условий циклирования ПЦР и т. Д., Поскольку они могут отличаться от описанных здесь. Клеточные линии / первичные клетки, используемые в этом исследовании, были следующими: клетки HeLa человека (коммерчески полученные), человеческие клетки HEK 293T (коммерчески полученные), первичные клетки дермальных фибробластов человека (полученные из биобанка Ньюкасла), человеческие цибриды (WT & ΔH2.1 делеция15, полученная из C. Moraes, Университет Майами), эмбриональные фибробласты мышей (увековеченные, от мышей C57Bl/6, полученные от J. Stewart, Университет Ньюкасла), первичные половые клетки мышей (полученные из эмбрионов мышей C57Bl/6) и мышиные ооциты MII (полученные от взрослых самок мышей C57Bl/6). Все культивируемые клетки поддерживали в ВЫСОКОМ уровне глюкозы (4,5 г / л) DMEM, дополненном 10% фетальной бычьей сывороткой при 37 ° C с 5% CO2. Первичные мышиные клетки, используемые в этом исследовании, были выделены из животных, содержащихся в соответствии с Законом о животных (научные процедуры) 1986 года в соответствии с лицензией проекта Министерства внутренних дел P6C97520A.

1. Разработка и синтез праймеров и зондовых наборов, нацеленных на интересующие последовательности ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР капельной генерации также может быть выполнена с использованием красителя, связывающего dsDNA, вместо ампликонов-специфических зондов.

  1. Проектируйте последовательность грунтовки и зонда в соответствии с рекомендациями, данными производителем системы. В таблице 1 приведены проверенные последовательности праймеров и зондов, пригодные для измерения гетероплазмы 18 копий/делеций мтДНК с одной клеткой мтДНК как в клетках человека 16,17, так и в клетках мыши18. При выборе альтернативных целевых последовательностей учитывайте следующие моменты.
    1. Мультиплексируйте два набора праймеров/зондов в одном ПЦР-анализе, но убедитесь, что в двух анализах используется один зонд с маркировкой FAM и один зонд с маркировкой HEX, чтобы целевые ампликоны могли быть дифференцированы считывателем капель. Этот протокол представляет собой дуплексный зондовый анализ. При тщательном экспериментальном проектировании мультиплексирование может быть увеличено до четырех целей, а альтернативные платформы могут достигать мультиплексирования более высоких размеров.
    2. При мультиплексировании наборов праймеров/зондов, нацеленных на отдельные последовательности мтДНК, убедитесь, что ампликоны, генерируемые двумя наборами праймеров, не перекрываются.
    3. При измерении гетероплазмы в образцах, несущих делеции мтДНК, убедитесь, что один целевой ампликон попадает в ожидаемую удаленную область, а другой - за пределы ожидаемой удаленной области.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные условия циклирования ПЦР для альтернативных анализов могут отличаться от условий, указанных на этапе 5.1; Более подробную информацию об оптимизации анализов см. в разделе Обсуждение.

2. Выделение ДНК из отдельных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод также может быть использован для небольших объемных образцов до 100 клеток.

