Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

Özet

Protokol, bir doku temizleme yöntemi olan ScaleSF kullanılarak beyin diliminde ayrıntılı bir nöronal görüntüleme yöntemi sağlar. Protokol, beyin dokusu hazırlama, doku berraklaştırma, temizlenmiş dilimlerin işlenmesi ve nöronal yapıların mezoskopikten mikroskobik seviyelere kadar konfokal lazer taramalı mikroskopi görüntülemesini içerir.

Özet

Burada beyin dokularında mezoskopik seviyelerden mikroskobik seviyelere kadar nöronal yapıları görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Nöral devrelerden hücre altı nöronal yapılara kadar değişen nöronal yapılar, ScaleSF ile optik olarak temizlenmiş fare beyin dilimlerinde görselleştirilir. Bu temizleme yöntemi, ScaleS'nin modifiye edilmiş bir versiyonudur ve güçlü temizleme kabiliyetinin yanı sıra floresan sinyallerinin ve yapısal bütünlüğün yüksek düzeyde korunmasını sağlayan doku dilimleri için hidrofilik bir doku temizleme yöntemidir. Özelleştirilebilir üç boyutlu (3D) baskılı görüntüleme odası, temizlenmiş beyin dokularının güvenilir bir şekilde monte edilmesi için tasarlanmıştır. Gelişmiş yeşil floresan protein geni taşıyan adeno ilişkili bir virüs vektörü ile enjekte edilen fare beyinleri,% 4 paraformaldehit ile sabitlendi ve titreşen bir doku dilimleyici ile 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesildi. Beyin dilimleri, Sca l eS0 çözeltisi, fosfat tampon salin (-) ve ScaleS4 çözeltisi olmak üzere üç çözeltide sıralı inkübasyonları içeren temizleme protokolü izlenerek toplam 10.5-14.5 saat boyunca temizlendi. Temizlenmiş beyin dilimleri görüntüleme odasına monte edildi ve ScaleS4D25 (0) çözeltisinde çözünmüş% 1.5 agaroz jeline gömüldü. Dilimlerin 3D görüntü alımı, uzun bir çalışma mesafesine sahip çok daldırmalı objektif bir lens ile donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak gerçekleştirildi. Mezoskopik nöronal görüntüleme ile başlayarak, optik olarak temizlenmiş beyin dilimlerinde dendritik dikenler ve aksonal butonlar gibi ince hücre altı nöronal yapıları görselleştirmeyi başardık. Bu protokol, devreden hücre altı bileşen ölçeklerine kadar nöronal yapıların anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.

Giriş

Doku temizleme yöntemleri, biyolojik ve klinik örneklerin ışık mikroskobu ile derinlikten bağımsız görüntülenmesini geliştirerek bozulmamış dokular üzerindeki yapısal bilgilerin çıkarılmasına olanak sağlamıştır ^1,2. Optik temizleme teknikleri de potansiyel olarak hızlanabilir ve histolojik analiz maliyetini azaltabilir. Şu anda, üç ana temizleme yaklaşımı mevcuttur: hidrofilik, hidrofobik ve hidrojel bazlı yöntemler ^1,2. Hidrofilik yaklaşımlar floresan sinyallerini ve doku bütünlüğünü korumada aşar ve diğer iki yaklaşıma kıyasla daha az ^{toksiktir 3,4}.

