Messung der einzelligen mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Heteroplasmie mittels digitaler Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der absoluten mitochondrialen (mt)DNA-Kopienzahl und der mtDNA-Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen vor.

Zusammenfassung

Die mitochondriale (mt)DNA von Säugetieren ist ein kleines, zirkuläres, doppelsträngiges, intramitochondriales DNA-Molekül, das 13 Untereinheiten der Elektronentransportkette kodiert. Im Gegensatz zum diploiden Kerngenom enthalten die meisten Zellen viel mehr Kopien der mtDNA, die je nach Zelltyp von weniger als 100 bis über 200.000 Kopien reichen. Die MtDNA-Kopienzahl wird zunehmend als Biomarker für eine Reihe von altersbedingten degenerativen Erkrankungen und Krankheiten verwendet, und daher wird die genaue Messung der mtDNA-Kopienzahl zu einem Schlüsselinstrument sowohl in der Forschung als auch in der Diagnose. Mutationen in der mtDNA, die oft als Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) oder Deletionen auftreten, können entweder in allen Kopien der mtDNA innerhalb der Zelle (Homoplasmie genannt) oder als Mischung aus mutierten und WT-mtDNA-Kopien (Heteroplasmie genannt) existieren. Heteroplasmatische mtDNA-Mutationen sind eine Hauptursache für klinische mitochondriale Pathologie, entweder bei seltenen Krankheiten oder bei einer wachsenden Anzahl von häufigen spät einsetzenden Krankheiten wie der Parkinson-Krankheit. Die Bestimmung des Grades der Heteroplasmie in Zellen ist ein kritischer Schritt bei der Diagnose seltener mitochondrialer Erkrankungen und in der Forschung, die darauf abzielt, häufige spät einsetzende Störungen zu verstehen, bei denen Mitochondrien eine Rolle spielen können. MtDNA-Kopienzahl und Heteroplasmie wurden traditionell durch quantitative (q)PCR-basierte Assays oder Tiefensequenzierung gemessen. Die jüngste Einführung der ddPCR-Technologie hat jedoch eine alternative Methode zur Messung beider Parameter bereitgestellt. Es bietet mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Methoden, einschließlich der Möglichkeit, die absolute mtDNA-Kopienzahl zu messen, und einer ausreichenden Empfindlichkeit, um auch bei niedrigen Kopienzahlen genaue Messungen von einzelnen Zellen durchzuführen. Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das die Messung der mtDNA-Kopienzahl in einzelnen Zellen mittels ddPCR beschreibt, im Folgenden als Tröpfchenerzeugungs-PCR bezeichnet, mit der Option zur gleichzeitigen Messung der Heteroplasmie in Zellen mit mtDNA-Deletionen. Die Möglichkeit, diese Methode zur Messung von Heteroplasmen in Zellen mit mtDNA-SNPs zu erweitern, wird ebenfalls diskutiert.

Einleitung

Die mitochondriale (mt)DNA von Säugetieren ist ein kleines (ca. 16,5 Kb), zirkuläres DNA-Genom, das sich in der mitochondrialen Matrix befindet und 37 Gene kodiert, bestehend aus zwei rRNAs, 22 tRNAs und 13 proteinkodierenden^{Genen 1}. Im Gegensatz zum Kerngenom, das eine (haploide) oder zwei (diploide) Kopien jedes Gens pro Zelle enthält, ist mtDNA in mehreren Kopien in den Mitochondrien jeder Zelle vorhanden, die von Dutzenden von Kopien (z. B. reife Spermatozyten) bis zu Hunderttausenden von Kopien (z. B. Eizellen^{) reichen2,3}. Eine Folge dieser Multi-Copy-Natur ist, dass Mutationen im mtDNA-Genom, die als Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), Deletionen oder Duplikationen existieren können, in einer bestimmten Zelle auf unterschiedlichen Ebenen vorhanden sein können und zwischen 0% und 100% der gesamten mtDNA-Population der Zelle ausmachen. Die Existenz von Wildtyp- und mutierten mtDNA-Genomen in derselben Zelle wird als Heteroplasmie bezeichnet, und pathogene heteroplasmatische mtDNA-Mutationen sind eine Hauptursache für mitochondriale Erkrankungen, wobei mehrere häufige neurologische Syndrome mit zugrunde liegenden heteroplasmatischen mtDNA-Mutationen verbunden sind⁴.

