Medindo o Número de Cópias de DNA Mitocondrial de Célula Única e a Heteroplasmia Usando a Reação em Cadeia da Polimerase de Gotículas Digitais

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para medir o número absoluto de cópias mitocondriais (mt)DNA e os níveis de heteroplasmia de deleção do mtDNA em células únicas.

Resumo

O DNA mitocondrial (mt) de mamíferos é uma molécula de DNA intramitocondrial pequena, circular, de fita dupla, que codifica 13 subunidades da cadeia de transporte de elétrons. Ao contrário do genoma nuclear diploide, a maioria das células contém muito mais cópias de mtDNA, variando de menos de 100 a mais de 200.000 cópias, dependendo do tipo de célula. O número de cópias do mtDNA é cada vez mais usado como um biomarcador para uma série de condições degenerativas e doenças relacionadas à idade e, portanto, a medição precisa do número de cópias do mtDNA está se tornando uma ferramenta fundamental em ambientes de pesquisa e diagnóstico. Mutações no mtDNA, muitas vezes ocorrendo como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou deleções, podem existir em todas as cópias do mtDNA dentro da célula (denominada homoplasmia) ou como uma mistura de cópias de mtDNA mutadas e WT (denominadas heteroplasmia). As mutações heteroplasmáticas do mtDNA são uma das principais causas de patologia mitocondrial clínica, seja em doenças raras ou em um número crescente de doenças comuns de início tardio, como a doença de Parkinson. Determinar o nível de heteroplasmia presente nas células é um passo crítico no diagnóstico de doenças mitocondriais raras e em pesquisas destinadas a entender distúrbios comuns de início tardio em que as mitocôndrias podem desempenhar um papel. O número de cópias de mtDNA e a heteroplasmia têm sido tradicionalmente medidos por ensaios quantitativos baseados em (q)PCR ou sequenciamento profundo. No entanto, a recente introdução da tecnologia ddPCR forneceu um método alternativo para medir ambos os parâmetros. Ele oferece várias vantagens em relação aos métodos existentes, incluindo a capacidade de medir o número absoluto de cópias de mtDNA e sensibilidade suficiente para fazer medições precisas de células individuais, mesmo com números de cópia baixos. Apresentamos aqui um protocolo detalhado que descreve a medição do número de cópias de mtDNA em células individuais usando ddPCR, referido como PCR de geração de gotículas doravante, com a opção de medição simultânea de heteroplasmia em células com deleções de mtDNA. A possibilidade de expandir este método para medir a heteroplasmia em células com SNPs de mtDNA também é discutida.

Introdução

O DNA mitocondrial (mt) de mamíferos é um genoma de DNA circular pequeno (aprox. 16,5 Kb) que reside na matriz mitocondrial que codifica 37 genes, compreendendo dois rRNAs, 22 tRNAs e 13 genes codificadores de proteínas¹. Ao contrário do genoma nuclear, que contém uma (haploide) ou duas cópias (diploide) de cada gene por célula, o mtDNA está presente em múltiplas cópias nas mitocôndrias de cada célula, variando de dezenas de cópias (por exemplo, espermatócitos maduros) a centenas de milhares de cópias (por exemplo, ovócitos)^2,3. Uma consequência dessa natureza multi-cópia é que mutações no genoma do mtDNA, que podem existir como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), deleções ou duplicações, podem estar presentes em níveis variados em qualquer célula, compondo de 0% a 100% da população total de mtDNA da célula. A existência de genomas de mtDNA do tipo selvagem e mutante na mesma célula é denominada heteroplasmia, e mutações patogênicas heteroplasmáticas de mtDNA são uma das principais causas de doença mitocondrial, com várias síndromes neurológicas comuns ligadas a mutações heteroplasmáticas de mtDNA subjacentes⁴.