Bir hidrofilik temizleme yöntemi olan ScaleS, yapısal ve moleküler bütünlüğün korunmasının yanı sıra güçlü temizleme kabiliyeti (temizleme-koruma spektrumu) ile ayırt edici bir konuma ^sahiptir5. Önceki bir çalışmada, Sca l eS^6'nın temizleme prosedürünü değiştirerek doku dilimleri (~ 1 mm kalınlığında) için hızlı ve izometrik bir temizleme protokolü olan ScaleSF'yi geliştirdik. Bu temizleme protokolü, beyin dilimlerinin 10.5-14.5 saat boyunca üç çözeltide sıralı inkübasyonunu gerektirir. Yöntem, elektron mikroskobu (EM) analizi (Ek Şekil 1) ile bile uyumlu olan ve doğru sinyal rekonstrüksiyonu ile çok ölçekli yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) görüntülemeye izin veren yüksek bir temizleme-koruma spektrumu ile donatılmıştır⁶. Bu nedenle, ScaleSF, özellikle nöronal hücrelerin muazzam uzunlukta coşkulu süreçleri detaylandırdığı ve bilgi iletmek ve almak için uzmanlaşmış ince hücre altı yapıları düzenlediği beyinde etkili olmalıdır. Nöronal hücreler üzerinde devreden hücre altı seviyelere kadar olan ölçeklerle yapısal bilginin çıkarılması, beyin fonksiyonlarının daha iyi anlaşılması için oldukça yararlıdır.

Burada, ScaleSF kullanarak mezoskopik / devreden mikroskobik / hücre altı seviyeye kadar ölçeklerle nöronal yapıları görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, doku hazırlama, doku berraklaştırma, temizlenmiş dokuların işlenmesi ve temizlenmiş dokuların konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) görüntülemesini içerir. Protokolümüz, devreden hücre altı bileşen ölçeklerine kadar nöronal yapıları sorgulamaya odaklanmaktadır. Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörlerinin fare beyinlerine çözeltilerinin hazırlanması ve stereotaksik enjeksiyonu için ayrıntılı bir prosedür için, sırasıyla Miyawaki ve ark. 2016⁷ ve Okamoto ve ark. 2021^8'e bakınız.

Protokol

Tüm deneyler, Juntendo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (Onay No. 2021245, 2021246) tarafından onaylanmış ve Japonya Bilim Konseyi (2006) tarafından Hayvan Deneylerinin Uygun Şekilde Yürütülmesi için Temel Kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Burada, gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) geni taşıyan AAV vektörü enjekte edilen erkek C57BL/6J fareler ve parvalbümin (PV)/miristoilasyon-EGFP-düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü C-terminal bakteriyel yapay kromozom (BAC) transgenik fareler (PV-FGL fareler)⁹ kullanılmıştır. PV-FGL fareler C57BL/6J arka planda tutuldu. Bu çalışma ile ilgili olarak cinsiyete dayalı herhangi bir farklılık bulunmamıştır.

1. Doku hazırlığı

1. Perfüzyon fiksasyonu
   NOT: Paraformaldehit'e (PFA) maruz kalmayı sınırlamak için duman başlığında 1.1.1 ile 1.1.3 arasındaki adımları uygulayın.
   1. Yetişkin erkek fareleri (8-16 haftalık) aşırı dozda sodyum pentobarbital (200 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi altına alın. Ayak parmağını sıkıştırma geri çekilmesi ve göz kırpma reflekslerinin yokluğu ile anestezinin yeterliliğini onaylayın.
   2. Göğüs boşluğunu açın ve sağ atriyal uzantıyı cerrahi makasla kesin. 20 mL'lik bir şırıngaya bağlı 23 G'lik bir iğne kullanarak fareleri 20 mL buz gibi soğuk fosfat tampon salini (PBS) ile perfüze edin, ardından başka bir 20 mL şırınga kullanılarak 0.1 M fosfat tamponunda (PB) 20 mL buz soğuk% 4 PFA'nın perfüzyonu ile perfüzyon yapın.
      DİKKAT: PFA toksik ve teratojeniktir. Solumaktan veya cilt, göz ve mukoza zarı ile temastan kaçının.
   3. Beyin dokularını kafatasından cımbızla çıkarın. Beyin dokularını 0.1 M PB'de% 4 PFA içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın, örnekleri ışıktan koruyun ve 50-100 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de gece boyunca hafifçe sallayın.
   4. NOT: Hasat edilen beyin dokuları, 4 ° C'de PBS'de% 0.02 sodyum azid (NaN₃) içinde birkaç hafta saklanabilir.
      DİKKAT: NaN₃ toksiktir. Solumaktan veya cilt, göz ve mukoza zarı ile temastan kaçının. Bir duman başlığının içinde tutun.
2. Beyin dilimi hazırlama
   1. 50 mL PBS'ye 2 g agar ekleyerek PBS'de% 4 agar hazırlayın. Agar tamamen çözünene kadar karışımı mikrodalgada pişirin. Çözeltiyi 40-45 °C'ye soğumaya bırakın.
      NOT: Agarın önemli bir bileşeni olan agaropektin tarafından sağlanan viskoz özellik, doku dilimlerinin kesilmesini kolaylaştırır.
   2. 6 delikli bir kültür plakasına 10 mL agar çözeltisi ekleyin. Forseps kullanarak beyin dokusunu agar çözeltisine batırın. Agarın buz üzerinde katılaşmasına izin verin.
   3. Gömülü beyin dokusunu kuyudan çıkarın ve agar'ı bir tıraş bıçağı ile kesin. Agar bloğunu vibratom banyosunun dibine süper yapıştırıcı ile sabitleyin ve tampon tepsisine 0,1 M PB dökün.
   4. Etanol içine batırılmış tüy bırakmayan bir kağıt mendil kullanarak başka bir tıraş bıçağını temizleyin ve bıçağı titreşimli doku dilimleyicinin bıçak tutucusuna takın.
   5. Kesit hızını 1,4 mm genlikle 0,14 mm / s'ye ve frekansı 75-77 Hz'ye ayarlayın. beyin dokusunu 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesin ve dilimleri PBS içeren 6 delikli bir hücre kültürü plakasında toplayın.
      NOT: Beyin dilimleri birkaç hafta boyunca PBS'de 4 °C'de% 0.02 NaN_3'te saklanabilir.