Zwei Schlüsselparameter, die zur Wahrscheinlichkeit beitragen, dass eine heteroplasmatische mtDNA-Mutation eine klinische Erkrankung verursacht, sind die Heteroplasmieebene und die mtDNA-Kopienzahl. Viele heteroplasmatische Mutationen zeigen einen Schwelleneffekt, wobei biochemische und klinische Phänotypen erst oberhalb eines bestimmten Heteroplasmaspiegels, typischerweise um 80%⁵, sichtbar werden und sich anschließend mit zunehmender Heteroplasmie verschlechtern⁴. Es ist jedoch auch wichtig, die Anzahl der in der Zelle vorhandenen Kopien von mtDNA zu berücksichtigen, da dies die Anzahl der Wildtyp-mtDNA-Genome beeinflusst, die auf einem bestimmten heteroplasmatischen Niveau vorhanden sind. Studien an Patienten mit mitochondrialen Erkrankungen haben die Bedeutung dieses Zusammenspiels zwischen Heteroplasmie und Kopienzahl^5,6 hervorgehoben, und Filograna et al. berichteten kürzlich über einen Anstieg der mtDNA-Kopienzahl^, der die Symptome trotz unveränderter Heteroplasmie in einem Mausmodell der mitochondrialen Erkrankung lindert⁷.

Während in den letzten Jahren viel getan wurde, um das Verständnis der Pathogenese und Übertragung von Krankheiten, die durch mtDNA-Heteroplasmie verursacht werden, zu verbessern, wurden die meisten dieser Arbeiten auf der Ebene von Geweben und nicht auf der Ebene von Zellen durchgeführt, wobei mittlere Gewebeheteroplasmiespiegel und Kopienzahlmessungen aus Massengewebebiopsien und Blutproben verglichen wurden. Einige etablierte Techniken, wie die Laser-Capture-Mikrodissektion, ermöglichen solche Messungen auf zellulärer Ebene ^8,9; Die jüngste Explosion von Hochdurchsatz-Einzelzellanalysemethoden oder sogenannten "Single-cell Omics"¹⁰ hat jedoch einen Bedarf an Methoden geschaffen, die diese entscheidenden mtDNA-Parameter auf Einzelzellebene genau messen können.

Die Tröpfchenerzeugungs-PCR-Methode nutzt die jüngsten Fortschritte in der mikrofluidischen Technologie, um bestehende Methoden zur Quantifizierung unbekannter DNA-Konzentrationen durch PCR-Amplifikation spezifischer Zielamplicons in der Proben-DNA^{zu verbessern 11}. Im Gegensatz zur qPCR, bei der die Proben-DNA in einer einzigen Reaktion amplifiziert wird, wobei die relative Akkumulationsrate des PCR-Produkts als Auslesung dient, teilt diese Methode die ursprüngliche Probe in Tausende von einzelnen Tröpfchen auf, wodurch die DNA-Moleküle der Probe in räumlich getrennte Reaktionen unterteilt^{werden 12}. Die anschließende PCR-Reaktion läuft in jedem einzelnen Tröpfchen ab, wobei sich das PCR-Produkt nur in Tröpfchen anreichert, die die Ziel-DNA enthalten. Das Ergebnis dieser Reaktion ist ein digitaler Ausgang in Form eines Pools von Tröpfchen, die entweder eine Kopie der Ziel-DNA und des amplifizierten PCR-Produkts enthalten oder keine Ziel-DNA enthalten. Mit fluoreszierenden DNA-Sonden oder einem doppelsträngigen (ds) DNA-bindenden Farbstoff können die Tröpfchen, die ein amplifiziertes Produkt enthalten, gezählt werden, und das Verhältnis von "positiven" zu "negativen" Tröpfchen kann verwendet werden, um die absolute Anzahl der DNA-Kopien zu berechnen, die in der ursprünglichen Probe vorhanden waren. Diese absolute Messung ist im Gegensatz zu der relativen Messung, die aus einer qPCR-Reaktion gewonnen wird, der Schlüsselfaktor, der es ermöglicht, diese Methodik für die genaue Messung der mtDNA-Kopienzahl und der Heteroplasmie in Einzelzellen zu verwenden¹¹, und mehrere neuere Studien haben bereits die PCR-Technologie zur Tröpfchenerzeugung für diesen Zweck verwendet^13,14 . Dieser Artikel stellt eine Methode zur Messung der mtDNA-Kopienzahl und Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen aus menschlichem und Mausgewebe vor.

