Un metodo di compensazione dei tessuti per l'imaging neuronale dalle scale mesoscopiche a quelle microscopiche

Riepilogo

Il protocollo fornisce un metodo dettagliato di imaging neuronale nella fetta di cervello utilizzando un metodo di compensazione dei tessuti, ScaleSF. Il protocollo include la preparazione del tessuto cerebrale, la chiarificazione dei tessuti, la manipolazione di fette ripulite e l'imaging al microscopio a scansione laser confocale di strutture neuronali da mesoscopiche a livelli microscopici.

Abstract

Qui viene fornito un protocollo dettagliato per visualizzare le strutture neuronali dai livelli mesoscopici a quelli microscopici nei tessuti cerebrali. Le strutture neuronali che vanno dai circuiti neurali alle strutture neuronali subcellulari sono visualizzate in fette di cervello di topo otticamente cancellate con ScaleSF. Questo metodo di compensazione è una versione modificata di ScaleS ed è un metodo di compensazione del tessuto idrofilo per fette di tessuto che raggiunge una potente capacità di compensazione e un alto livello di conservazione dei segnali di fluorescenza e integrità strutturale. Una camera di imaging tridimensionale (3D) personalizzabile è progettata per il montaggio affidabile di tessuti cerebrali eliminati. I cervelli di topo iniettati con un vettore virale adeno-associato che trasporta un gene proteico fluorescente verde potenziato sono stati fissati con paraformaldeide al 4% e tagliati in fette di spessore di 1 mm con un'affettatrice di tessuto vibrante. Le fette di cervello sono state eliminate seguendo il protocollo di compensazione, che include incubazioni sequenziali in tre soluzioni, vale a dire, soluzione ScaleS0, soluzione salina tampone fosfato (–) e soluzione ScaleS4, per un totale di 10,5-14,5 ore. Le fette di cervello eliminate sono state montate sulla camera di imaging e incorporate in gel di agarosio all'1,5% disciolto nella soluzione ScaleS4D25(0). L'acquisizione dell'immagine 3D delle fette è stata effettuata utilizzando un microscopio a scansione laser confocale dotato di una lente obiettivo multi-immersione di una lunga distanza di lavoro. Iniziando con l'imaging neuronale mesoscopico, siamo riusciti a visualizzare le strutture neuronali subcellulari fini, come le spine dendritiche e i bouton assonali, nelle fette di cervello otticamente cancellate. Questo protocollo faciliterebbe la comprensione delle strutture neuronali dalle scale dei circuiti ai componenti subcellulari.

Introduzione

I metodi di compensazione dei tessuti hanno migliorato l'imaging indipendente dalla profondità di campioni biologici e clinici con microscopia ottica, consentendo l'estrazione di informazioni strutturali su tessuti intatti ^1,2. Le tecniche di compensazione ottica potrebbero anche potenzialmente accelerare e ridurre i costi per l'analisi istologica. Attualmente, sono disponibili tre principali approcci di compensazione: metodi idrofili, idrofobici e a base di idrogel ^1,2. Gli approcci idrofili superano nel preservare i segnali di fluorescenza e l'integrità dei tessuti e sono meno tossici rispetto agli altri due approcci ^3,4.

Un metodo di compensazione idrofila, ScaleS, occupa una posizione distintiva per la sua conservazione dell'integrità strutturale e molecolare e per la potente capacità di compensazione (spettro di compensazione-conservazione)⁵. In uno studio precedente, abbiamo sviluppato un protocollo di compensazione rapida e isometrica, ScaleSF, per fette di tessuto (~ 1 mm di spessore) modificando la procedura di compensazione di ScaleS⁶. Questo protocollo di compensazione richiede incubazioni sequenziali di fette di cervello in tre soluzioni per 10,5-14,5 ore. Il metodo è caratterizzato da un elevato spettro di conservazione della compensazione, che è compatibile anche con l'analisi al microscopio elettronico (EM) (Figura supplementare 1), consentendo l'imaging tridimensionale (3D) ad alta risoluzione su più scale con un'accurata ricostruzione del segnale⁶. Pertanto, ScaleSF dovrebbe essere efficace soprattutto nel cervello, dove le cellule neuronali elaborano processi esuberanti di lunghezza enorme e organizzano strutture subcellulari fini specializzate per trasmettere e ricevere informazioni. Estrarre informazioni strutturali con scale dal circuito ai livelli subcellulari sulle cellule neuronali è molto utile per una migliore comprensione delle funzioni cerebrali.

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per visualizzare le strutture neuronali con scale dal mesoscopico / circuito al livello microscopico / subcellulare utilizzando ScaleSF. Il protocollo include la preparazione dei tessuti, la chiarificazione dei tessuti, la manipolazione dei tessuti eliminati e l'imaging al microscopio a scansione laser confocale (CLSM) dei tessuti cancellati. Il nostro protocollo si concentra sull'interrogazione delle strutture neuronali dalle scale dei circuiti ai componenti subcellulari. Per una procedura dettagliata per la preparazione delle soluzioni e l'iniezione stereotassica di vettori di virus adeno-associati (AAV) nel cervello dei topi, fare riferimento rispettivamente a Miyawaki et al. 2016⁷ e Okamoto et al. 2021⁸.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali dell'Università juntendo (approvazione n. 2021245, 2021246) ed eseguiti in conformità con le linee guida fondamentali per una corretta conduzione degli esperimenti sugli animali dal Consiglio scientifico del Giappone (2006). Qui sono stati utilizzati topi maschi C57BL / 6J iniettati con vettore AAV che trasporta il gene della proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) e parvalbumina (PV) / miristoilazione-EGFP-recettore delle lipoproteine a bassa densità C-terminale cromosoma artificiale batterico (BAC) topi transgenici (topi PV-FGL)⁹ . I topi PV-FGL sono stati mantenuti in background C57BL / 6J. Non sono state riscontrate differenze basate sul sesso per quanto riguarda questo studio.

1. Preparazione dei tessuti

1. Fissazione della perfusione
   NOTA: eseguire i passaggi da 1.1.1 a 1.1.3 in una cappa aspirante per limitare l'esposizione alla paraformaldeide (PFA).
   1. Anestetizzare topi maschi adulti (8-16 settimane di età) mediante iniezione intraperitoneale di sovradosaggio di pentobarbital di sodio (200 mg/kg). Confermare l'adeguatezza dell'anestesia dall'assenza di astinenza da pizzicamento delle dita dei piedi e riflessi lampeggianti.
   2. Aprire la cavità toracica e tagliare l'appendice atriale destra con le forbici chirurgiche. Perfondere i topi con 20 mL di soluzione salina tampone fosfato ghiacciato (PBS) utilizzando un ago da 23 G attaccato a una siringa da 20 mL, seguito da una perfusione di 20 mL di PFA al 4% ghiacciato in tampone fosfato da 0,1 M (PB) utilizzando un'altra siringa da 20 mL.
      ATTENZIONE: il PFA è tossico e teratogeno. Evitare l'inalazione o il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose.
   3. Rimuovere i tessuti cerebrali dal cranio con una pinzetta. Trasferire i tessuti cerebrali in un tubo da 15 ml contenente il 4% di PFA in 0,1 M PB, proteggere i campioni dalla luce e oscillare delicatamente durante la notte a 4 °C su uno shaker a 50-100 giri / min.
   4. NOTA: I tessuti cerebrali raccolti possono essere conservati per diverse settimane in azide di sodio allo 0,02% (NaN₃) in PBS a 4 °C.
      ATTENZIONE: NaN₃ è tossico. Evitare l'inalazione o il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. Maneggialo all'interno di una cappa aspirante.
2. Preparazione della fetta di cervello
   1. Preparare il 4% di agar in PBS aggiungendo 2 g di agar a 50 ml di PBS. Microonde la miscela fino a quando l'agar è completamente sciolto. Lasciare raffreddare la soluzione a 40-45 °C.
      NOTA: La proprietà viscosa fornita dall'agaropectina, un componente importante dell'agar, migliora la facilità di taglio delle fette di tessuto.
   2. Aggiungere 10 ml di soluzione di agar a una piastra di coltura a 6 pozzetti. Immergere il tessuto cerebrale nella soluzione di agar usando una pinza. Lascia che l'agar si solidifichi sul ghiaccio.
   3. Rimuovere il tessuto cerebrale incorporato dal pozzo e tagliare l'agar con una lama di rasoio. Fissare il blocco di agar sul fondo del bagno vibratome con supercolla e versare 0,1 M PB nel vassoio tampone.
   4. Pulire un'altra lama di rasoio utilizzando una carta velina priva di lanugine imbevuta di etanolo e fissare la lama al supporto della lama dell'affettatrice vibrante.
   5. Impostare la velocità di sezionamento a 0,14 mm/s con un'ampiezza di 1,4 mm e la frequenza a 75-77 Hz. Tagliare il tessuto cerebrale in fette spesse 1 mm e raccogliere le fette in una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti contenente PBS.
      NOTA: Le fette di cervello possono essere conservate per diverse settimane nello 0,02% di NaN₃ in PBS a 4 °C.

2. Chiarificazione dei tessuti

NOTA: Le composizioni delle soluzioni ScaleS utilizzate sono elencate nella Tabella 1. I campioni devono essere protetti dalla luce coprendo con un foglio. I passaggi di compensazione sono illustrati nella Figura 1A.

1. Aggiungere 8 mL di soluzione ScaleS0 in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti e aggiungere 8 mL di soluzione ScaleS4 ad un altro pozzetto della piastra e preriscaldare a 37 °C in un incubatore.
2. Trasferire le fette di cervello nella soluzione ScaleS0 preriscaldata con una spatola e incubare per 2 ore a 37 °C in un incubatore vibrante a 90 giri/min.
3. Trasferire le fette di cervello permeabilizzate in 8 ml di PBS (–) in una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con una spatola e lavare per 15 minuti mantenendo uno shaker orbitale a 40-60 giri / min. Ripeti l'operazione due volte.
4. Trasferire le fette di cervello negli 8 mL preriscaldati della soluzione di ScaleS4 con una spatola e cancellarle incubandole in un incubatore vibrante a 90 giri/min per 8-12 ore a 37 °C. Una fetta di cervello cancellata può essere vista nella Figura 1.

3. Montaggio della fetta di cervello

NOTA: una camera di imaging personalizzabile viene utilizzata per il montaggio affidabile di fette di cervello cancellate (Figura 2)⁶. La camera è costituita dal telaio della camera e dal coperchio inferiore. Gli adattatori per stadio del microscopio sono inoltre progettati per montare direttamente la camera di imaging sugli stadi del microscopio (Figura 2A,B). Gli adattatori per telaio della camera e stadio del microscopio possono essere stampati in 3D utilizzando servizi di stampa 3D interni o in outsourcing. I dati CAD (Computer-Aided Design) 3D della camera di imaging sono forniti in Furuta et al. 2022⁶.

1. Per la preparazione della camera, collegare il telaio della camera a un coperchio utilizzando un adesivo sensibile alla pressione.
2. Preparare l'1,5% di agarosio in soluzione di ScaleS4D25(0) (gel ScaleS4) aggiungendo 1,5 g di agarosio a 100 ml di soluzione in flacone. Mescolare bene la soluzione mescolando e microonde la soluzione fino a quando l'agarosio è completamente sciolto. Una volta fatto, lasciare raffreddare la soluzione a 37 °C.
3. Montare la fetta di cervello cancellata sul coperchio inferiore della camera di imaging con una spatola. Pulire la soluzione in eccesso dalla fetta eliminata utilizzando una carta velina pulita e priva di lanugine.
4. Aggiungere il gel ScaleS4 sulla fetta di cervello utilizzando una micropipetta per riempire la camera di imaging. Posiziona un altro coverslip sopra con una pinza e posiziona un pezzo di carta velina priva di lanugine e un vetrino sul coperchio in questo ordine.
5. Trasferire la camera di imaging in frigorifero a 4 °C. Posizionare i pesi metallici sul vetrino e lasciarli per 30 minuti.
6. Rimuovere i pesi metallici, il vetrino, la carta velina priva di lanugine e il coperchio dalla camera di imaging e pulire il gel in eccesso (Figura 2A, B).
7. Posizionare la camera di imaging in una capsula di Petri di vetro da 60 mm e fissare il bordo della camera di imaging alla parabola con un adesivo sensibile alla pressione simile a uno stucco. Attaccare la camera in più punti alla capsula di Petri.
8. Versare la soluzione di ScaleS4 nella parabola e agitare delicatamente per 1 ora a 20-25 °C su uno shaker orbitale a 40-60 giri/min. Sostituire con soluzione fresca e rimuovere le bolle d'aria sulla superficie del gel raschiando delicatamente la superficie utilizzando una punta della pipetta da 200 μL. Montare la camera di imaging immersa su uno stadio di microscopio (Figura 2C).

4. Imaging CLSM

1. Acquisire immagini utilizzando un CLSM dotato di un obiettivo multi-immersione a lunga distanza di lavoro (WD) (apertura numerica 16x/0,60 [NA], WD = 2,5 mm).
   NOTA: le lenti ad alto NA possono fornire un'elevata risoluzione limitata alla diffrazione.
2. Accendi tutte le apparecchiature di imaging pertinenti (workstation, microscopio, scanner, laser e lampada al mercurio) e avvia un software di imaging CLSM.
3. Impostare il collare di correzione dell'obiettivo multi-immersione su 1,47. La soluzione ScaleS4 ha un indice di rifrazione (RI) di circa 1,47 ^5,7. Le aberrazioni indotte da mancata corrispondenza del RI possono disturbare la formazione dell'immagine (Figura 3).
4. Immergere l'obiettivo nella soluzione e lasciarlo avvicinare lentamente alla fetta. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate sulla punta della lente dell'obiettivo. Trova le regioni di interesse (ROI) nei tessuti eliminati usando l'epifluorescenza.
5. Impostare i parametri di acquisizione delle immagini testando le impostazioni appropriate.
   1. Determinare la profondità di bit per l'acquisizione delle immagini. La dimensione dei dati dell'immagine aumenta con la profondità di bit.
   2. Impostare la lunghezza d'onda di rilevamento. Regolare il gate appropriato per il rilevatore in base allo spettro di emissione. Assicurarsi che la lunghezza d'onda di rilevamento non copra le linee laser.
   3. Impostare la risoluzione xy . I formati più grandi offrono risoluzioni xy migliori, ma ci vuole più tempo per raccogliere le immagini.
   4. Impostare la velocità di scansione. Una velocità di scansione più lenta fornisce un elevato rapporto segnale-rumore. Tuttavia, aumenta anche il tempo di permanenza dei pixel e il rischio di fotosbiancamento. Scegli di conseguenza.
   5. Regolare la dimensione del foro stenopeico. La dimensione del foro stenopeico controlla lo spessore della sezione ottica. Una dimensione stenopeica più piccola crea una sezione ottica più sottile e quindi una migliore risoluzione z , ma riduce il segnale di fluorescenza. L'ingrandimento delle dimensioni del foro stenopeico fornisce una sezione ottica più spessa con un segnale di fluorescenza più forte.
   6. Impostare la potenza del laser, il guadagno del rilevatore/amplificatore e l'offset. Aumentare gradualmente la potenza del laser e il guadagno del rilevatore/amplificatore fino ad ottenere un'immagine adatta. Un'elevata potenza laser comporta il rischio di fotosbiancamento. Regolare l'offset (contrasto) in modo appropriato per ottenere un elevato rapporto segnale-rumore.
   7. Determinare l'area di lavorazione necessaria in base alle dimensioni del ROI. Assicurati che l'intera lunghezza e larghezza del ROI venga acquisita.
   8. Naviga tra i tessuti eliminati su tutti i piani e imposta i punti iniziale e finale della pila. Impostare la dimensione z-step in base alla risoluzione z desiderata.
6. Raccogli le immagini quando sei soddisfatto delle impostazioni di acquisizione delle immagini e registra le immagini acquisite. Elaborare le immagini utilizzando un software di analisi delle immagini.

Risultati

La compensazione ottica di una fetta di cervello di topo di 1 mm di spessore è stata ottenuta utilizzando questo protocollo. La Figura 1B rappresenta le immagini di trasmissione di una fetta di cervello di topo prima e dopo il trattamento di compensazione. Il metodo di pulizia dei tessuti ha reso trasparente una fetta di cervello di topo spessa 1 mm. Una leggera espansione nelle dimensioni finali delle fette di cervello è stata trovata dopo l'incubazione nella soluzione di compensazione per 12 ore (esp...

Discussione

Passaggi critici all'interno del protocollo
Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo che dovrebbero essere condotti con la massima cautela per ottenere risultati significativi. La fissazione uniforme dei campioni è indispensabile per l'imaging 3D all'interno di tessuti su larga scala. La lente dell'obiettivo, il campione e il fluido di immersione devono avere RI corrispondente. La mancata corrispondenza ri tra loro porterà a un'imaging altamente disturbato delle cellule che esprimono EGFP all'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x multi-immersion objective lens	Leica Microsystems	HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
Agar	Nacalai Tesque	01028-85
Agarose	TaKaRa Bio	L03
Dimethyl sulfoxide	Nacalai Tesque	13407-45
D-Sorbitol	Nacalai Tesque	06286-55
γ-cyclodextrin	Wako Pure Chemical Industries	037-10643
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Huygens Essential	Scientific Volume Imaging	ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
Imaris	Bitplane	ver. 9.0.0
Leica Application Suite X	Leica Microsystems	LAS X, ver. 3.5.5.19976
Methyl-β-cyclodextrin	Tokyo Chemical Industry	M1356
Paraformaldehyde	Merck Millipore	1.04005.1000
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)	Nacalai Tesque	27575-31	10x PBS(–)
Sodium azide	Nacalai Tesque	31233-55
Sodium pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
TCS SP8	Leica Microsystems	N/A
Triton X-100	Nacalai Tesque	35501-15
Urea	Nacalai Tesque	35940-65
Vibrating tissue slicer	Dosaka EM	PRO7N