Dois parâmetros-chave que contribuem para a probabilidade de uma mutação heteroplasmática do mtDNA causar doença clínica são o nível de heteroplasmia e o número de cópias do mtDNA. Muitas mutações heteroplasmáticas apresentam um efeito limiar, com fenótipos bioquímicos e clínicos apenas se tornando aparentes acima de um certo nível de heteroplasmia, tipicamente em torno de 80%⁵, e subsequentemente piorando à medida que a heteroplasmia aumenta ainda mais⁴. No entanto, também é importante considerar o número de cópias de mtDNA presentes na célula, pois isso influenciará o número de genomas de mtDNA do tipo selvagem (ou seja, "saudáveis") que estão presentes em um determinado nível de heteroplasmia. Estudos em pacientes com doença mitocondrial destacaram a importância dessa interação entre heteroplasmia e número de cópia^5,6, e Filograna et al. relataram recentemente um aumento no número de cópias de mtDNA aliviando os sintomas^, apesar da heteroplasmia inalterada em um modelo de camundongo de doença mitocondrial⁷.

Embora muito tenha sido feito nos últimos anos para melhorar a compreensão da patogênese e transmissão de doenças causadas pela heteroplasmia do mtDNA, a maior parte deste trabalho foi conduzida no nível de tecidos e não de células, comparando os níveis médios de heteroplasmia tecidual e as medições do número de cópias adquiridas a partir de biópsias de tecido a granel e amostras de sangue. Algumas técnicas bem estabelecidas, como a microdissecção por captura a laser, permitem tais medidas em nível celular ^8,9; no entanto, a recente explosão de métodos de análise de célula única de alto rendimento, ou os chamados "Umics de célula única"¹⁰, criou um requisito para métodos que possam medir com precisão esses parâmetros cruciais do mtDNA no nível de célula única.

O método de PCR de geração de gotículas aproveita os recentes avanços na tecnologia microfluídica para melhorar os métodos existentes de quantificação de concentrações de DNA desconhecidas por meio da amplificação por PCR de amplificadores alvo específicos no DNA da amostra¹¹. Ao contrário da qPCR, em que o DNA da amostra é amplificado em uma única reação, com a taxa relativa de acumulação do produto da PCR atuando como a leitura, esse método divide a amostra inicial em milhares de gotículas individuais, compartimentando assim as moléculas de DNA da amostra em reações espacialmente separadas¹². A reação de PCR subsequente prossegue em cada gota individual, com o produto de PCR se acumulando apenas em gotículas que contêm o DNA alvo. O resultado dessa reação é uma saída digital na forma de um conjunto de gotículas que contêm uma cópia do DNA alvo e do produto de PCR amplificado ou não contêm o DNA alvo. Usando sondas de DNA fluorescentes ou um corante de ligação de DNA de fita dupla (ds), as gotículas contendo produto amplificado podem ser contadas, e a proporção de gotículas "positivas" para "negativas" pode ser usada para calcular o número absoluto de cópias de DNA que estavam presentes na amostra inicial. Essa medida absoluta, em oposição à medida relativa adquirida a partir de uma reação de qPCR, é o fator-chave que permite que essa metodologia seja utilizada para a mensuração precisa do número de cópias de mtDNA e da heteroplasmia em células isoladas¹¹, e vários estudos recentes já utilizaram a tecnologia de PCR de geração de gotículas para esse fim^13,14 . Este artigo apresenta um método para medir o número de cópias de mtDNA e a heteroplasmia de deleção em células individuais de tecidos humanos e de camundongos.

Protocolo

Todos os experimentos seguiram as diretrizes do ARRIVE e foram aprovados pelo Corpo de Revisão Ética do Bem-Estar Animal da Universidade de Cambridge (AWERB).