2. Doku berraklaştırma

NOT: Kullanılan ScaleS çözümlerinin bileşimleri Tablo 1'de listelenmiştir. Numuneler bir folyo ile kaplanarak ışıktan korunmalıdır. Temizleme adımları Şekil 1A'da gösterilmiştir.

1. 6 delikli hücre kültürü plakasının bir ocağına 8 mL Sca l eS0 çözeltisi ekleyin ve plakanın başka bir kuyucuğuna 8mLScaleS4 çözeltisi ekleyin ve bir inkübatörde 37 ° C'ye kadar önceden ısıtın.
2. Beyin dilimlerini bir spatula ile önceden ısıtılmış ScaleS0 çözeltisine aktarın ve 90 rpm'de sallanan bir inkübatörde 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin.
3. Geçirgenleştirilmiş beyin dilimlerini 8 mL PBS (-) içinde 6 delikli bir hücre kültürü plakasına spatula ile aktarın ve 40-60 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda tutarak 15 dakika boyunca yıkayın. Bunu iki kez tekrarlayın.
4. Beyin dilimlerini önceden ısıtılmış 8 mL ScaleS4 çözeltisine bir spatula ile aktarın ve 37 ° C'de 8-12 saat boyunca 90 rpm'de çalkalayıcı bir inkübatörde inkübe ederek temizleyin. Temizlenmiş bir beyin dilimleri Şekil 1'de görülebilir.

3. Beyin dilimi montajı

NOT: Temizlenmiş beyin dilimlerinin güvenilir montajı için özelleştirilebilir bir görüntüleme odası kullanılır (Şekil 2)⁶. Oda, hazne çerçevesi ve alt kapak kaymasından oluşur. Mikroskop aşaması adaptörleri ayrıca görüntüleme odasını doğrudan mikroskop aşamalarına monte etmek için tasarlanmıştır (Şekil 2A, B). Oda çerçevesi ve mikroskop sahne adaptörleri, şirket içi veya dış kaynaklı 3D baskı hizmetleri kullanılarak 3D yazdırılabilir. Görüntüleme odasının 3D bilgisayar destekli tasarım (CAD) verileri Furuta et al. 2022^6'da verilmiştir.

