メゾスコピックから顕微鏡スケールまでのニューロンイメージングのための組織クリアリング法

要約

プロトコールは、組織クリアリング法ScaleSFを用いた脳スライスにおけるニューロンイメージングの詳細な方法を提供する。このプロトコルには、脳組織調製、組織清澄化、クリアスライスの取り扱い、およびメゾスコピックレベルから顕微鏡レベルまでのニューロン構造の共焦点レーザー走査顕微鏡イメージングが含まれます。

要約

ここでは、脳組織のメゾスコピックレベルからミクロレベルまでのニューロン構造を視覚化するための詳細なプロトコルが提供されています。神経回路から細胞内ニューロン構造に至るまでのニューロン構造は、ScaleSFで光学的にクリアされたマウス脳スライスにおいて視覚化される。この透明化方法は、ScaleSの修正版であり、強力な透明化能力ならびに蛍光シグナルの高レベルの保存および構造的完全性を達成する組織スライスのための親水性組織透明化方法である。カスタマイズ可能な3次元(3D)プリントイメージングチャンバは、クリアされた脳組織を確実に取り付けるように設計されています。増強された緑色蛍光タンパク質遺伝子を有するアデノ随伴ウイルスベクターを注入したマウス脳を4%パラホルムアルデヒドで固定し、振動組織スライサーで1mm厚のスライスに切断した。脳スライスは、3つの溶液、すなわちScaleS0溶液、リン酸緩衝液生理食塩水(-)、およびScaleS4溶液中で合計10.5〜14.5時間逐次インキュベーションを含むクリアリングプロトコルに従ってクリアされた。クリアした脳スライスをイメージングチャンバーにマウントし、ScaleS4D25(0)溶液に溶解した1.5%アガロースゲルに埋め込んだ。スライスの3D画像取得を、長い作動距離の多液浸対物レンズを搭載した共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて行った。メゾスコピックニューロンイメージングから始まり、樹状突起スパインや軸索ブートンなどの微細な細胞内ニューロン構造を光学的にクリアした脳スライスに可視化することに成功しました。このプロトコルは、回路から細胞内成分スケールまでのニューロン構造の理解を容易にするであろう。

概要

組織透明化法は、光学顕微鏡による生物学的および臨床的サンプルの深さに依存しないイメージングを改善し、無傷の組織上の構造情報の抽出を可能にした^1,2。光学的クリアリング技術は、潜在的にスピードアップし、組織学的分析のコストを削減する可能性があります。現在、3つの主要なクリアリングアプローチが利用可能である:親水性、疎水性、およびヒドロゲルベースの方法^1,2。親水性アプローチは、蛍光シグナルおよび組織の完全性を維持する上で凌駕し、他の2つのアプローチと比較して毒性が低い^3、4。

親水性透明化法であるScaleSは、構造的および分子的完全性の保持と強力な透明化能力(透明化保存スペクトル)により、独特の地位を占めています⁵。以前の研究では、Sca l eS⁶の透明化手順を変更することによって、組織スライス(〜1mm厚)に対する迅速で等尺性透明化プロトコルScaleSFを開発しました。このクリアリングプロトコルは、10.5〜14.5時間の間、3つの溶液中で脳スライスのシーケンシャルインキュベーションを必要とする。電子顕微鏡(EM)分析(補足図1)にも対応可能な高透明保存スペクトルを特長とし、正確な信号再構成によるマルチスケールの高分解能3次元(3D)イメージングが可能⁶.したがって、ScaleSFは、特に神経細胞が途方もない長さの熱狂的なプロセスを精巧にし、情報を送受信するための特殊な微細な細胞下構造を配置する脳において有効であるはずである。神経細胞の回路レベルから細胞内レベルまでのスケールで構造情報を抽出することは、脳機能の理解を深めるために非常に有用です。

ここでは、ScaleSFを用いて、中視/回路から微視/細胞内レベルまでのスケールでニューロン構造を視覚化するための詳細なプロトコルを提供します。プロトコールには、組織調製、組織清澄化、透明化組織の取り扱い、および清澄組織における共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)イメージングが含まれる。私たちのプロトコルは、回路から細胞内成分スケールまでのニューロン構造を調べることに焦点を当てています。マウス脳へのアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの溶液の調製および定位注射のための詳細な手順については、それぞれMiyawaki et al. 2016⁷ およびOkamoto et al. 2021⁸を参照されたい。

プロトコル

すべての実験は順天堂大学施設動物管理利用委員会(承認第2021245号2021246)により承認され、日本学術会議「動物実験の適正な実施のための基本指針」(2006年)に従って実施された。ここでは、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子を搭載したAAVベクターを注射した雄C57BL/6Jマウスと、パルブアルブミン(PV)/ミリストイル化-EGFP-低密度リポタンパク質受容体C末端細菌人工染色体(BAC)トランスジェニックマウス(PV-FGLマウス)⁹ を用いた。PV-FGLマウスは、C57BL/6Jバックグラウンドで維持した。この研究に関して性別に基づく差は見つからなかった。

1. 組織調製

1. 灌流固定
   メモ: ヒュームフードで手順 1.1.1 ~ 1.1.3 を実行して、パラホルムアルデヒド(PFA)への曝露を制限します。
   1. 成体雄マウス(8〜16週齢)をペントバルビタールナトリウム(200mg / kg)の過剰摂取の腹腔内注射によって麻酔する。つま先ピンチ離脱およびまばたき反射の欠如によって麻酔の妥当性を確認する。
   2. 胸腔を開き、外科用はさみで右心房付属器を切断する。20 mL シリンジに取り付けられた 23 G 針を使用して、マウスに 20 mL の氷冷リン酸緩衝液生理食塩水 (PBS) を灌流し、続いて、別の 20 mL シリンジを使用して 0.1 M リン酸緩衝液 (PB) 中の 20 mL の氷冷 4% PFA を灌流します。
      注意:PFAは毒性があり、催奇形性です。吸入や皮膚、目、粘膜との接触を避けてください。
   3. ピンセットで頭蓋骨から脳組織を取り除きます。脳組織を0.1 M PB中の4% PFAを含む15 mLチューブに移し、サンプルを光から保護し、50~100 rpmのシェーカー上で4°Cで一晩静かに揺らします。
   4. 注:採取した脳組織は、4°CのPBS中の0.02%アジ化ナトリウム(NaN₃)に数週間保存することができます。
      警告: NaN₃ は有毒です。吸入や皮膚、目、粘膜との接触を避けてください。ヒュームフードの中でそれを扱います。
2. 脳スライス調製
   1. 50 mLのPBSに2 gの寒天を加えてPBS中の4%寒天を調製する。寒天が完全に溶解するまで混合物をマイクロ波で送る。溶液を40〜45°Cに冷却する。
      注:寒天の主要成分であるアガロペクチンによって提供される粘性特性は、組織スライスの切断の容易さを改善する。
   2. 10 mLの寒天溶液を6穴培養プレートに加える。鉗子を用いて脳組織を寒天溶液に沈める。寒天を氷上で固めましょう。
   3. 埋め込まれた脳組織を井戸から取り除き、カミソリの刃で寒天をトリミングします。寒天ブロックをスーパーグルーでビブラトーム浴の底に固定し、バッファートレイに0.1 M PBを注ぎます。
   4. エタノールに浸した糸くずの出ないティッシュペーパーを使用して別のカミソリの刃を清掃し、振動するティッシュスライサーのブレードホルダーにブレードを取り付けます。
   5. 切片速度を振幅1.4mmで0.14mm/s、周波数を75~77Hzに設定し、脳組織を厚さ1mmのスライスに切断し、PBSを含む6ウェル細胞培養プレートにスライスを採取します。
      注:脳スライスは、4°CでPBS中の0.02%NaN₃ で数週間保存することができます。

2. 組織清澄化

注:使用したScaleSソリューションの組成を 表1に記載する。サンプルはホイルで覆うことで光から保護する必要があります。クリアー・ステップを 図 1A に示します。

1. 6ウェル細胞培養プレートの1つのウェルに8mLのSca l eS0溶液を加え、プレートの別のウェルに8mLのScaleS4溶液を加え、インキュベーター内で37°Cに予備加温した。
2. 脳スライスをヘラで予め加温したScaleS0溶液に移し、90rpmの振とうインキュベーター内で37°Cで2時間インキュベートする。
3. 透過処理した脳スライスを8 mLのPBS(–)でヘラ付きの6ウェル細胞培養プレートに移し、オービタルシェーカーで40~60 rpmに保ちながら15分間洗浄します。これを 2 回繰り返します。
4. 脳スライスを、予め加温した8mLのScaleS4溶液にヘラで移し、振とうインキュベーター内で90rpmで37°Cで8〜12時間インキュベートすることによってそれらをクリアする。 クリアされた脳のスライスを 図1に示します。

3. ブレインスライスマウント

メモ:カスタマイズ可能なイメージングチャンバは、クリアされた脳スライスを確実に取り付けるために使用されます(図2)⁶。チャンバは、チャンバフレームとボトムカバースリップで構成されています。顕微鏡ステージアダプターは、イメージングチャンバーを顕微鏡ステージに直接取り付けるように設計されています(図2A、B)。チャンバーフレームと顕微鏡ステージアダプターは、社内または外部委託の3D印刷サービスを使用して3D印刷できます。撮像チャンバの3Dコンピュータ支援設計(CAD)データは、Furuta et al. 2022⁶に提供されている。

1. チャンバーの準備のために、粘着剤を使用してチャンバーフレームをカバースリップに取り付けます。
2. 1.5%アガロースをScal eS4D25(0)溶液(ScaleS4ゲル)に調製するには、ボトル内の溶液100mLに1.5gのアガロースを加えます。アガロースが完全に溶解するまで溶液を攪拌し、電子レンジで送ることによって溶液をよく混合する。完了したら、溶液を37°Cまで冷却します。
3. クリアした脳スライスをヘラでイメージングチャンバの底部カバースリップに取り付けます。透明なスライスから余分な溶液を、糸くずの出ないきれいなティッシュペーパーで拭き取ります。
4. マイクロピペットを用いて脳スライス上にScaleS4ゲルを加え、画像化チャンバを充填する。鉗子で別のカバースリップを上に置き、糸くずの出ないティッシュペーパーとスライドガラスをこの順序でカバースリップの上に置きます。
5. 撮像チャンバーを4°Cの冷蔵庫に移す。 スライドガラスに金属製の重りを置き、30分間放置します。
6. 金属製のウェイト、スライドガラス、糸くずの出ないティッシュペーパー、カバースリップをイメージングチャンバーから取り出し、余分なゲルを拭き取ります(図2A、B)。
7. イメージングチャンバを60mmガラスのシャーレに入れ、パテ状の感圧接着剤でイメージングチャンバの縁をディッシュに取り付けます。チャンバーをペトリ皿に複数のポイントで取り付けます。
8. ScaleS4溶液を皿に注ぎ、40〜60rpmのオービタルシェーカー上で20〜25°Cで1時間穏やかに振る。新鮮な溶液で代用し、200 μLのピペットチップを使用して表面を静かにこすり取ることによってゲル表面の気泡を除去します。浸漬されたイメージングチャンバを顕微鏡ステージ上に取り付ける(図2C)。