NOTA: Todas as etapas de preparação da amostra antes da geração de gotículas devem ser realizadas em uma área de trabalho pré-PCR limpa, idealmente em um gabinete esterilizado por UV, sempre que possível. O protocolo descrito aqui usa equipamentos específicos de PCR de geração de gotículas (consulte Tabela de Materiais) e, embora o método geral deva ser aplicável a outros sistemas, recomenda-se consultar as diretrizes do fabricante sobre as concentrações de primer/sonda, condições de ciclo de PCR, etc., pois elas podem diferir daquelas descritas aqui. As linhagens celulares/células primárias utilizadas neste estudo foram: células HeLa humanas (obtidas comercialmente), células HEK 293T humanas (obtidas comercialmente), células fibroblásticas dérmicas humanas primárias (obtidas do Newcastle Biobank), cibridas humanas (WT & ΔH2.1 deletion¹⁵, obtidas de C. Moraes, Universidade de Miami), fibroblastos embrionários de camundongos (imortalizados, de camundongos C57Bl/6, obtidos de J. Stewart, Universidade de Newcastle), células germinativas primordiais de camundongos (obtidas a partir de embriões de camundongos C57Bl/6) e oócitos MII de camundongos (obtidos de camundongos adultos C57Bl/6). Todas as células cultivadas foram mantidas em DMEM de Alta Glicose (4,5g/L) suplementado com soro fetal bovino a 10% a 37 °C com CO_{2 a} 5%. As células primárias de camundongos usadas neste estudo foram isoladas de animais mantidos de acordo com a Lei Animal (Procedimentos Científicos) de 1986 sob a Licença de Projeto do Home Office P6C97520A.

1. Projetar e sintetizar conjuntos de primer e sonda visando sequências de DNA de interesse

NOTA: A PCR de geração de gotículas também pode ser realizada usando um corante de ligação dsDNA no lugar das sondas específicas do amplificador.

1. Projete as sequências do primer e da sonda de acordo com as diretrizes dadas pelo fabricante do sistema. Sequências validadas de primer e sonda adequadas para medir o número de cópias/heteroplasmia de deleção de mtDNA de célula única em células^{humanas 16,17} e¹⁸ de camundongos são fornecidas na Tabela 1. Ao selecionar sequências de destino alternativas, considere os seguintes pontos.
   1. Multiplexe dois conjuntos de primer/sonda em um único ensaio de PCR, mas certifique-se de que os dois ensaios utilizem uma sonda rotulada como FAM e uma sonda marcada com HEX, de modo que os amplificadores de destino possam ser diferenciados pelo leitor de gotículas. Este protocolo apresenta um ensaio de sonda duplex. Com um design experimental cuidadoso, a multiplexação pode ser aumentada em até quatro alvos, e plataformas alternativas podem alcançar multiplexação de maior dimensão.
   2. Ao multiplicar conjuntos de primer/sonda visando sequências separadas de mtDNA, certifique-se de que os amplificadores gerados pelos dois conjuntos de primer não se sobreponham.
   3. Ao medir a heteroplasmia em amostras que carregam deleções de mtDNA, certifique-se de que um amplificador alvo esteja dentro da região excluída esperada e o outro esteja fora da região excluída esperada.
      NOTA: As condições ideais de ciclo de PCR para ensaios alternativos podem diferir das citadas na Etapa 5.1; consulte a Discussão para obter mais detalhes sobre a otimização do ensaio.

2. Isolamento do ADN de células individuais

NOTA: Este método também pode ser usado para pequenas amostras a granel de até 100 células.

1. Colete células individuais usando um método apropriado, como a Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS)¹⁹ ou a microdissecção de captura a laser²⁰, em um volume tão pequeno quanto possível em um recipiente adequado (por exemplo, placa de 96 poços). O uso de um corante de viabilidade celular antes ou durante o isolamento unicelular minimizará a probabilidade de isolar células mortas. Ordenar as células individuais directamente em tampão de lise, se desejado, e conservar a -80 °C (até 6 meses) antes da análise.
2. Lise as células num pequeno volume (<10 μL) de um tampão de lise adequado (o tampão utilizado neste estudo é descrito no passo 2.2.1.).
   NOTA: Todos os dados obtidos a partir de células neste estudo são de lisados unicelulares ou pools de 20 células (os tamanhos das amostras são estipulados nas legendas das figuras). A formação eficiente de uma emulsão de óleo/gotícula durante a etapa de geração de gotículas do protocolo de PCR de geração de gotículas pode ser significativamente afetada pela presença de detergentes na amostra; portanto, recomenda-se validar a compatibilidade de todos os buffers de lise celular com a geração de gotículas na concentração de entrada pretendida antes de prosseguir com amostras experimentais e usar o menor volume prático de tampão de lise. O protocolo de lise a seguir resulta em um impacto mínimo na eficiência da geração de gotículas.
   1. Preparar o tampão de lise contendo 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 1% TWEEN-20 e 200 μg/mL de proteinase K.
   2. Adicionar 2,5 μL do tampão de lise a cada amostra, selar a placa com uma vedação da placa adesiva e, em seguida, centrifugar as amostras a 1.000 x g durante 1 min a 4 °C.
   3. Incubar as amostras a 37 °C durante 30 min no termociclador com a tampa aquecida regulada a 105 °C para evitar a condensação do líquido na tampa da placa.
   4. Adicionar 7,5 μL de água isenta de nuclease a cada amostra para obter um volume final de amostra de 10 μL, selar novamente a placa e, em seguida, centrifugar as amostras a 1.000 x g durante 1 min a 4 °C.
   5. Incubar no termociclador a 80 °C durante 15 min (tampa aquecida regulada para 105 °C) para inactivar a proteinase K.
   6. Centrifugar as amostras a 1 000 x g durante 1 min a 4 °C e, em seguida, manter no gelo.
3. Prossiga para a etapa 3 abaixo.
   NOTA: Os lisados celulares podem ser armazenados a -20 °C antes de continuar com o passo 3; no entanto, use DNA recém-eluído sempre que possível para eliminar o risco de ciclos de congelamento-descongelamento que resultem em degradação do DNA.