1. Hazne hazırlığı için, oda çerçevesini basınca duyarlı bir yapıştırıcı kullanarak bir kapak kapağına takın.
2. Bir şişedeki çözeltinin 100 mL'sine 1,5 g agaroz ekleyerek Sca l eS4D25 (0) çözeltisinde (ScaleS4 jel) %1,5 agaroz hazırlayın. Agaroz tamamen çözünene kadar çözeltiyi karıştırarak ve mikrodalgada pişirerek çözeltiyi iyice karıştırın. İşiniz bittiğinde, çözeltinin 37 ° C'ye soğumasını bekleyin.
3. Temizlenmiş beyin dilimini bir spatula ile görüntüleme odasının alt kapağına monte edin. Temizlenmiş dilimdeki fazla çözeltiyi temiz bir tüy bırakmayan mendil kağıdı kullanarak silin.
4. ScaleS4 jelini, görüntüleme odasını doldurmak için bir mikropipet kullanarak beyin dilimine ekleyin. Forseps ile üstüne başka bir örtü parçası yerleştirin ve bu sırayla kapak kapağına bir parça tüy bırakmayan kağıt mendil ve bir cam slayt yerleştirin.
5. Görüntüleme odasını 4 °C'de bir buzdolabına aktarın. Metal ağırlıkları cam slaytın üzerine yerleştirin ve 30 dakika bekletin.
6. Metal ağırlıkları, cam kızağı, tüy bırakmayan kağıt mendili ve kapak kaymasını görüntüleme odasından çıkarın ve fazla jeli silin (Şekil 2A, B).
7. Görüntüleme odasını 60 mm'lik cam Petri kabına yerleştirin ve görüntüleme odasının kenarını macun benzeri basınca duyarlı bir yapıştırıcı ile kabağa takın. Odayı Petri kabına birden fazla noktadan takın.
8. ScaleS4 çözeltisini tabağa dökün ve 40-60 rpm'de bir yörüngesel çalkalayıcı üzerinde 20-25 ° C'de 1 saat boyunca hafifçe çalkalayın. Taze çözelti ile değiştirin ve 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak yüzeyi nazikçe kazıyarak jel yüzeyindeki hava kabarcıklarını giderin. Daldırılmış görüntüleme odasını mikroskop aşamasına monte edin (Şekil 2C).