Protokoll

Alle Experimente folgten den ARRIVE-Richtlinien und wurden vom University of Cambridge Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB) genehmigt.

HINWEIS: Alle Probenvorbereitungsschritte vor der Tröpfchenerzeugung müssen in einem sauberen Pre-PCR-Arbeitsbereich durchgeführt werden, idealerweise nach Möglichkeit in einem UV-sterilisierten Schrank. Das hier beschriebene Protokoll verwendet spezifische PCR-Geräte zur Tröpfchenerzeugung (siehe Materialtabelle), und obwohl die allgemeine Methode auf andere Systeme anwendbar sein sollte, wird empfohlen, die Richtlinien des Herstellers in Bezug auf Primer-/Sondenkonzentrationen, PCR-Zyklusbedingungen usw. zu konsultieren, da sie von den hier beschriebenen abweichen können. In dieser Studie wurden folgende Zelllinien/Primärzellen verwendet: Humane HeLa-Zellen (kommerziell gewonnen), humane HEK 293T-Zellen (kommerziell gewonnen), primäre humane dermale Fibroblastenzellen (erhalten von der Newcastle Biobank), menschliche Cybriden (WT & ΔH2.1-Deletion¹⁵, erhalten von C. Moraes, University of Miami), embryonale Fibroblasten der Maus (immortalisiert, von C57Bl/6-Mäusen, erhalten von J. Stewart, Newcastle University), Maus-Urkeimzellen (gewonnen aus C57Bl/6-Mausembryonen) und Maus-MII-Eizellen (gewonnen von erwachsenen weiblichen C57Bl/6-Mäusen). Alle kultivierten Zellen wurden in High Glucose (4,5g/L) DMEM gehalten, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum bei 37 °C mit 5% CO₂. Primäre Mauszellen, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden von Tieren isoliert, die gemäß dem Animal (Scientific Procedures) Act 1986 unter der Home Office Project License P6C97520A gehalten wurden.

1. Entwerfen und synthetisieren Sie Primer & Sonden-Sets, die auf DNA-Sequenzen von Interesse abzielen

HINWEIS: Die Tröpfchenerzeugungs-PCR kann auch mit einem dsDNA-bindenden Farbstoff anstelle der amplikonspezifischen Sonden durchgeführt werden.

1. Gestalten Sie die Primer- und Sondenabläufe nach den Vorgaben des Anlagenherstellers. Tabelle 1 enthält validierte Primer- und Sondensequenzen, die für die Messung der einzelligen mtDNA-Kopienzahl/Deletionsheteroplasmie sowohl in menschlichen 16,17- als auch in ^{Maus-18-Zellen} geeignet sind. Beachten Sie bei der Auswahl alternativer Zielsequenzen die folgenden Punkte.
   1. Multiplexen Sie zwei Primer-/Sondensätze in einem einzigen PCR-Assay, stellen Sie jedoch sicher, dass die beiden Assays eine FAM-markierte Sonde und eine HEX-markierte Sonde verwenden, so dass die Zielamplicons vom Tröpfchenleser unterschieden werden können. Dieses Protokoll stellt einen Duplex-Sonden-Assay dar. Mit sorgfältigem experimentellem Design kann das Multiplexing auf bis zu vier Ziele erhöht werden, und alternative Plattformen können höherdimensionales Multiplexing erreichen.
   2. Stellen Sie beim Multiplexing von Primer-/Sonden-Sets, die auf separate mtDNA-Sequenzen abzielen, sicher, dass sich die von den beiden Primer-Sets erzeugten Amplicons nicht überlappen.
   3. Wenn Sie die Heteroplasmie in Proben messen, die mtDNA-Deletionen tragen, stellen Sie sicher, dass ein Zielamplikon innerhalb der erwarteten gelöschten Region und der andere außerhalb der erwarteten gelöschten Region liegt.
      HINWEIS: Die optimalen PCR-Zyklusbedingungen für alternative Assays können von den in Schritt 5.1 angegebenen abweichen. Weitere Informationen zur Assay-Optimierung finden Sie in der Diskussion.

2. Isolierung von DNA aus einzelnen Zellen

HINWEIS: Diese Methode kann auch für kleine Massenproben von bis zu 100 Zellen verwendet werden.