3. Preparação das amostras

NOTA: Certifique-se de que as replicações técnicas de amostras e os controles não-modelo (NTCs) sejam incluídos em cada placa de ensaio para garantir a precisão dos resultados. A faixa dinâmica do ensaio de PCR de geração de gotículas é de até 120.000 cópias do amplificador alvo por reação. Para lisados de amostra de célula única ou de células a granel pequenas, é improvável que a diluição seja necessária, e a mistura de lisado pode ser inserida diretamente na reação para a medição do número de cópias de mtDNA (por exemplo, uma amostra de lisado de 10 μL pode ser dividida e executada em triplicado com entrada de 3 μL diretamente em cada ensaio). No entanto, o uso de lisado não diluído de células com números de mtDNA de cópia muito altos (por exemplo, ovócitos) ou contendo um número maior de células (por exemplo, 50-100) pode exceder essa faixa dinâmica. Nesses casos, é necessária uma diluição em série inicial para identificar um fator de diluição adequado que evite a saturação do ensaio para esse tipo/número de célula específico (ver Resultados representativos para mais pormenores).

1. Descongele todos os reagentes no gelo, vórtice e gire para baixo brevemente antes do uso.
2. Preparar a mistura principal (menos o ADN da amostra) no gelo, conforme descrito na (Tabela 2).
   NOTA: Se apenas um amplificador alvo estiver sendo medido, adicione mais 2,55 μL de água livre de nuclease por amostra para atingir o volume final de 22 μL. Prepare uma mistura mestra suficiente para o número de amostras e NTCs a serem analisados, além do suficiente para contabilizar quaisquer poços "em branco" necessários na placa de PCR de geração de gotículas (veja a próxima etapa).
3. Vórtice a mistura mestra preparada brevemente para misturar e alíquota o volume necessário (22 μL menos o volume de DNA de entrada) em cada poço de uma placa de 96 poços de geração de gotículas. Organizar as amostras em colunas completas na placa de 96 poços; preencha quaisquer poços vazios em colunas incompletas com master mix e use-os como NTCs.
4. Adicione o DNA de entrada a cada poço de amostra e o tampão de água/eluição livre de nuclease aos poços NTC para aumentar o volume total de cada um até 22 μL.
5. Selar a placa com uma vedação de placa adesiva e colocar num agitador a 2.000 rpm durante 1 min e, em seguida, centrifugar a 1.000 x g durante um minuto a 4 °C.
6. Coloque a placa no gelo e prossiga para o Passo 4.
   NOTA: As placas preparadas podem ser armazenadas no gelo e protegidas da luz por curtos períodos de tempo (por exemplo, 1-2 h) antes de prosseguir com a geração de gotículas.

4. Geração de gotículas

NOTA: Consulte a Figura 1A para obter o esquema do conjunto de instrumentos do gerador de gotículas referenciado nesta seção.