  1. Собирайте одиночные ячейки с помощью соответствующего метода, такого как флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS)19 или микродиссекция20 лазерного захвата, в как можно меньшем объеме в подходящую емкость (например, пластину с 96 лунками). Использование красителя жизнеспособности клеток до или во время изоляции одной клетки минимизирует вероятность выделения мертвых клеток. При необходимости отсортируйте отдельные ячейки непосредственно в буфер лизиса и храните при -80 °C (до 6 месяцев) до анализа.
  2. Лизируйте клетки в небольшом объеме (<10 мкл) подходящего буфера лизиса (буфер, используемый в данном исследовании, описан на этапе 2.2.1.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные, полученные от клеток в этом исследовании, взяты из одноклеточных лизатов или пулов по 20 клеток (размеры выборки указаны на рисунке условных обозначений). На эффективное формирование масляной/капельной эмульсии на стадии генерации капель протокола ПЦР генерации капель может существенно влиять присутствие моющих средств в образце; поэтому рекомендуется проверить совместимость всех буферов клеточного лизиса с генерацией капель при предполагаемой входной концентрации, прежде чем приступать к экспериментальным образцам и использовать наименьший практический объем буфера лизиса. Следующий протокол лизиса приводит к минимальному влиянию на эффективность генерации капель.
    1. Подготовьте буфер лизиса, содержащий 50 мМ Tris-HCl pH 8,3, 1% TWEEN-20 и 200 мкг/мл протеиназы K.
    2. Добавьте 2,5 мкл лизизного буфера к каждому образцу, запечатайте пластину клейкой пластиной, а затем центрифугируйте образцы при 1000 х г в течение 1 мин при 4 °C.
    3. Инкубируйте образцы при 37 °C в течение 30 мин на термоциклере с нагретой крышкой, установленной при 105 °C, чтобы предотвратить конденсацию жидкости на крышке пластины.
    4. Добавьте 7,5 мкл воды без нуклеазы к каждому образцу, чтобы получить окончательный объем образца 10 мкл, повторно запечатайте пластину, а затем центрифугируйте образцы при 1000 х г в течение 1 мин при 4 °C.
    5. Инкубировать на термоциклере при 80 °C в течение 15 мин (нагретая крышка установлена на 105 °C) для инактивации протеиназы K.
    6. Центрифугируйте образцы при 1000 х г в течение 1 мин при 4 °C, а затем держите на льду.
  3. Перейдите к шагу 3 ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные лизаты можно хранить при -20 °C до продолжения этапа 3; однако используйте свежеэлюрованную ДНК, где это возможно, чтобы устранить риск циклов замораживания-оттаивания, приводящих к деградации ДНК.

3. Подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что технические реплики образцов и нешаблонные элементы управления (NTC) включены на каждую пробирную пластину для обеспечения точности результатов. Динамический диапазон ПЦР-анализа капельной генерации составляет до 120 000 копий целевого ампликона на реакцию. Для одноклеточных или небольших объемно-клеточных лизатов образца разбавление вряд ли потребуется, и смесь лизата может быть введена непосредственно в реакцию для измерения числа копий мтДНК (например, образец лизата объемом 10 мкл может быть разделен и запущен в трипликате с входом 3 мкл непосредственно в каждый анализ). Однако использование неразбавленного лизата из клеток с очень высоким количеством мтДНК (например, ооцитов) или содержащих большее количество клеток (например, 50-100) может превышать этот динамический диапазон. В таких случаях требуется первоначальное последовательное разбавление для определения соответствующего коэффициента разбавления, который позволяет избежать насыщения анализа для этого конкретного типа ячейки /номера ячейки (см. Репрезентативные результаты для получения дополнительной информации).

  1. Разморозьте все реагенты на льду, вихрь и ненадолго открутите перед использованием.
  2. Приготовьте мастер-микс (за вычетом образца ДНК) на льду, как описано в (таблица 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если измеряется только один целевой ампликон, добавьте дополнительно 2,55 мкл воды без нуклеазы на образец для достижения конечного объема 22 мкл. Подготовьте достаточную мастер-смесь для количества образцов и НТК, подлежащих анализу, плюс достаточно, чтобы учесть любые «пустые» скважины, необходимые на ПЦР-пластине поколения капель (см. следующий шаг).
  3. Вихрь приготовленной мастер-смеси кратковременно перемешать и аликвотировать необходимый объем (22 мкл минус входной объем ДНК) в каждую лунку капли поколения ПЦР 96-луночной пластины. Расположите образцы в полных колоннах на 96-луночной плите; заполните любые пустые скважины в неполные колонны мастер-миксом и используйте их в качестве НТК.
  4. Добавьте входную ДНК в каждую пробную скважину и буфер воды/элюирования без нуклеаз в скважины NTC, чтобы довести общий объем каждой из них до 22 мкл.
  5. Запечатайте пластину клейким уплотнением пластины и поместите на шейкер при 2000 об/мин в течение 1 мин, а затем центрифугу при 1000 х г в течение одной минуты при 4 °C.
  6. Положите тарелку на лед и перейдите к шагу 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленные пластины можно хранить на льду и защищать от света в течение коротких периодов времени (например, 1-2 ч), прежде чем приступать к образованию капель.

4. Генерация капель

ПРИМЕЧАНИЕ: Схему приборной деки генератора капель, упомянутой в этом разделе, приведена на рисунке 1А .