4. CLSM görüntüleme

1. Uzun çalışma mesafesine (WD) sahip çok daldırmalı objektif lensle donatılmış bir CLSM kullanarak görüntüler elde edin (16x/0,60 sayısal diyafram açıklığı [NA], WD = 2,5 mm).
   NOT: Yüksek NA objektif lensler yüksek kırınım sınırlı çözünürlük sağlayabilir.
2. İlgili tüm görüntüleme ekipmanlarını (iş istasyonu, mikroskop, tarayıcı, lazerler ve cıva lambası) açın ve bir CLSM görüntüleme yazılımı başlatın.
3. Çok daldırmalı objektif lensin düzeltme yakasını 1,47'ye ayarlayın. ScaleS4 çözeltisi yaklaşık 1.47 ^5,7 kırılma indisine (RI) ^sahiptir. RI uyumsuzluğuna bağlı sapmalar görüntü oluşumunu bozabilir (Şekil 3).
4. Objektif lensi çözeltiye daldırın ve dilime yavaşça yaklaşmasına izin verin. Objektif lensin ucunda sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarın. Epifloresan kullanarak temizlenmiş dokulardaki ilgi alanlarını (ROI'ler) bulun.
5. Uygun ayarları test ederek görüntü alma parametrelerini ayarlayın.
   1. Görüntü yakalama için bit derinliğini belirleyin. Görüntünün veri boyutu bit derinliği ile birlikte artar.
   2. Algılama dalga boyunu ayarlayın. Dedektör için uygun kapıyı emisyon spektrumuna göre ayarlayın. Algılama dalga boyunun herhangi bir lazer çizgisini kapsamadığından emin olun.
   3. xy çözünürlüğünü ayarlayın. Daha büyük formatlar daha iyi xy çözünürlükleri sağlar, ancak görüntülerin toplanması daha uzun zaman alır.
   4. Tarama hızını ayarlayın. Daha yavaş bir tarama hızı, yüksek sinyal-gürültü oranı sağlar. Bununla birlikte, piksel bekleme süresini ve fotobeyazlatma riskini de artırır. Buna göre seçim yapın.
   5. İğne deliği boyutunu ayarlayın. İğne deliği boyutu optik bölüm kalınlığını kontrol eder. Daha küçük bir iğne deliği boyutu daha ince bir optik bölüm oluşturur ve böylece daha iyi z çözünürlüğü sağlar, ancak floresan sinyalini azaltır. İğne deliği boyutunu büyütmek, daha güçlü floresan sinyaline sahip daha kalın bir optik bölüm sağlar.
   6. Lazer gücünü, dedektör / amplifikatör kazancını ve ofseti ayarlayın. Uygun bir görüntü elde edilene kadar lazer gücünü ve dedektör/amplifikatör kazancını kademeli olarak artırın. Yüksek lazer gücü fotobeyazlatma riski taşır. Yüksek sinyal-gürültü oranı elde etmek için ofseti (kontrastı) uygun şekilde ayarlayın.
   7. Yatırım getirisinin boyutuna bağlı olarak gereken döşeme alanını belirleyin. Yatırım getirisinin tüm uzunluğunun ve genişliğinin yakalandığından emin olun.
   8. Tüm düzlemlerde temizlenmiş dokularda gezinin ve yığının başlangıç ve bitiş noktalarını ayarlayın. Z-adım boyutunu istenen z-çözünürlüğüne göre ayarlayın.
6. Görüntü alma ayarlarından memnun kaldığınızda görüntüleri toplayın ve yakalanan görüntüleri kaydedin. Bir görüntü analiz yazılımı kullanarak görüntüleri işleyin.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak 1 mm kalınlığında bir fare beyin diliminin optik olarak temizlenmesi sağlandı. Şekil 1B, temizleme işleminden önce ve sonra bir fare beyin diliminin iletim görüntülerini temsil eder. Doku temizleme yöntemi, 1 mm kalınlığında bir fare beyin dilimini şeffaf hale getirdi. Temizleme çözeltisinde 12 saat boyunca inkübasyondan sonra beyin dilimlerinin son boyutlarında hafif bir genişleme bulundu (doğrusal genişleme: % 102.5 ±% 1.3). PV-FGL farelerde floresan...

Tartışmalar

Protokol içindeki kritik adımlar
Protokolde, anlamlı sonuçlar elde etmek için azami dikkatle yürütülmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Numunelerin düzgün bir şekilde sabitlenmesi, büyük ölçekli dokularda 3D görüntüleme için zorunludur. Objektif lens, numune ve daldırma sıvısı eşleşen RI'ya sahip olmalıdır. Aralarındaki RI-uyumsuzluğu, temizlenmiş beyin dilimleri içindeki EGFP eksprese eden hücrelerin oldukça rahatsız edici görüntülenmesine yol açacaktır (...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x multi-immersion objective lens	Leica Microsystems	HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
Agar	Nacalai Tesque	01028-85
Agarose	TaKaRa Bio	L03
Dimethyl sulfoxide	Nacalai Tesque	13407-45
D-Sorbitol	Nacalai Tesque	06286-55
γ-cyclodextrin	Wako Pure Chemical Industries	037-10643
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Huygens Essential	Scientific Volume Imaging	ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
Imaris	Bitplane	ver. 9.0.0
Leica Application Suite X	Leica Microsystems	LAS X, ver. 3.5.5.19976
Methyl-β-cyclodextrin	Tokyo Chemical Industry	M1356
Paraformaldehyde	Merck Millipore	1.04005.1000
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)	Nacalai Tesque	27575-31	10x PBS(–)
Sodium azide	Nacalai Tesque	31233-55
Sodium pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
TCS SP8	Leica Microsystems	N/A
Triton X-100	Nacalai Tesque	35501-15
Urea	Nacalai Tesque	35940-65
Vibrating tissue slicer	Dosaka EM	PRO7N