1. Ligue o gerador de gotículas.
2. Verifique se uma garrafa de óleo gerador de gotículas está carregada para posicionar E do convés de instrumentos. Se solicitado, siga as instruções na tela para substituir a garrafa.
3. Clique em Configurar Placa de Amostra na tela sensível ao toque. Selecione todas as colunas na placa de amostra que contenham amostras/espaços em branco.
   NOTA: A entrada do nome da placa e dos detalhes do experimento nesta etapa é opcional e não é necessária para continuar a configuração do experimento.
4. Clique em OK para confirmar a configuração da placa; luzes laranja se acenderão no convés de instrumentos para indicar as posições onde os consumíveis precisam ser carregados.
5. Carregue os cartuchos do gerador de gotículas na posição B no convés de instrumentos para que todas as luzes fiquem verdes.
6. Coloque uma calha de resíduos de ponta vazia na posição C no convés de instrumentos.
7. Remova as tampas das caixas de ponta do filtro e carregue para a posição D no palco do instrumento para que todas as luzes fiquem verdes.
8. Remova o selo da placa adesiva da placa de amostra e carregue para a posição F do convés de instrumentos para que a luz fique verde.
9. Coloque uma placa vazia de coleta de gotículas de 96 poços em um bloco frio (pré-resfriado a -20 °C) e carregue na posição G do painel de instrumentos para que a luz fique verde.
10. Clique em Iniciar geração de gotículas na tela sensível ao toque do instrumento.
11. Clique em Iniciar execução na tela sensível ao toque do instrumento. A tampa do instrumento fechará automaticamente. Após a inicialização, o tempo restante até que a geração de gotículas seja concluída será exibido na tela sensível ao toque do instrumento.
12. Quando a geração de gotículas estiver concluída, verifique visualmente a placa de coleta de amostras para confirmar que uma camada de emulsão de gotículas está presente acima da fase de óleo em cada poço (Figura 1B).
    NOTA: Se uma camada de emulsão de gotículas não estiver visível, não prossiga com o experimento e verifique se há erros que possam ter ocorrido durante as etapas anteriores do protocolo.
13. Limpe os consumíveis usados do convés de instrumentos e esvazie a calha de resíduos de ponta.
14. Ligue o selador de placas, ajuste a temperatura para 180 °C e o tempo de vedação para 5 s e permita que a máquina atinja a temperatura de operação.
15. Coloque a placa de coleta de amostras no suporte da placa seladora da placa e coloque uma nova vedação de folha em cima da placa com a linha vermelha voltada para cima. Tome cuidado para não tocar na parte inferior do selo da folha.
    NOTA: O suporte da placa deve ser armazenado à temperatura ambiente (RT) e colocado apenas na gaveta do selador de placas quando um selo de folha estiver sendo aplicado para evitar a transferência de calor para a placa de coleta de amostras.
16. Quando o selador de placas atingir a temperatura de funcionamento, pressione Ejetar na tela sensível ao toque do instrumento; a gaveta será aberta automaticamente.
17. Coloque o suporte da placa na gaveta da seladora de placas e pressione Seal. A gaveta fechará automaticamente e, em seguida, abrirá novamente assim que a vedação estiver concluída.
18. Substitua a placa selada no bloco frio, desligue o selador de placas e prossiga imediatamente para a Etapa 5.
    NOTA: Nesta fase, as gotículas são instáveis, portanto, certifique-se de que a etapa de PCR seja iniciada dentro de 1 h após o término da geração de gotículas.

5. PCR

1. Coloque a placa de coleta de gotículas selada em um ciclador de PCR equipado com um bloco de poço de 96 profundidades e execute o protocolo de ciclagem térmica descrito na Tabela 3.
   NOTA: Defina a temperatura da tampa aquecida para 105 °C e o volume da amostra para 40 μL. As etapas de desnaturação e recozimento/extensão devem incluir uma taxa de rampa de temperatura de 2 °C/s para garantir que o óleo tenha tempo para se equilibrar até a temperatura correta.
2. Prossiga para a Etapa 6.
   NOTA: Uma vez que o protocolo de ciclagem térmica esteja completo, as gotículas ficam mais estáveis e a placa pode ser armazenada por até 4 dias a 4 °C antes de prosseguir com a próxima etapa.