  1. Питание от капельного генератора.
  2. Убедитесь, что бутылка каплеобразующего масла загружена в положение E на палубе прибора. При появлении запроса следуйте инструкциям на экране, чтобы заменить бутылку.
  3. Щелкните Настроить образец пластины на сенсорном экране. Выберите все столбцы на пластине образца, содержащие образцы/заготовки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ввод названия пластины и деталей эксперимента на этом этапе является необязательным и не требуется для продолжения настройки эксперимента.
  4. Нажмите кнопку ОК , чтобы подтвердить конфигурацию пластины; на палубе приборов загораются оранжевые огни, указывающие места, где необходимо загрузить расходные материалы.
  5. Загрузите картриджи генератора капель в положение B на приборной палубе так, чтобы все огни загорелись зеленым.
  6. Поместите пустой желоб для отходов наконечника в положение C на палубе приборов.
  7. Снимите крышки с фильтрующих наконечников и загрузите их в положение D на сцене прибора, чтобы все индикаторы стали зелеными.
  8. Снимите уплотнение клейкой пластины с пластины образца и загрузите его в положение F на палубе прибора, чтобы индикатор стал зеленым.
  9. Поместите пустую пластину для сбора капель из 96 лунок в холодный блок (предварительно охлажденный при -20 °C) и загрузите в положение G приборной палубы так, чтобы свет стал зеленым.
  10. Нажмите кнопку Начать генерацию дроплетов на сенсорном экране прибора.
  11. Нажмите кнопку Начать запуск на сенсорном экране прибора. Крышка прибора закроется автоматически. После инициализации время, оставшееся до завершения генерации капель, будет отображаться на сенсорном экране прибора.
  12. После завершения генерации капель визуально проверьте пластину сбора проб, чтобы подтвердить, что слой капельной эмульсии присутствует над масляной фазой в каждой скважине (рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если слой капельной эмульсии не виден, не приступайте к эксперименту и не проверяйте наличие ошибок, которые могли возникнуть во время предыдущих шагов протокола.
  13. Очистите использованные расходные материалы от инструментальной палубы и опорожните желоб для отходов наконечников.
  14. Включите герметик пластины, установите температуру на 180 °C и время уплотнения на 5 с, и позвольте машине достичь рабочей температуры.
  15. Поместите пластину для сбора проб в держатель пластины герметика и поместите свежее фольгированное уплотнение поверх пластины с красной линией, обращенной вверх. Следите за тем, чтобы не касаться нижней стороны уплотнения из фольги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель пластины следует хранить при комнатной температуре (RT) и помещать в ящик уплотнителя пластин только при нанесении фольгированного уплотнения для предотвращения теплопередачи на пластину для сбора проб.
  16. Когда уплотнитель пластины достигнет рабочей температуры, нажмите Eject на сенсорном экране прибора; ящик откроется автоматически.
  17. Поместите держатель пластины в ящик уплотнителя пластины и нажмите Seal. Ящик автоматически закроется, а затем снова откроется после завершения запечатывания.
  18. Замените герметичную пластину на холодном блоке, выключите герметик пластины и немедленно перейдите к шагу 5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе капли нестабильны, поэтому убедитесь, что этап ПЦР начинается в течение 1 ч после окончания генерации капель.

5. ПЦР

  1. Поместите герметичную пластину для сбора капель на циклический аппарат ПЦР, оснащенный блоком скважины глубиной 96, и запустите протокол термоциклирования, описанный в таблице 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите температуру нагретой крышки на уровне 105 °C и объем образца на 40 мкл. Этапы денатурации и отжига/удлинения должны включать температурную скорость 2 °C/с, чтобы гарантировать, что масло успевает уравновешиваться до правильной температуры.
  2. Перейдите к шагу 6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения протокола термоциклирования капли становятся более стабильными, и пластину можно хранить до 4 дней при 4 °C, прежде чем приступить к следующему шагу.