4. CLSMイメージング

1. 長作動距離(WD)の多液浸対物レンズを搭載したCLSMを用いて画像を取得します(16x/0.60開口数[NA]、WD=2.5mm)。
   注: 高 NA 対物レンズは、回折制限の高い解像度を提供できます。
2. 関連するすべてのイメージング機器(ワークステーション、顕微鏡、スキャナー、レーザー、水銀灯)の電源を入れ、CLSMイメージングソフトウェアを起動します。
3. マルチ液浸対物レンズの補正カラーを1.47に設定します。ScaleS4溶液は、約1.47 ^5,7の屈折率(RI)を有する。RIミスマッチによる収差は、画像形成を妨げる可能性があります(図3)。
4. 対物レンズを溶液に浸し、ゆっくりとスライスに近づけます。対物レンズの先端に付着した気泡を取り除きます。エピ蛍光を使用して、クリアされた組織内の関心領域(ROI)を見つけます。
5. 適切な設定をテストして、画像取得パラメータを設定します。
   1. 画像集録のビット深度を決定します。画像のデータサイズは、ビット深度とともに増加します。
   2. 検出波長を設定します。発光スペクトルに応じて検出器の適切なゲートを調整します。検出波長がレーザーラインをカバーしていないことを確認します。
   3. xy 解像度を設定します。形式が大きいほど xy 解像度は高くなりますが、画像の収集に時間がかかります。
   4. スキャン速度を設定します。スキャン速度が遅いほど、信号対雑音比が高くなります。しかし、それはまた、ピクセル滞留時間とフォトブリーチングのリスクを増加させます。それに応じて選択してください。
   5. ピンホールのサイズを調整します。ピンホールサイズは、光学断面の厚さを制御します。ピンホールサイズが小さいほど光学セクションが薄くなり、 z 分解能が向上しますが、蛍光シグナルは減少します。ピンホールサイズを大きくすると、より強い蛍光シグナルを持つより厚い光学セクションが得られます。
   6. レーザー出力、検出器/アンプゲイン、オフセットを設定します。適切な画像が得られるまで、レーザー出力と検出器/アンプのゲインを徐々に上げます。高いレーザー出力は、フォトブリーチングのリスクを伴います。オフセット(コントラスト)を適切に調整して、高い信号対雑音比を得ます。
   7. ROI のサイズに基づいて必要な耕作領域を決定します。ROIの全長と幅がキャプチャされていることを確認します。
   8. クリアした組織をすべての平面でナビゲートし、スタックの始点と終点を設定します。Z ステップ サイズを目的の Z 解像度に応じて設定します。
6. 画像取得設定に満足したら画像を収集し、キャプチャした画像を記録します。画像解析ソフトウェアを使用して画像を処理します。

結果

1−mm厚さのマウス脳スライスの光学的透明化は、このプロトコールを用いて達成された。 図1B は、クリアリング処理前後のマウス脳スライスの透過像を表す。組織透明化法は、厚さ1mmのマウス脳スライスを透明にした。脳スライスの最終サイズのわずかな拡大は、透明化溶液中で12時間インキュベーションした後に見出された(線膨張:102.5%±1.3%)。組織の蛍光および構造的完全性?...

ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ
プロトコルには、意味のある結果を得るために細心の注意を払って実行する必要があるいくつかの重要なステップがあります。サンプルの均一な固定は、大規模組織内の3Dイメージングに不可欠です。対物レンズ、サンプル、および液浸液は、RI と一致する必要があります。それらの間のRIミスマッチは、クリアされた脳スライス内のEGFP発現細?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x multi-immersion objective lens	Leica Microsystems	HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
Agar	Nacalai Tesque	01028-85
Agarose	TaKaRa Bio	L03
Dimethyl sulfoxide	Nacalai Tesque	13407-45
D-Sorbitol	Nacalai Tesque	06286-55
γ-cyclodextrin	Wako Pure Chemical Industries	037-10643
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Huygens Essential	Scientific Volume Imaging	ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
Imaris	Bitplane	ver. 9.0.0
Leica Application Suite X	Leica Microsystems	LAS X, ver. 3.5.5.19976
Methyl-β-cyclodextrin	Tokyo Chemical Industry	M1356
Paraformaldehyde	Merck Millipore	1.04005.1000
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)	Nacalai Tesque	27575-31	10x PBS(–)
Sodium azide	Nacalai Tesque	31233-55
Sodium pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
TCS SP8	Leica Microsystems	N/A
Triton X-100	Nacalai Tesque	35501-15
Urea	Nacalai Tesque	35940-65
Vibrating tissue slicer	Dosaka EM	PRO7N