6. Leitura de gotículas

1. Ligue o leitor de gotículas e o computador conectado.
2. Verifique os níveis de fluido nos frascos de resíduos do leitor de gotas e do leitor de gotas e preencha-os/esvazie-os, respectivamente, se necessário.
3. Carregue a placa que contém as amostras pós-PCR no suporte da placa leitora de gotículas, coloque a tampa em cima do suporte e prenda-a no lugar com os clipes de travamento pretos. Não retire a tampa da folha da placa de amostragem.
4. Pressione o botão Abrir/Fechar na tampa do leitor de gotículas para abri-lo.
5. Carregue o suporte da placa leitora de gotículas que contém a placa de amostra na câmara leitora e localize-a firmemente na base magnética.
6. Pressione o botão Abrir/Fechar na tampa do leitor de gotículas para fechá-lo.
7. Abra a interface do software de análise, selecione a guia Adicionar placa e prepare uma nova placa de amostra da seguinte maneira:
   1. Clique em Adicionar Placa e, em seguida, em Configurar Placa.
   2. Na guia Informações da placa, insira um Nome da placa, selecione Supermix para sondas (sem dUTP) no menu suspenso Supermix e insira um nome de arquivo em Salvar arquivo de dados como.
   3. Na guia Seleção de Poços, realce os poços a serem analisados e clique em Incluir Poços Selecionados.
      NOTA: Os passos 6.7.4 – 6.7.7 são opcionais.
   4. Na guia Informações do poço , selecione os poços a serem anotados.
      NOTA: Consulte a Figura 1D para obter um exemplo da interface da guia Informações do poço.
   5. Selecione Quantificação Direta (DQ) no menu suspenso Tipo de Experimento , preencha as caixas Descrição da Amostra, Tipo de Amostra e Nome do Destino e adicione Notas de Poço e/ou Notas de Placa , conforme necessário.
   6. Clique em Aplicar. As informações nos campos serão aplicadas aos poços selecionados.
   7. Repita as etapas 6.7.4–6.7.6 até que todos os poços de amostra tenham sido anotados.
8. Quando a configuração da placa estiver concluída, clique em Iniciar Execução.
9. Quando a execução estiver concluída, descarte a placa de amostra vazia e esvazie o frasco de resíduos do leitor de gotas, se necessário.
10. Prossiga para a Etapa 7.

7. Análise dos resultados

NOTA: O leitor de gotículas mede a intensidade de fluorescência no canal FAM e HEX para cada gota em uma amostra. Em um ensaio bem-sucedido, as gotículas se enquadram em uma das duas categorias para cada sonda: Negativa (o que significa que o alvo não estava presente na gota) ou Positiva (o que significa que o alvo estava presente na gota). Antes de analisar as amostras, certifique-se de que cada poço contenha >10.000 gotículas e tenha duas populações claramente separadas de gotículas de baixa fluorescência (negativa) e alta fluorescência (positiva) em cada canal (Figura 2A).