1. Sammeln Sie einzelne Zellen mit einer geeigneten Methode, wie z. B. Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)¹⁹ oder Laser Capture Microdissection²⁰, in einem möglichst kleinen Volumen in einem geeigneten Behälter (z. B. 96-Well-Platte). Die Verwendung eines Zelllebensfähigkeitsfarbstoffs vor oder während der Einzelzellisolierung minimiert die Wahrscheinlichkeit, tote Zellen zu isolieren. Die einzelnen Zellen werden auf Wunsch direkt in den Lysepuffer sortiert und vor der Analyse bei -80 °C (bis zu 6 Monate) gelagert.
2. Die Zellen werden in einem kleinen Volumen (<10 μL) eines geeigneten Lysepuffers lysiert (der in dieser Studie verwendete Puffer wird in Schritt 2.2.1 beschrieben).
   HINWEIS: Alle Daten, die von Zellen in dieser Studie erhalten wurden, stammen von einzelligen Lysaten oder Pools von 20 Zellen (Stichprobengrößen sind in den Abbildungslegenden angegeben). Die effiziente Bildung einer Öl-/Tröpfchenemulsion während des Tröpfchenerzeugungsschritts des Tröpfchenerzeugungs-PCR-Protokolls kann durch das Vorhandensein von Detergenzien in der Probe signifikant beeinflusst werden; Daher wird empfohlen, die Kompatibilität aller Zelllysepuffer mit der Tröpfchenerzeugung bei der vorgesehenen Eingangskonzentration zu validieren, bevor mit experimentellen Proben und der Verwendung des kleinsten praktischen Volumens des Lysepuffers fortgefahren wird. Das folgende Lyseprotokoll führt zu minimalen Auswirkungen auf die Effizienz der Tröpfchenerzeugung.
   1. Der Lysepuffer enthält 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 1% TWEEN-20 und 200 μg/ml Proteinase K.
   2. Zu jeder Probe werden 2,5 μL des Lysepuffers gegeben, die Platte mit einer Klebeplattendichtung versiegelt und dann die Proben bei 1.000 x g für 1 min bei 4 °C zentrifugiert.
   3. Inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für 30 Minuten auf dem Thermocycler mit dem beheizten Deckel auf 105 °C, um die Kondensation von Flüssigkeit auf der Plattenabdeckung zu verhindern.
   4. Fügen Sie jeder Probe 7,5 μL nukleasefreies Wasser hinzu, um ein endgültiges Probenvolumen von 10 μL zu erhalten, verschließen Sie die Platte wieder und zentrifugieren Sie dann die Proben bei 1.000 x g für 1 Minute bei 4 °C.
   5. Inkubieren Sie auf dem Thermocycler bei 80 °C für 15 min (erhitzter Deckel auf 105 °C eingestellt), um Proteinase K zu inaktivieren.
   6. Die Proben bei 1.000 x g 1 min bei 4 °C zentrifugieren und anschließend auf Eis halten.
3. Fahren Sie mit Schritt 3 fort.
   HINWEIS: Zelllysate können bei -20 °C gelagert werden, bevor mit Schritt 3 fortgefahren wird. Verwenden Sie jedoch nach Möglichkeit frisch eluierte DNA, um das Risiko von Gefrier-Tau-Zyklen zu eliminieren, die zu einem DNA-Abbau führen.

3. Vorbereitung der Proben

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass technische Replikationen von Proben und Nicht-Template-Kontrollen (NTCs) auf jeder Analyseplatte enthalten sind, um die Genauigkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Der Dynamikbereich des Tröpfchenerzeugungs-PCR-Assays beträgt bis zu 120.000 Kopien des Zielamplikons pro Reaktion. Für Einzelzell- oder kleine Bulk-Cell-Probenlysate ist eine Verdünnung unwahrscheinlich, und die Lysatmischung kann direkt in die Reaktion zur Messung der mtDNA-Kopienzahl eingegeben werden (z. B. kann eine Lysatprobe von 10 μL aufgeteilt und dreifach mit 3 μL Eingang direkt in jeden Assay geleitet werden). Die Verwendung von unverdünntem Lysat aus Zellen mit sehr hohen Kopien-mtDNA-Zahlen (z. B. Eizellen) oder mit einer größeren Anzahl von Zellen (z. B. 50-100) kann diesen Dynamikbereich jedoch überschreiten. In solchen Fällen ist eine anfängliche serielle Verdünnung erforderlich, um einen geeigneten Verdünnungsfaktor zu identifizieren, der eine Sättigung des Assays für diesen spezifischen Zelltyp/diese Zellzahl vermeidet (siehe Repräsentative Ergebnisse für weitere Details).