6. Считывание капель

  1. Включите устройство считывания капель и подключенный компьютер.
  2. Проверьте уровень жидкости в бутылках для сливочного масла и капельного считывателя и заполните/опорожните их, соответственно, если это необходимо.
  3. Загрузите пластину, содержащую образцы после ПЦР, в держатель капельного считывателя, поместите крышку поверх держателя и закрепите ее на месте черными зажимами. Не снимайте крышку из фольги с пластины для образца.
  4. Нажмите кнопку «Открыть/Закрыть» на крышке устройства считывания капель, чтобы открыть его.
  5. Загрузите держатель пластины капельного считывателя, содержащий пластину образца, в камеру считывания и надежно расположите его на магнитном основании.
  6. Нажмите кнопку Открыть/Закрыть на крышке устройства считывания капель, чтобы закрыть его.
  7. Откройте интерфейс аналитического программного обеспечения, выберите вкладку Добавить пластину и подготовьте новый образец пластины следующим образом:
    1. Нажмите кнопку Добавить пластину , а затем Настроить пластину.
    2. На вкладке Информация о пластине введите Имя пластины, выберите Супермикс для зондов (без dUTP) в раскрывающемся меню Супермикс и введите имя файла в разделе Сохранить файл данных как.
    3. На вкладке Выбор скважин выделите анализируемые скважины и нажмите Включить выбранные скважины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 6.7.4 – 6.7.7 являются факультативными.
    4. На вкладке Информация о скважине выберите скважины для аннотирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример интерфейса вкладки «Информация о скважине» приведен на рисунке 1D.
    5. Выберите «Прямая количественная оценка» (DQ) в раскрывающемся меню «Тип эксперимента », заполните поля «Описание образца», «Тип образца» и «Имя цели» и при необходимости добавьте «Заметки о скважине» и/или «Заметки на пластине ».
    6. Нажмите кнопку Применить. Информация на месторождениях будет применена к выбранным скважинам.
    7. Повторяйте шаги 6.7.4–6.7.6 до тех пор, пока все пробные колодцы не будут аннотированы.
  8. После завершения настройки пластины нажмите кнопку Начать запуск.
  9. Когда запуск будет завершен, выбросьте пустую пластину для образца и при необходимости опорожните бутылку для считывателя капель.
  10. Перейдите к шагу 7.

7. Анализ результатов

ПРИМЕЧАНИЕ: Считыватель капель измеряет интенсивность флуоресценции в канале FAM и HEX для каждой капли в образце. При успешном анализе капли попадают в одну из двух категорий для каждого зонда: отрицательные (это означает, что мишень не присутствовала в капле) или положительные (то есть мишень присутствовала в капле). Перед анализом образцов убедитесь, что каждая скважина содержит >10 000 капель и имеет две четко разделенные популяции капель с низкой флуоресценцией (отрицательной) и высокой флуоресценцией (положительной) в каждом канале (рисунок 2А).

  1. Выберите вкладку Анализ данных и откройте файл для анализа в меню Мои файлы данных .
  2. Перейдите на вкладку «Амплитуда 1D» для одноцветных экспериментов или вкладку «Амплитуда 2D » для двухцветных экспериментов.
  3. Примените порог флуоресценции к каждому каналу, чтобы дифференцировать положительные и отрицательные капли. Аналитическое программное обеспечение попытается применить автоматическое пороговое значение на основе выборки за выборкой и канала за каналом, но если это окажется неудачным или выглядит неточным, то вручную примените пороговое значение следующим образом:
    1. Выберите скважины, требующие пороговых значений.
    2. Вручную примените пороговое значение в свободном пространстве между положительной и отрицательной популяциями на амплитудном графике с помощью инструмента «Режим пороговой линии ». При установке ручных пороговых значений в 2D-представлении убедитесь, что перекрестие расположено так, чтобы четыре популяции капель (двойная отрицательная, одинарная положительная FAM, одинарная положительная HEX и двойная положительная) были четко разделены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговое значение может быть выполнено либо хорошо, либо применено к нескольким скважинам одновременно.
  4. После того, как ко всем образцам будет применено пороговое значение, экспортируйте результаты в виде файла .csv для дальнейшего анализа, щелкнув вкладку Таблица данных , щелкнув Импорт/Экспорт и выбрав Экспорт видимых данных в CSV. Введите подходящее имя файла и нажмите кнопку Сохранить.
  5. Рассчитайте номер копии мтДНК в исходном образце следующим образом:
    Число копий = целевая концентрация мтДНК × 22 × 1/доля от общего поступления лизата
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если используются два митохондриальных зонда, то концентрация двух мишеней усредняется перед проведением расчета. Для образцов, содержащих более одной ячейки, число копий на ячейку вычисляется путем деления на количество ячеек в образце. Важно использовать значение «Концентрация» (т.е. количество копий на микролитр), умноженное на начальный объем образца в 22 мкл, а не значение «Количество копий на 20 мкл», рассчитанное в файле .csv, поскольку копии мтДНК, оставленные при превышении 2 мкл, требуемом генератором капель, должны учитываться при расчете абсолютного числа копий исходного образца.
  6. Для клеток, несущих гетероплазматические делеции мтДНК, рассчитайте число копий, используя результаты мишени мтДНК за пределами удаленной области (т.е. мишень, присутствующую как в удаленных, так и в WT молекулах мтДНК). Гетероплазма делеции рассчитывается с использованием концентраций мишени внутри удаленной области и цели вне удаленной области следующим образом:
    figure-protocol-20177