1. Selecione a guia Análise de Dados e abra o arquivo a ser analisado no menu Meus Arquivos de Dados .
2. Clique na guia Amplitude 1D para experimentos de cor única ou na guia Amplitude 2D para experimentos de duas cores.
3. Aplique um limiar de fluorescência a cada canal para diferenciar as gotículas positivas e negativas. O software de análise tentará aplicar um limite automático em uma base de amostra por amostra e canal por canal, mas se isso parecer ter falhado ou parecer impreciso, aplique manualmente o limite da seguinte maneira:
   1. Selecione os poços que exigem limites.
   2. Aplique manualmente o limite no espaço livre entre as populações positivas e negativas no gráfico de amplitude usando a ferramenta Modo de Linha de Limiar . Ao definir limiares manuais na visualização 2D, certifique-se de que a mira seja colocada de modo que as quatro populações de gotículas (duplo negativo, único positivo FAM, único positivo HEX, e duplo positivo) estejam claramente separadas.
      NOTA: O limiar pode ser feito bem a bem ou aplicado a vários poços de uma só vez.
4. Depois que todas as amostras tiverem um limite aplicado, exporte os resultados como um arquivo de .csv para análise posterior, clicando na guia Tabela de Dados , clicando em Importar/ Exportar e selecionando Exportar Dados Visíveis para CSV. Insira um nome de arquivo adequado e clique em Salvar.
5. Calcule o número de cópias de mtDNA na amostra inicial da seguinte forma:
   Número de cópia = concentração alvo de mtDNA × 22 × 1/fração da entrada total de lisado
   NOTA: Se duas sondas mitocondriais forem usadas, a concentração dos dois alvos será calculada em média antes de fazer o cálculo. Para amostras que contenham mais de uma célula, o número de cópias por célula é calculado dividindo-se pelo número de células na amostra. É importante usar o valor de "Concentração" (ou seja, número de cópias por microlitro) multiplicado pelo volume inicial da amostra de 22 μL, em vez do valor de "Cópias por 20 μL" calculado no arquivo de .csv, uma vez que as cópias de mtDNA deixadas no excesso de 2 μL exigido pelo gerador de gotículas devem ser levadas em conta ao calcular o número absoluto de cópias da amostra inicial.
6. Para células portadoras de deleções heteroplasmáticas de mtDNA, calcule o número de cópias usando os resultados do alvo de mtDNA fora da região excluída (ou seja, o alvo presente nas moléculas de mtDNA excluídas e WT). A heteroplasmia de deleção é calculada usando as concentrações do alvo dentro da região excluída e do alvo fora da região excluída da seguinte maneira:
   

Resultados

Após a geração de gotículas, uma camada clara de gotículas opacas é visível flutuando sobre a fase de óleo em cada poço (Figura 1B). A formação de gotículas pode ser afetada negativamente pela presença de detergentes no lisado de entrada ao realizar experimentos em células individuais. Utilizando o protocolo de lise descrito em 2.1.2., rendimentos de gotículas acima do nível recomendado de 10.000 são rotineiramente alcançados, apesar da presença de uma pequena quantidade r...

Discussão

O protocolo descrito aqui é aplicável em uma ampla gama de tipos de células e espécies, além dos discutidos acima, embora a otimização cuidadosa de novos projetos de ensaio seja fundamental para garantir que a precisão e a repetibilidade do método sejam mantidas ao se afastar das combinações de primer/sonda previamente validadas. Ao trabalhar com células individuais, é vital garantir que a coleta de amostras seja realizada com a maior precisão possível (por exemplo, usando parâmetros rigorosos de célula ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
50% Tween-20 solution	Novex	3005
Automated droplet-generating oil	Bio Rad	1864110	Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)
C1000 PCR machine with deep-well block	Bio Rad	1851197	PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)
Collection plate cooling block	Bio Rad	12002819	Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)
ddPCR 96-well plates	Bio Rad	12001925	96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)
ddPCR droplet reader oil	Bio Rad	1863004	Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio Rad	1863023	Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)
DG32 automated droplet generator cartridges	Bio Rad	1864108	Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)
Fetal bovine serum	Gibco	10270-106	Qualified fetal bovine serum
Foil plate covers	Bio Rad	1814040	Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)
HEK 293T cells	Takara	632180	Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen
HeLa cells	ECACC	93021013	Human cervix epitheloid carcinoma cells
High glucose DMEM	Gibco	13345364	4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate
Human cybrids	University of Miami
Mouse embryonic fibroblasts	Newcastle University	Immortalized from C57Bl/6 mice
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
PCR plate seals	Pierce	SP-0027	Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)
Pipet Tip Waste Bins	Bio Rad	1864125	Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)
Pipet tips for AutoDG system	Bio Rad	1864120	Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)
Primary human dermal fibroblast cells	Newcastle Biobank
Primers/Probes	IDT	N/A	Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1
Proteinase K 20 mg/mL solution	Ambion	AM2546
PX1 PCR plate sealer	Bio Rad	1814000	Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)
QX Manager software	Bio Rad	12012172	Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7)
QX200 AutoDG droplet generator	Bio Rad	1864101	Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)
QX200 droplet reader	Bio Rad	1864003	Droplet reader (used in Protocol Step 6)
Trizma pre-set crystals pH 8.3	Sigma	T8943-100G