1. Alle Reagenzien auf Eis, Wirbel auftauen und vor Gebrauch kurz herunterschleudern.
2. Bereiten Sie die Mastermischung (abzüglich Proben-DNA) auf Eis wie in (Tabelle 2) beschrieben vor.
   HINWEIS: Wenn nur ein Zielamplikon gemessen wird, fügen Sie zusätzliche 2,55 μL nukleasefreies Wasser pro Probe hinzu, um das Endvolumen von 22 μL zu erreichen. Bereiten Sie eine ausreichende Mastermischung für die Anzahl der zu analysierenden Proben und NTCs sowie genügend vor, um alle "leeren" Vertiefungen zu berücksichtigen, die auf der PCR-Platte zur Tröpfchenerzeugung erforderlich sind (siehe nächster Schritt).
3. Wirbeln Sie die vorbereitete Mastermischung kurz, um das erforderliche Volumen (22 μL minus Eingangs-DNA-Volumen) in jede Vertiefung einer Tröpfchenerzeugung PCR 96-Well-Platte zu mischen und aliquotieren. Die Proben werden in vollen Spalten auf der 96-Well-Platte angeordnet. Füllen Sie leere Vertiefungen in unvollständigen Spalten mit Master-Mix und verwenden Sie sie als NTCs.
4. Fügen Sie die Eingangs-DNA zu jeder Probenvertiefung und nukleasefreien Wasser- / Elutionspuffer zu NTC-Vertiefungen hinzu, um das Gesamtvolumen jedes einzelnen auf 22 μL zu erhöhen.
5. Verschließen Sie die Platte mit einer Klebeplattendichtung und legen Sie sie für 1 Minute auf einen Shaker bei 2.000 U/min und zentrifugieren Sie dann bei 1.000 x g für eine Minute bei 4 °C.
6. Legen Sie die Platte auf Eis und fahren Sie mit Schritt 4 fort.
   HINWEIS: Vorbereitete Platten können für kurze Zeit (z. B. 1-2 h) auf Eis gelagert und vor Licht geschützt werden, bevor mit der Tröpfchenerzeugung fortgefahren wird.

4. Erzeugung von Tröpfchen

HINWEIS: In Abbildung 1A finden Sie das Schema des in diesem Abschnitt referenzierten Tröpfchengenerator-Instrumentendecks.

1. Schalten Sie den Tröpfchengenerator ein.
2. Überprüfen Sie, ob eine Flasche tröpfchenerzeugendes Öl an Position E des Instrumentendecks geladen ist. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Flasche auszutauschen.
3. Klicken Sie auf dem Touchscreen auf Configure Sample Plate (Beispielplatte konfigurieren ). Wählen Sie alle Spalten auf der Probenplatte aus, die Proben/Leerproben enthalten.
   HINWEIS: Die Eingabe des Plattennamens und der Details des Experiments in diesem Schritt ist optional und nicht erforderlich, um mit dem Aufbau des Experiments fortzufahren.
4. Klicken Sie auf OK , um die Plattenkonfiguration zu bestätigen. Orangefarbene Leuchten leuchten auf dem Instrumentendeck, um Positionen anzuzeigen, an denen Verbrauchsmaterialien geladen werden müssen.
5. Legen Sie die Tröpfchengeneratorpatronen in Position B auf dem Instrumentendeck ein, sodass alle Leuchten grün leuchten.
6. Legen Sie einen leeren Abfalltrog in Position C auf dem Instrumentendeck.
7. Entfernen Sie die Deckel der Filterspitzenkästen und laden Sie sie auf Position D auf dem Instrumententisch, damit alle Lichter grün leuchten.
8. Entfernen Sie die Klebeplattendichtung von der Probenplatte und legen Sie sie an Position F des Instrumentendecks, so dass die Leuchte grün wird.
9. Legen Sie eine leere 96-Well-Platte in einen kühlen Block (vorgekühlt bei -20 °C) und laden Sie sie an Position G des Instrumentendecks, so dass das Licht grün wird.
10. Klicken Sie auf dem Touchscreen des Instruments auf Tröpfchengenerierung starten .
11. Klicken Sie auf dem Touchscreen des Instruments auf Start Run . Der Instrumentendeckel schließt sich automatisch. Nach der Initialisierung wird die verbleibende Zeit bis zum Abschluss der Tröpfchenerzeugung auf dem Touchscreen des Instruments angezeigt.
12. Sobald die Tröpfchenerzeugung abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Probenentnahmeplatte visuell, um zu bestätigen, dass in jeder Vertiefung eine Tröpfchenemulsionsschicht über der Ölphase vorhanden ist (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Wenn keine Tröpfchenemulsionsschicht sichtbar ist, fahren Sie nicht mit dem Experiment fort und überprüfen Sie es auf Fehler, die während der vorherigen Schritte des Protokolls aufgetreten sind.
13. Entfernen Sie die gebrauchten Verbrauchsmaterialien vom Instrumentendeck und leeren Sie den Kippabfalltrog.
14. Schalten Sie die Plattenversiegelung ein, stellen Sie die Temperatur auf 180 °C und die Siegelzeit auf 5 s ein und lassen Sie die Maschine die Betriebstemperatur erreichen.
15. Legen Sie die Probenentnahmeplatte in den Plattenhalter der Plattenversiegelung und legen Sie eine frische Foliendichtung mit der roten Linie nach oben auf die Platte. Achten Sie darauf, die Unterseite der Foliendichtung nicht zu berühren.
    HINWEIS: Der Plattenhalter sollte bei Raumtemperatur (RT) gelagert und nur dann in die Plattenversiegelungsschublade gelegt werden, wenn eine Foliendichtung angebracht wird, um eine Wärmeübertragung auf die Probensammelplatte zu verhindern.
16. Wenn die Plattenversiegelung Betriebstemperatur erreicht hat, drücken Sie auf dem Touchscreen des Instruments auf Auswerfen . Die Schublade öffnet sich automatisch.
17. Legen Sie den Plattenhalter in die Schublade der Plattenversiegelung und drücken Sie Siegel. Die Schublade schließt sich automatisch und öffnet sich nach Abschluss der Versiegelung wieder.
18. Setzen Sie die versiegelte Platte auf dem kalten Block wieder ein, schalten Sie die Plattenversiegelung aus und fahren Sie sofort mit Schritt 5 fort.
    HINWEIS: In diesem Stadium sind die Tröpfchen instabil, also stellen Sie sicher, dass der PCR-Schritt innerhalb von 1 h nach Abschluss der Tröpfchenerzeugung begonnen wird.

5. PCR

1. Legen Sie die versiegelte Tröpfchensammelplatte auf einen PCR-Cycler, der mit einem 96-Tiefbrunnenblock ausgestattet ist, und führen Sie das in Tabelle 3 beschriebene Temperaturwechselprotokoll durch.
   HINWEIS: Stellen Sie die Temperatur des beheizten Deckels auf 105 °C und das Probenvolumen auf 40 μL ein. Die Denaturierungs- und Glüh-/Verlängerungsschritte müssen eine Temperaturrampenrate von 2 °C/s umfassen, um sicherzustellen, dass das Öl Zeit hat, sich auf die richtige Temperatur auszugleichen.
2. Fahren Sie mit Schritt 6 fort.
   HINWEIS: Sobald das Temperaturwechselprotokoll abgeschlossen ist, sind die Tröpfchen stabiler und die Platte kann bis zu 4 Tage bei 4 ° C gelagert werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird.

6. Tröpfchenlesen

1. Schalten Sie den Tropfenleser und den angeschlossenen Computer ein.
2. Überprüfen Sie die Flüssigkeitsstände im Tröpfchenleseöl und in den Abfallflaschen des Tröpfchenlesers und füllen bzw. leeren Sie diese, falls erforderlich.
3. Legen Sie die Platte mit den Post-PCR-Proben in den Plattenhalter des Tröpfchenlesers, legen Sie die Abdeckung auf den Halter und sichern Sie sie mit den schwarzen Verriegelungsclips. Entfernen Sie den Foliendeckel nicht von der Probenplatte.
4. Drücken Sie die Öffnen/Schließen-Taste am Deckel des Tröpfchenlesers, um ihn zu öffnen.
5. Legen Sie den Halter der Tröpfchenleserplatte mit der Probenplatte in die Lesekammer und platzieren Sie ihn sicher auf dem Magnetfuß.
6. Drücken Sie die Öffnen/Schließen-Taste am Deckel des Tröpfchenlesers, um ihn zu schließen.
7. Öffnen Sie die Benutzeroberfläche der Analysesoftware, wählen Sie die Registerkarte Platte hinzufügen und bereiten Sie wie folgt eine neue Probenplatte vor:
   1. Klicken Sie auf Platte hinzufügen und dann auf Platte konfigurieren.
   2. Geben Sie auf der Registerkarte Platteninformationen einen Plattennamen ein, wählen Sie Supermix für Sonden (kein dUTP) aus dem Dropdown-Menü Supermix aus und geben Sie unter Datendatei speichern unter einen Dateinamen ein.
   3. Markieren Sie auf der Registerkarte "Well-Auswahl " die zu analysierenden Wells und klicken Sie auf Include Selected Wells (Ausgewählte Bohrlöcher einbeziehen).
      HINWEIS: Die Schritte 6.7.4 – 6.7.7 sind optional.
   4. Wählen Sie auf der Registerkarte Bohrlochinformationen die Bohrlöcher aus, die mit Anmerkungen versehen werden sollen.
      HINWEIS: In Abbildung 1D finden Sie ein Beispiel für die Benutzeroberfläche der Registerkarte "Bohrlochinformationen ".
   5. Wählen Sie im Dropdown-Menü Experimenttyp die Option Direkte Quantifizierung (DQ) aus, füllen Sie die Felder Probenbeschreibung, Probentyp und Zielname aus und fügen Sie bei Bedarf Bohrlochnotizen und/oder Plattennotizen hinzu.
   6. Klicken Sie auf Übernehmen. Die Informationen in den Feldern werden auf die ausgewählten Brunnen angewendet.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 6.7.4–6.7.6, bis alle Probenbohrungen mit Anmerkungen versehen sind.
8. Sobald die Plattenkonfiguration abgeschlossen ist, klicken Sie auf Start Run.
9. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, entsorgen Sie die leere Probenplatte und leeren Sie gegebenenfalls die Abfallflasche des Tröpfchenlesers.
10. Fahren Sie mit Schritt 7 fort.

7. Analyse der Ergebnisse

HINWEIS: Der Tröpfchenleser misst die Fluoreszenzintensität im FAM- und HEX-Kanal für jedes Tröpfchen in einer Probe. In einem erfolgreichen Assay fallen Tröpfchen für jede Sonde in eine von zwei Kategorien: Negativ (d. h. das Ziel war nicht im Tröpfchen vorhanden) oder Positiv (d. h. das Ziel war im Tröpfchen vorhanden). Stellen Sie vor der Analyse der Proben sicher, dass jede Vertiefung >10.000 Tröpfchen enthält und zwei deutlich getrennte Populationen von Tröpfchen mit niedriger Fluoreszenz (negativ) und hoher Fluoreszenz (positiv) in jedem Kanal aufweist (Abbildung 2A).

1. Wählen Sie die Registerkarte Datenanalyse und öffnen Sie die zu analysierende Datei im Menü Meine Datendateien .
2. Klicken Sie auf die Registerkarte 1D-Amplitude für einfarbige Experimente oder auf die Registerkarte 2D-Amplitude für zweifarbige Experimente.
3. Wenden Sie eine Fluoreszenzschwelle auf jeden Kanal an, um die positiven und negativen Tröpfchen zu unterscheiden. Die Analysesoftware versucht, einen automatischen Schwellenwert für Stichprobe und Kanal für Kanal anzuwenden, aber wenn dies fehlgeschlagen zu sein scheint oder ungenau aussieht, wenden Sie den Schwellenwert manuell wie folgt an:
   1. Wählen Sie die Vertiefungen aus, für die ein Schwellenwert erforderlich ist.
   2. Wenden Sie den Schwellenwert manuell im freien Raum zwischen den positiven und negativen Grundgesamtheiten im Amplitudendiagramm mit dem Werkzeug Schwellenwertlinienmodus an. Stellen Sie beim Festlegen manueller Schwellenwerte in der 2D-Ansicht sicher, dass das Fadenkreuz so platziert ist, dass die vier Tröpfchenpopulationen (doppelt negativ, einfach positiver FAM, einzelner positiver HEX und doppelt positiv) deutlich getrennt sind.
      HINWEIS: Der Schwellenwert kann entweder gut durchgeführt oder auf mehrere Bohrlöcher gleichzeitig angewendet werden.
4. Sobald auf alle Proben ein Schwellenwert angewendet wurde, exportieren Sie die Ergebnisse als .csv Datei zur weiteren Analyse, indem Sie auf die Registerkarte Datentabelle klicken, auf Importieren/Exportieren klicken und Sichtbare Daten in CSV exportieren auswählen. Geben Sie einen geeigneten Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern.
5. Berechnen Sie die mtDNA-Kopienzahl in der Erstprobe wie folgt:
   Kopienzahl = mtDNA-Zielkonzentration × 22 × 1/Fraktion des gesamten Lysat-Inputs
   HINWEIS: Wenn zwei mitochondriale Sonden verwendet werden, wird die Konzentration der beiden Ziele gemittelt, bevor die Berechnung durchgeführt wird. Bei Proben, die mehr als eine Zelle enthalten, wird die Kopienzahl pro Zelle berechnet, indem sie durch die Anzahl der Zellen in der Stichprobe dividiert wird. Es ist wichtig, den Wert "Konzentration" (d. h. Anzahl der Kopien pro Mikroliter) multipliziert mit dem anfänglichen Probenvolumen von 22 μL und nicht den in der .csv Datei berechneten Wert "Kopien pro 20 μL" zu verwenden, da die mtDNA-Kopien, die in der vom Tröpfchengenerator geforderten 2-μL-Überschreitung verbleiben, bei der Berechnung der absoluten Kopienzahl der Erstprobe berücksichtigt werden müssen.
6. Für Zellen, die heteroplasmatische mtDNA-Deletionen tragen, berechnen Sie die Kopienzahl anhand der Ergebnisse des mtDNA-Ziels außerhalb der gelöschten Region (d. h. des Ziels, das sowohl in gelöschten als auch in WT-mtDNA-Molekülen vorhanden ist). Die Deletionsheteroplasmie wird unter Verwendung der Konzentrationen des Ziels innerhalb des gelöschten Bereichs und des Ziels außerhalb des gelöschten Bereichs wie folgt berechnet:
   

Ergebnisse

Nach der Tröpfchenerzeugung ist eine klare Schicht undurchsichtiger Tröpfchen sichtbar, die auf der Ölphase in jedem Bohrloch schwimmt (Abbildung 1B). Die Tröpfchenbildung kann durch das Vorhandensein von Detergenzien im Eingangslysat bei Experimenten an einzelnen Zellen beeinträchtigt werden. Unter Verwendung des in Abschnitt 2.1.2 beschriebenen Lyseprotokolls werden trotz des Vorhandenseins einer geringen Restmenge von TWEEN-20 in der Endprobe routinemäßig Tröpfchenausbeuten über ...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll ist zusätzlich zu den oben beschriebenen auf eine Vielzahl von Zelltypen und -spezies anwendbar, obwohl eine sorgfältige Optimierung neuer Assay-Designs von entscheidender Bedeutung sein wird, um sicherzustellen, dass Genauigkeit und Wiederholbarkeit der Methode erhalten bleiben, wenn man sich von zuvor validierten Primer/Sonden-Kombinationen entfernt. Bei der Arbeit mit Einzelzellen ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Probenentnahme so genau wie möglich durchgeführt wird (z. B. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
50% Tween-20 solution	Novex	3005
Automated droplet-generating oil	Bio Rad	1864110	Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)
C1000 PCR machine with deep-well block	Bio Rad	1851197	PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)
Collection plate cooling block	Bio Rad	12002819	Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)
ddPCR 96-well plates	Bio Rad	12001925	96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)
ddPCR droplet reader oil	Bio Rad	1863004	Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio Rad	1863023	Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)
DG32 automated droplet generator cartridges	Bio Rad	1864108	Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)
Fetal bovine serum	Gibco	10270-106	Qualified fetal bovine serum
Foil plate covers	Bio Rad	1814040	Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)
HEK 293T cells	Takara	632180	Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen
HeLa cells	ECACC	93021013	Human cervix epitheloid carcinoma cells
High glucose DMEM	Gibco	13345364	4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate
Human cybrids	University of Miami
Mouse embryonic fibroblasts	Newcastle University	Immortalized from C57Bl/6 mice
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
PCR plate seals	Pierce	SP-0027	Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)
Pipet Tip Waste Bins	Bio Rad	1864125	Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)
Pipet tips for AutoDG system	Bio Rad	1864120	Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)
Primary human dermal fibroblast cells	Newcastle Biobank
Primers/Probes	IDT	N/A	Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1
Proteinase K 20 mg/mL solution	Ambion	AM2546
PX1 PCR plate sealer	Bio Rad	1814000	Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)
QX Manager software	Bio Rad	12012172	Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7)
QX200 AutoDG droplet generator	Bio Rad	1864101	Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)
QX200 droplet reader	Bio Rad	1864003	Droplet reader (used in Protocol Step 6)
Trizma pre-set crystals pH 8.3	Sigma	T8943-100G