Результаты

После генерации капель виден прозрачный слой непрозрачных капель, плавающих поверх нефтяной фазы в каждой скважине (рисунок 1B). На образование капель может негативно повлиять наличие моющих средств во входном лизате при проведении экспериментов на одиночных клетках. И...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, применим к широкому кругу типов клеток и видов в дополнение к тем, которые обсуждались выше, хотя тщательная оптимизация новых конструкций анализов будет иметь ключевое значение для обеспечения точности и повторяемости метода при отходе от ранее проверенных...

Раскрытие информации

Отсутствие конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Благодарим доктора Л. Божилову за советы по статистическому анализу данных ПЦР капельной генерации. Спасибо доктору Х. Чжану за предоставление ооцитов, используемых для генерации данных на рисунках 3C и 4B. Эта работа была выполнена SPB в Отделе митохондриальной биологии Совета по медицинским исследованиям (MC_UU_00015/9 Кембриджского университета и финансировалась Главной исследовательской стипендией Wellcome Trust, проводимой PFC (212219/ Z / 18 / Z).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
50% Tween-20 solutionNovex3005
Automated droplet-generating oil Bio Rad1864110Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)
C1000 PCR machine with deep-well blockBio Rad1851197PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)
Collection plate cooling blockBio Rad12002819Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)
ddPCR 96-well plates Bio Rad1200192596-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)
ddPCR droplet reader oil Bio Rad1863004Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)Bio Rad1863023Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)
DG32 automated droplet generator cartridges Bio Rad1864108Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)
Fetal bovine serumGibco10270-106Qualified fetal bovine serum
Foil plate covers Bio Rad1814040Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)
HEK 293T cellsTakara632180Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen
HeLa cellsECACC93021013Human cervix epitheloid carcinoma cells
High glucose DMEMGibco133453644.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate
Human cybridsUniversity of Miami
Mouse embryonic fibroblasts Newcastle UniversityImmortalized from C57Bl/6 mice
Nuclease-free waterAmbionAM9937
PCR plate sealsPierceSP-0027Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)
Pipet Tip Waste BinsBio Rad1864125Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)
Pipet tips for AutoDG system Bio Rad1864120Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)
Primary human dermal fibroblast cellsNewcastle Biobank
Primers/ProbesIDTN/AExact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1
Proteinase K 20 mg/mL solutionAmbionAM2546
PX1 PCR plate sealerBio Rad1814000Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)
QX Manager softwareBio Rad12012172Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7)
QX200 AutoDG droplet generatorBio Rad1864101Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)
QX200 droplet readerBio Rad1864003Droplet reader (used in Protocol Step 6)
Trizma pre-set crystals pH 8.3SigmaT8943-100G

Ссылки

  1. Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
  2. Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).
  3. D'Erchia, A. M., et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity. Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).
  4. Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
  5. Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G. American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).
  6. Liu, H., et al. Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases. PloS One. 8 (6), 67146 (2013).
  7. Filograna, R., et al. Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse. Science Advances. 5 (4), (2019).
  8. Wang, Y., et al. The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues. Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).
  9. Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF). American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).
  10. Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
  11. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
  12. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  13. Herbst, A., et al. Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).
  14. O'Hara, R., et al. Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution. Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).
  15. Diaz, F., et al. Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).
  16. Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells. Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).
  17. Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis. Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).
  18. Perier, C., et al. Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms. Brain. 136, 2369-2378 (2013).
  19. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
  20. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
  21. Cree, L. M., et al. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes. Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).
  22. Belmonte, F. R., et al. Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions. Scientific Reports. 6, 25186 (2016).
  23. Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. Two direct repeats cause most human mtDNA deletions. Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).
  24. Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation. Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).
  25. Macaulay, I. C., et al. Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq. Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).
  26. Ludwig, L. S., et al. Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics. Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).
  27. Rooney, J. P., et al. PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species. Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).
  28. Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression. Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).
  29. Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).
  30. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18 (4), (2018).
  31. Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane. ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).
  32. Li, Z., et al. Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care. Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены