Mesure du nombre de copies d’ADN mitochondrial unicellulaire et de l’hétéroplasmie à l’aide d’une réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour mesurer le nombre absolu de copies d’ADN mitochondrial (mt) et les niveaux d’hétéroplasmie de délétion de l’ADNmt dans des cellules individuelles.

Résumé

L’ADN mitochondrial (mt) des mammifères est une petite molécule d’ADN intra-mitochondrial circulaire, double brin, codant pour 13 sous-unités de la chaîne de transport d’électrons. Contrairement au génome nucléaire diploïde, la plupart des cellules contiennent beaucoup plus de copies d’ADNmt, allant de moins de 100 à plus de 200 000 copies selon le type de cellule. Le nombre de copies d’ADNmt est de plus en plus utilisé comme biomarqueur pour un certain nombre de maladies et de maladies dégénératives liées à l’âge et, par conséquent, la mesure précise du nombre de copies d’ADNmt devient un outil clé dans les contextes de recherche et de diagnostic. Les mutations dans l’ADNmt, se produisant souvent sous forme de polymorphismes mononucléotidiques (SNP) ou de délétions, peuvent exister dans toutes les copies de l’ADNmt dans la cellule (appelé homoplasmie) ou sous la forme d’un mélange de copies mutées et d’ADNmt WT (appelées hétéroplasmie). Les mutations hétéroplasmiques de l’ADNmt sont une cause majeure de pathologie mitochondriale clinique, que ce soit dans les maladies rares ou dans un nombre croissant de maladies courantes d’apparition tardive telles que la maladie de Parkinson. La détermination du niveau d’hétéroplasmie présente dans les cellules est une étape critique dans le diagnostic des maladies mitochondriales rares et dans la recherche visant à comprendre les troubles courants d’apparition tardive où les mitochondries peuvent jouer un rôle. Le nombre de copies d’ADNmt et l’hétéroplasmie ont traditionnellement été mesurés par des tests quantitatifs basés sur la (q)PCR ou le séquençage profond. Cependant, l’introduction récente de la technologie ddPCR a fourni une méthode alternative pour mesurer les deux paramètres. Il offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes, y compris la capacité de mesurer le nombre absolu de copies d’ADNmt et une sensibilité suffisante pour effectuer des mesures précises à partir de cellules individuelles, même à un faible nombre de copies. Présenté ici est un protocole détaillé décrivant la mesure du nombre de copies d’ADNmt dans des cellules individuelles à l’aide de ddPCR, appelée PCR de génération de gouttelettes dorénavant, avec l’option de mesure simultanée de l’hétéroplasmie dans les cellules présentant des délétions d’ADNmt. La possibilité d’étendre cette méthode pour mesurer l’hétéroplasmie dans les cellules avec des SNP d’ADNmt est également discutée.

Introduction

L’ADN mitochondrial (mt) des mammifères est un petit génome d’ADN circulaire (environ 16,5 Kb) résidant dans la matrice mitochondriale qui code pour 37 gènes, comprenant deux ARNr, 22 ARNt et 13 gènes codant pour des protéines¹. Contrairement au génome nucléaire, qui contient une copie (haploïde) ou deux copies (diploïdes) de chaque gène par cellule, l’ADNmt est présent en plusieurs copies dans les mitochondries de chaque cellule, allant de dizaines de copies (par exemple, spermatocytes matures) à des centaines de milliers de copies (par exemple, des ovocytes)^2,3. Une conséquence de cette nature multi-copie est que des mutations dans le génome de l’ADNmt, qui peuvent exister sous forme de polymorphismes mononucléotidiques (SNP), de délétions ou de duplications, peuvent être présentes à différents niveaux dans une cellule donnée, représentant de 0% à 100% de la population totale d’ADNmt de la cellule. L’existence de génomes d’ADNmt de type sauvage et mutant dans la même cellule est appelée hétéroplasmie, et les mutations hétéroplasmiques pathogènes de l’ADNmt sont une cause majeure de maladie mitochondriale, avec plusieurs syndromes neurologiques communs liés à des mutations hétéroplasmiques sous-jacentes de l’ADNmt⁴.

Deux paramètres clés qui contribuent à la probabilité qu’une mutation hétéroplasmique de l’ADNmt cause une maladie clinique sont le niveau d’hétéroplasmie et le nombre de copies d’ADNmt. De nombreuses mutations hétéroplasmiques présentent un effet de seuil, les phénotypes biochimiques et cliniques ne devenant apparents qu’au-dessus d’un certain niveau d’hétéroplasmie, généralement autour de 80%⁵, puis s’aggravant à mesure que l’hétéroplasmie augmente encore⁴. Cependant, il est également important de tenir compte du nombre de copies d’ADNmt présentes dans la cellule, car cela influencera le nombre de génomes d’ADNmt de type sauvage (c’est-à-dire « sains ») présents à un niveau d’hétéroplasmie donné. Des études chez des patients atteints de maladie mitochondriale ont mis en évidence l’importance de cette interaction entre l’hétéroplasmie et la copie^{numéro 5,6,} et Filograna et al. ont récemment signalé une augmentation du nombre de copies d’ADNmt soulageant les symptômes malgré une hétéroplasmie inchangée dans un modèle murin de maladie mitochondriale⁷.

Bien que beaucoup ait été fait ces dernières années pour améliorer la compréhension de la pathogenèse et de la transmission des maladies causées par l’hétéroplasmie de l’ADNmt, la plupart de ces travaux ont été menés au niveau des tissus plutôt que des cellules, en comparant les niveaux moyens d’hétéroplasmie tissulaire et les mesures du nombre de copies acquises à partir de biopsies tissulaires en vrac et d’échantillons de sang. Certaines techniques bien établies, telles que la microdissection par capture laser, permettent de telles mesures au niveau cellulaire ^8,9; Cependant, l’explosion récente des méthodes d’analyse monocellulaire à haut débit, ou appelées « omiques unicellulaires »¹⁰, a créé un besoin de méthodes capables de mesurer avec précision ces paramètres cruciaux de l’ADNmt au niveau de la cellule unique.

La méthode PCR de génération de gouttelettes tire parti des progrès récents de la technologie microfluidique pour améliorer les méthodes existantes de quantification des concentrations d’ADN inconnues par amplification par PCR d’amplicons cibles spécifiques dans l’échantillon^{d’ADN 11}. Contrairement à la qPCR, où l’ADN de l’échantillon est amplifié en une seule réaction, avec le taux relatif d’accumulation du produit PCR agissant comme lecture, cette méthode divise l’échantillon initial en milliers de gouttelettes individuelles, compartimentant ainsi les molécules d’ADN de l’échantillon en réactions spatialement séparées¹². La réaction PCR suivante se déroule dans chaque gouttelette individuelle, le produit PCR ne s’accumulant que dans les gouttelettes contenant l’ADN cible. Le résultat de cette réaction est une sortie numérique sous la forme d’un pool de gouttelettes qui contiennent soit une copie de l’ADN cible et du produit PCR amplifié, soit ne contiennent pas d’ADN cible. À l’aide de sondes d’ADN fluorescentes ou d’un colorant de liaison à l’ADN double brin (ds), les gouttelettes contenant du produit amplifié peuvent être comptées et le rapport des gouttelettes « positives » et « négatives » peut être utilisé pour calculer le nombre absolu de copies d’ADN présentes dans l’échantillon initial. Cette mesure absolue, par opposition à la mesure relative acquise à partir d’une réaction qPCR, est le facteur clé qui permet d’utiliser cette méthodologie pour mesurer avec précision le nombre de copies d’ADNmt et l’hétéroplasmie dans des cellules individuelles¹¹, et plusieurs études récentes ont déjà utilisé la technologie de PCR par génération de gouttelettes à cette fin^13,14 . Cet article présente une méthode pour mesurer le nombre de copies d’ADNmt et l’hétéroplasmie de délétion dans des cellules individuelles de tissus humains et murins.

Protocole

Toutes les expériences ont suivi les directives ARRIVE et ont été approuvées par l’organisme d’examen éthique du bien-être animal de l’Université de Cambridge (AWERB).

REMARQUE : Toutes les étapes de préparation des échantillons avant la génération de gouttelettes doivent être effectuées dans une aire de travail pré-PCR propre, idéalement dans une armoire stérilisée aux UV si possible. Le protocole décrit ici utilise un équipement de PCR spécifique de génération de gouttelettes (voir le tableau des matériaux), et bien que la méthode générale devrait être applicable à d’autres systèmes, il est recommandé de consulter les lignes directrices du fabricant concernant les concentrations d’amorce / sonde, les conditions de cycle PCR, etc., car elles peuvent différer de celles décrites ici. Les lignées cellulaires/cellules primaires utilisées dans cette étude étaient les suivantes : cellules HeLa humaines (obtenues commercialement), cellules HEK 293T humaines (obtenues commercialement), cellules primaires de fibroblastes dermiques humains (obtenues à partir de la biobanque de Newcastle), cybrides humaines (délétion WT & ΔH2.1¹⁵, obtenues de C. Moraes, Université de Miami), fibroblastes embryonnaires de souris (immortalisés, à partir de souris C57Bl/6, obtenus de J. Stewart, Université de Newcastle), des cellules germinales primordiales de souris (obtenues à partir d’embryons de souris C57Bl/6) et des ovocytes MII de souris (obtenus à partir de souris C57Bl/6 femelles adultes). Toutes les cellules cultivées ont été maintenues dans du DMEM à haute teneur en glucose (4,5 g/L) complété par 10 % de sérum fœtal bovin à 37 °C avec 5 % de CO₂. Les cellules de souris primaires utilisées dans cette étude ont été isolées à partir d’animaux détenus conformément à la loi de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) sous la licence de projet P6C97520A du ministère de l’Intérieur.

1. Concevoir et synthétiser des ensembles d’amorces et de sondes ciblant des séquences d’ADN d’intérêt

REMARQUE: La PCR de génération de gouttelettes peut également être effectuée à l’aide d’un colorant de liaison dsDNA à la place des sondes spécifiques à l’amplicon.

1. Concevoir les séquences d’amorce et de sonde conformément aux directives données par le fabricant du système. Le tableau 1 fournit des séquences d’amorce et de sonde validées permettant de mesurer le nombre de copies d’ADNmt ou l’hétéroplasmie de délétion dans les cellules humaines ^16,17 et les^{cellules de} souris¹⁸. Lors de la sélection d’autres séquences cibles, tenez compte des points suivants.
   1. Multiplex deux ensembles d’amorces/sondes dans un seul test PCR, mais assurez-vous que les deux tests utilisent une sonde marquée FAM et une sonde marquée HEX afin que les amplicons cibles puissent être différenciés par le lecteur de gouttelettes. Ce protocole présente un test de sonde duplex. Avec une conception expérimentale soignée, le multiplexage peut être augmenté jusqu’à quatre cibles, et les plates-formes alternatives peuvent réaliser un multiplexage de dimension supérieure.
   2. Lors du multiplexage d’ensembles d’amorces/sondes ciblant des séquences d’ADNmt distinctes, assurez-vous que les amplicons générés par les deux ensembles d’amorces ne se chevauchent pas.
   3. Lors de la mesure de l’hétéroplasmie dans des échantillons porteurs de délétions d’ADNmt, assurez-vous qu’un amplicon cible se situe dans la région supprimée attendue et l’autre en dehors de la région supprimée attendue.
      REMARQUE : Les conditions optimales de cycle PCR pour les essais alternatifs peuvent différer de celles citées à l’étape 5.1 ; voir la discussion pour plus de détails sur l’optimisation des essais.

2. Isolement de l’ADN à partir de cellules individuelles

REMARQUE: Cette méthode peut également être utilisée pour de petits échantillons en vrac allant jusqu’à 100 cellules.

1. Recueillir des cellules individuelles à l’aide d’une méthode appropriée, comme le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)¹⁹ ou la microdissection par capture laser²⁰, dans un volume aussi petit que possible dans un récipient approprié (p. ex. plaque à 96 puits). L’utilisation d’un colorant de viabilité cellulaire avant ou pendant l’isolement d’une seule cellule réduira au minimum la probabilité d’isoler les cellules mortes. Trier les cellules individuelles directement dans un tampon de lyse si désiré et conserver à -80 °C (jusqu’à 6 mois) avant l’analyse.
2. Lyser les cellules dans un petit volume (<10 μL) d’un tampon de lyse approprié (le tampon utilisé dans cette étude est décrit à l’étape 2.2.1.).
   NOTE: Toutes les données obtenues à partir de cellules dans cette étude proviennent de lysats unicellulaires ou de pools de 20 cellules (la taille des échantillons est stipulée dans les légendes de la figure). La formation efficace d’une émulsion huile/gouttelette pendant l’étape de génération de gouttelettes du protocole PCR de génération de gouttelettes peut être considérablement affectée par la présence de détergents dans l’échantillon; Par conséquent, il est recommandé de valider la compatibilité de tous les tampons de lyse cellulaire avec la génération de gouttelettes à la concentration d’entrée prévue avant de procéder à des échantillons expérimentaux et d’utiliser le plus petit volume pratique de tampon de lyse. Le protocole de lyse suivant a un impact minimal sur l’efficacité de la génération de gouttelettes.
   1. Préparer le tampon de lyse contenant 50 mM de Tris-HCl pH 8,3, 1 % de TWEEN-20 et 200 μg/mL de protéinase K.
   2. Ajouter 2,5 μL du tampon de lyse à chaque échantillon, sceller la plaque avec un joint adhésif, puis centrifuger les échantillons à 1 000 x g pendant 1 min à 4 °C.
   3. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 30 min sur le thermocycleur avec le couvercle chauffant réglé à 105 °C pour éviter la condensation de liquide sur le couvercle de la plaque.
   4. Ajouter 7,5 μL d’eau exempte de nucléases à chaque échantillon pour obtenir un volume final de 10 μL, refermer la plaque, puis centrifuger les échantillons à 1 000 x g pendant 1 min à 4 °C.
   5. Incuber sur le thermocycleur à 80 °C pendant 15 min (couvercle chauffé réglé à 105 °C) pour inactiver la protéinase K.
   6. Centrifuger les échantillons à 1 000 x g pendant 1 min à 4 °C, puis conserver sur la glace.
3. Passez à l’étape 3 ci-dessous.
   NOTE: Les lysats cellulaires peuvent être stockés à -20 ° C avant de passer à l’étape 3; cependant, utilisez de l’ADN fraîchement élué dans la mesure du possible pour éliminer le risque de cycles de gel-dégel entraînant une dégradation de l’ADN.

3. Préparation des échantillons

REMARQUE : S’assurer que des répétitions techniques des échantillons et des témoins non gabarits (CTN) sont incluses sur chaque plaque d’essai pour assurer l’exactitude des résultats. La plage dynamique du test PCR de génération de gouttelettes peut atteindre 120 000 copies de l’amplicon cible par réaction. Pour les lysats d’échantillons unicellulaires ou de petites cellules en vrac, il est peu probable qu’une dilution soit nécessaire, et le mélange de lysats peut être introduit directement dans la réaction pour la mesure du nombre de copies d’ADNmt (p. ex., un échantillon de lysat de 10 μL peut être divisé et exécuté en triple exemplaire avec 3 μL d’entrée directement dans chaque essai). Cependant, l’utilisation de lysat non dilué provenant de cellules ayant un nombre très élevé d’ADNmt (par exemple, des ovocytes) ou contenant un plus grand nombre de cellules (par exemple, 50-100) peut dépasser cette plage dynamique. Dans de tels cas, une dilution en série initiale est nécessaire pour identifier un facteur de dilution approprié qui évite la saturation de l’essai pour ce type de cellule / numéro de cellule spécifique (voir Résultats représentatifs pour plus de détails).

1. Décongeler tous les réactifs sur la glace, le vortex et tourner brièvement vers le bas avant utilisation.
2. Préparer le mélange principal (moins l’échantillon d’ADN) sur la glace comme décrit dans le tableau 2.
   REMARQUE : Si un seul amplicon cible est mesuré, ajouter 2,55 μL supplémentaires d’eau exempte de nucléases par échantillon pour atteindre le volume final de 22 μL. Préparer suffisamment de mélange maître pour le nombre d’échantillons et de CTN à analyser, plus suffisamment pour tenir compte de tout puits « blanc » requis sur la plaque PCR de génération de gouttelettes (voir l’étape suivante).
3. Vortex le mélange maître préparé brièvement pour mélanger et aliquoter le volume requis (22 μL moins le volume d’ADN d’entrée) dans chaque puits d’une plaque PCR 96 puits de génération de gouttelettes. Disposer les échantillons en colonnes entières sur la plaque de 96 puits; remplir tous les puits vides dans des colonnes incomplètes avec le mélange principal et les utiliser comme NTC.
4. Ajouter l’ADN d’entrée à chaque puits d’échantillon et un tampon d’eau/élution sans nucléase aux puits NTC pour porter le volume total de chacun à 22 μL.
5. Sceller la plaque avec un joint adhésif et la placer sur un agitateur à 2 000 tr/min pendant 1 min, puis centrifuger à 1 000 x g pendant une minute à 4 °C.
6. Placez l’assiette sur de la glace et passez à l’étape 4.
   REMARQUE : Les plaques préparées peuvent être entreposées sur de la glace et protégées de la lumière pendant de courtes périodes (p. ex. 1 à 2 h) avant de procéder à la génération de gouttelettes.

4. Génération de gouttelettes

REMARQUE : Reportez-vous à la figure 1A pour le schéma du pont d’instruments du générateur de gouttelettes mentionné dans cette section.

1. Allumez le générateur de gouttelettes.
2. Vérifiez qu’une bouteille d’huile génératrice de gouttelettes est chargée à la position E du pont des instruments. Si vous y êtes invité, suivez les instructions à l’écran pour remplacer la bouteille.
3. Cliquez sur Configurer la plaque d’échantillonnage sur l’écran tactile. Sélectionnez toutes les colonnes de la plaque d’échantillonnage qui contiennent des échantillons/blancs.
   REMARQUE : La saisie du nom de la plaque et des détails de l’expérience à cette étape est facultative et n’est pas nécessaire pour continuer à configurer l’expérience.
4. Cliquez sur OK pour confirmer la configuration de la plaque ; Des voyants orange s’allumeront sur le pont des instruments pour indiquer les positions où les consommables doivent être chargés.
5. Chargez les cartouches du générateur de gouttelettes à la position B sur le pont des instruments de manière à ce que tous les voyants deviennent verts.
6. Placer une auge à déchets vide dans la position C du pont des instruments.
7. Retirez les couvercles des boîtes d’embout du filtre et chargez-les à la position D sur la scène de l’instrument afin que tous les voyants deviennent verts.
8. Retirez le joint de la plaque adhésive de la plaque d’échantillonnage et chargez-le à la position F du pont d’instruments de sorte que le voyant passe au vert.
9. Placer une plaque vide de collecte de gouttelettes à 96 puits dans un bloc froid (prérefroidi à -20 °C) et charger à la position G du pont d’instruments de sorte que le feu passe au vert.
10. Cliquez sur Start Droplet Generation (Démarrer la génération de gouttelettes ) sur l’écran tactile de l’instrument.
11. Cliquez sur Démarrer l’exécution sur l’écran tactile de l’instrument. Le couvercle de l’instrument se ferme automatiquement. Après l’initialisation, le temps restant jusqu’à ce que la génération de gouttelettes soit terminée s’affiche sur l’écran tactile de l’instrument.
12. Une fois la génération de gouttelettes terminée, vérifier visuellement la plaque de prélèvement de l’échantillon pour confirmer qu’une couche d’émulsion de gouttelettes est présente au-dessus de la phase huileuse dans chaque puits (figure 1B).
    REMARQUE: Si une couche d’émulsion de gouttelettes n’est pas visible, ne poursuivez pas l’expérience et vérifiez les erreurs qui ont pu se produire lors des étapes précédentes du protocole.
13. Retirez les consommables usagés du pont des instruments et videz l’auge à déchets.
14. Mettez le scellant à plaques, réglez la température à 180 °C et le temps d’étanchéité à 5 s, et laissez la machine atteindre la température de fonctionnement.
15. Placez la plaque de prélèvement d’échantillons dans le porte-plaque de scellant et placez un nouveau joint en aluminium sur le dessus de la plaque avec la ligne rouge tournée vers le haut. Veillez à ne pas toucher le dessous du joint en aluminium.
    REMARQUE : Le porte-plaque doit être entreposé à température ambiante (RT) et placé dans le tiroir du scellant à plaques uniquement lorsqu’un joint en aluminium est appliqué pour empêcher le transfert de chaleur vers la plaque de prélèvement d’échantillons.
16. Lorsque le scellant à plaques a atteint la température de fonctionnement, appuyez sur Eject sur l’écran tactile de l’instrument; Le tiroir s’ouvrira automatiquement.
17. Placez le porte-plaque dans le tiroir du scellant de plaque et appuyez sur Seal. Le tiroir se fermera automatiquement, puis s’ouvrira à nouveau une fois le scellage terminé.
18. Replacez la plaque scellée sur le bloc froid, éteignez le scellant de plaque et passez immédiatement à l’étape 5.
    REMARQUE: À ce stade, les gouttelettes sont instables, alors assurez-vous que l’étape de PCR est commencée dans les 1 heure suivant la fin de la génération de gouttelettes.

5. PCR

1. Placez la plaque de collecte de gouttelettes scellée sur un cycleur PCR équipé d’un bloc de puits de 96 puits profonds et exécutez le protocole de cyclage thermique décrit dans le tableau 3.
   REMARQUE : Régler la température du couvercle chauffé à 105 °C et le volume de l’échantillon à 40 μL. Les étapes de dénaturation et de recuit/extension doivent inclure une vitesse de rampe de température de 2 °C/s pour s’assurer que l’huile a le temps de s’équilibrer à la bonne température.
2. Passez à l’étape 6.
   REMARQUE: Une fois le protocole de cyclage thermique terminé, les gouttelettes sont plus stables et la plaque peut être stockée jusqu’à 4 jours à 4 ° C avant de passer à l’étape suivante.

6. Lecture des gouttelettes

1. Mettez sous tension le lecteur de gouttelettes et l’ordinateur connecté.
2. Vérifiez les niveaux de liquide dans les bouteilles d’huile et de déchets du lecteur de gouttelettes et remplissez/videz-les, respectivement, si nécessaire.
3. Chargez la plaque contenant les échantillons post-PCR dans le support de plaque du lecteur de gouttelettes, placez le couvercle sur le support et fixez-le en place avec les clips de verrouillage noirs. Ne retirez pas le couvercle en aluminium de la plaque d’échantillonnage.
4. Appuyez sur le bouton Ouvrir/Fermer sur le couvercle du lecteur de gouttelettes pour l’ouvrir.
5. Chargez le porte-plaque de lecture de gouttelettes contenant la plaque d’échantillon dans la chambre de lecture et placez-le solidement sur la base magnétique.
6. Appuyez sur le bouton Ouvrir/Fermer du couvercle du lecteur de gouttelettes pour le fermer.
7. Ouvrez l’interface du logiciel d’analyse, sélectionnez l’onglet Ajouter une plaque et préparez une nouvelle plaque d’échantillonnage comme suit :
   1. Cliquez sur Ajouter une plaque, puis sur Configurer la plaque.
   2. Dans l’onglet Informations sur la plaque, entrez un nom de plaque, sélectionnez Supermix for Probes (no dUTP) dans le menu déroulant Supermix et entrez un nom de fichier sous Enregistrer le fichier de données sous.
   3. Dans l’onglet Sélection de puits , mettez en surbrillance les puits à analyser et cliquez sur Inclure les puits sélectionnés.
      REMARQUE : Les étapes 6.7.4 à 6.7.7 sont facultatives.
   4. Dans l’onglet Informations sur le puits , sélectionnez les puits à annoter.
      REMARQUE : reportez-vous à la figure 1D pour obtenir un exemple de l’interface de l’onglet Informations sur le puits .
   5. Sélectionnez Quantification directe (DQ) dans le menu déroulant Type d’expérience, remplissez les zones Description de l’échantillon, Type d’échantillon et Nom de la cible, et ajoutez des notes de puits et/ou des notes de plaque selon vos besoins.
   6. Cliquez sur Appliquer. Les informations contenues dans les champs seront appliquées aux puits sélectionnés.
   7. Répétez les étapes 6.7.4 à 6.7.6 jusqu’à ce que tous les puits d’échantillonnage aient été annotés.
8. Une fois la configuration de la plaque terminée, cliquez sur Démarrer l’exécution.
9. Lorsque l’exécution est terminée, jeter la plaque d’échantillon vide et vider la bouteille à déchets du lecteur de gouttelettes si nécessaire.
10. Passez à l’étape 7.

7. Analyse des résultats

REMARQUE: Le lecteur de gouttelettes mesure l’intensité de fluorescence dans le canal FAM et HEX pour chaque gouttelette dans un échantillon. Dans un test réussi, les gouttelettes appartiennent à l’une des deux catégories suivantes pour chaque sonde : négative (ce qui signifie que la cible n’était pas présente dans la gouttelette) ou positive (ce qui signifie que la cible était présente dans la gouttelette). Avant d’analyser les échantillons, assurez-vous que chaque puits contient > 10 000 gouttelettes et a deux populations clairement distinctes de gouttelettes à faible fluorescence (négative) et à fluorescence élevée (positive) dans chaque canal (figure 2A).

1. Sélectionnez l’onglet Analyse des données et ouvrez le fichier à analyser dans le menu Mes fichiers de données .
2. Cliquez sur l’onglet Amplitude 1D pour les expériences monocolores ou sur l’onglet Amplitude 2D pour les expériences bicolores.
3. Appliquez un seuil de fluorescence à chaque canal pour différencier les gouttelettes positives et négatives. Le logiciel d’analyse tentera d’appliquer un seuil automatique échantillon par échantillon et canal par canal, mais si cela semble avoir échoué ou semble inexact, appliquez manuellement le seuil comme suit :
   1. Sélectionnez les puits qui nécessitent un seuillage.
   2. Appliquez manuellement le seuil dans l’espace libre entre les populations positives et négatives sur le diagramme d’amplitude à l’aide de l’outil Mode ligne de seuil . Lorsque vous définissez des seuils manuels en vue 2D, assurez-vous que le réticule est placé de manière à ce que les quatre populations de gouttelettes (double négatif, FAM simple positif, HEX positif simple et double positif) soient clairement séparées.
      REMARQUE : Le seuillage peut être effectué puits par puits ou appliqué à plusieurs puits à la fois.
4. Une fois qu’un seuil a été appliqué à tous les échantillons, exportez les résultats sous forme de fichier .csv pour une analyse plus approfondie en cliquant sur l’onglet Tableau de données, en cliquant sur Importer/ Exporter et en sélectionnant Exporter les données visibles au format CSV. Entrez un nom de fichier approprié et cliquez sur Enregistrer.
5. Calculez le nombre de copies d’ADNmt dans l’échantillon initial comme suit :
   Nombre de copies = concentration cible d’ADNmt × 22 × 1/fraction de l’apport total de lysat
   REMARQUE: Si deux sondes mitochondriales sont utilisées, la concentration des deux cibles est moyennée avant de faire le calcul. Pour les échantillons contenant plus d’une cellule, le nombre de copies par cellule est calculé en divisant par le nombre de cellules de l’échantillon. Il est important d’utiliser la valeur de « concentration » (c.-à-d. le nombre de copies par microlitre) multipliée par le volume initial de l’échantillon de 22 μL, plutôt que la valeur « Copies par 20 μL » calculée dans le fichier .csv, puisque les copies d’ADNmt laissées dans le surtitrage de 2 μL requis par le générateur de gouttelettes doivent être prises en compte lors du calcul du nombre absolu de copies de l’échantillon initial.
6. Pour les cellules porteuses de délétions hétéroplasmiques d’ADNmt, calculer le nombre de copies en utilisant les résultats de la cible d’ADNmt en dehors de la région supprimée (c.-à-d. la cible présente dans les molécules d’ADNmt supprimées et WT). L’hétéroplasmie de délétion est calculée en utilisant les concentrations de la cible à l’intérieur de la région supprimée et de la cible à l’extérieur de la région supprimée comme suit :
   

Résultats

Après la génération de gouttelettes, une couche transparente de gouttelettes opaques est visible flottant au-dessus de la phase pétrolière dans chaque puits (Figure 1B). La formation de gouttelettes peut être affectée négativement par la présence de détergents dans le lysat d’entrée lors de la réalisation d’expériences sur des cellules individuelles. En utilisant le protocole de lyse décrit au point 2.1.2., des rendements en gouttelettes supérieurs au niveau recommandé de...

Discussion

Le protocole décrit ici est applicable à un large éventail de types de cellules et d’espèces en plus de ceux discutés ci-dessus, bien qu’une optimisation minutieuse des nouveaux modèles de dosage soit essentielle pour garantir que la précision et la répétabilité de la méthode sont maintenues lors de l’abandon des combinaisons amorce/sonde précédemment validées. Lorsque vous travaillez avec des cellules individuelles, il est essentiel de s’assurer que le prélèvement d’échantillons est effectué ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
50% Tween-20 solution	Novex	3005
Automated droplet-generating oil	Bio Rad	1864110	Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)
C1000 PCR machine with deep-well block	Bio Rad	1851197	PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)
Collection plate cooling block	Bio Rad	12002819	Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)
ddPCR 96-well plates	Bio Rad	12001925	96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)
ddPCR droplet reader oil	Bio Rad	1863004	Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio Rad	1863023	Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)
DG32 automated droplet generator cartridges	Bio Rad	1864108	Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)
Fetal bovine serum	Gibco	10270-106	Qualified fetal bovine serum
Foil plate covers	Bio Rad	1814040	Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)
HEK 293T cells	Takara	632180	Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen
HeLa cells	ECACC	93021013	Human cervix epitheloid carcinoma cells
High glucose DMEM	Gibco	13345364	4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate
Human cybrids	University of Miami
Mouse embryonic fibroblasts	Newcastle University	Immortalized from C57Bl/6 mice
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
PCR plate seals	Pierce	SP-0027	Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)
Pipet Tip Waste Bins	Bio Rad	1864125	Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)
Pipet tips for AutoDG system	Bio Rad	1864120	Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)
Primary human dermal fibroblast cells	Newcastle Biobank
Primers/Probes	IDT	N/A	Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1
Proteinase K 20 mg/mL solution	Ambion	AM2546
PX1 PCR plate sealer	Bio Rad	1814000	Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)
QX Manager software	Bio Rad	12012172	Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7)
QX200 AutoDG droplet generator	Bio Rad	1864101	Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)
QX200 droplet reader	Bio Rad	1864003	Droplet reader (used in Protocol Step 6)
Trizma pre-set crystals pH 8.3	Sigma	T8943-100G