メゾスコピックから顕微鏡スケールまでのニューロンイメージングのための組織クリアリング法

要約

プロトコールは、組織クリアリング法ScaleSFを用いた脳スライスにおけるニューロンイメージングの詳細な方法を提供する。このプロトコルには、脳組織調製、組織清澄化、クリアスライスの取り扱い、およびメゾスコピックレベルから顕微鏡レベルまでのニューロン構造の共焦点レーザー走査顕微鏡イメージングが含まれます。

要約

ここでは、脳組織のメゾスコピックレベルからミクロレベルまでのニューロン構造を視覚化するための詳細なプロトコルが提供されています。神経回路から細胞内ニューロン構造に至るまでのニューロン構造は、ScaleSFで光学的にクリアされたマウス脳スライスにおいて視覚化される。この透明化方法は、ScaleSの修正版であり、強力な透明化能力ならびに蛍光シグナルの高レベルの保存および構造的完全性を達成する組織スライスのための親水性組織透明化方法である。カスタマイズ可能な3次元(3D)プリントイメージングチャンバは、クリアされた脳組織を確実に取り付けるように設計されています。増強された緑色蛍光タンパク質遺伝子を有するアデノ随伴ウイルスベクターを注入したマウス脳を4%パラホルムアルデヒドで固定し、振動組織スライサーで1mm厚のスライスに切断した。脳スライスは、3つの溶液、すなわちScaleS0溶液、リン酸緩衝液生理食塩水(-)、およびScaleS4溶液中で合計10.5〜14.5時間逐次インキュベーションを含むクリアリングプロトコルに従ってクリアされた。クリアした脳スライスをイメージングチャンバーにマウントし、ScaleS4D25(0)溶液に溶解した1.5%アガロースゲルに埋め込んだ。スライスの3D画像取得を、長い作動距離の多液浸対物レンズを搭載した共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて行った。メゾスコピックニューロンイメージングから始まり、樹状突起スパインや軸索ブートンなどの微細な細胞内ニューロン構造を光学的にクリアした脳スライスに可視化することに成功しました。このプロトコルは、回路から細胞内成分スケールまでのニューロン構造の理解を容易にするであろう。

概要

組織透明化法は、光学顕微鏡による生物学的および臨床的サンプルの深さに依存しないイメージングを改善し、無傷の組織上の構造情報の抽出を可能にした^1,2。光学的クリアリング技術は、潜在的にスピードアップし、組織学的分析のコストを削減する可能性があります。現在、3つの主要なクリアリングアプローチが利用可能である:親水性、疎水性、およびヒドロゲルベースの方法^1,2。親水性アプローチは、蛍光シグナルおよび組織の完全性を維持する上で凌駕し、他の2つのアプローチと比較して毒性が低い^3、4。

親水性透明化法であるScaleSは、構造的および分子的完全性の保持と強力な透明化能力(透明化保存スペクトル)により、独特の地位を占めています⁵。以前の研究では、Sca l eS⁶の透明化手順を変更することによって、組織スライス(〜1mm厚)に対する迅速で等尺性透明化プロトコルScaleSFを開発しました。このク....

プロトコル

すべての実験は順天堂大学施設動物管理利用委員会(承認第2021245号2021246)により承認され、日本学術会議「動物実験の適正な実施のための基本指針」(2006年)に従って実施された。ここでは、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子を搭載したAAVベクターを注射した雄C57BL/6Jマウスと、パルブアルブミン(PV)/ミリストイル化-EGFP-低密度リポタンパク質受容体C末端細菌人工染色体(BAC)トランスジェニックマウス(PV-FGLマウス)⁹ を用いた。PV-FGLマウスは、C57BL/6Jバックグラウンドで維持した。この研究に関して性別に基づく差は見つからなかった。

1. 組織調製

1. 灌流固定
   メモ: ヒュームフードで手順 1.1.1 ~ 1.1.3 を実行して、パラホルムアルデヒド(PFA)への曝露を制限します。
   1. 成体雄マウス(8〜16週齢)をペントバルビタールナトリウム(200mg / kg)の過剰摂取の腹腔内注射によって麻酔する。つま先ピンチ離脱およびまばたき反射の欠如によって麻酔の妥当性を確認する。
   2. 胸腔を開き、外科用はさみで右心房付属器を切断する。20 mL シリンジに取り付けられた 23 G 針を使用して、マウスに 20 mL の氷冷リン酸緩衝液生理食塩水 (PBS) を灌流し、続いて、別の 20 mL シリン....

結果

1−mm厚さのマウス脳スライスの光学的透明化は、このプロトコールを用いて達成された。 図1B は、クリアリング処理前後のマウス脳スライスの透過像を表す。組織透明化法は、厚さ1mmのマウス脳スライスを透明にした。脳スライスの最終サイズのわずかな拡大は、透明化溶液中で12時間インキュベーションした後に見出された(線膨張:102.5%±1.3%)。組織の蛍光および構造的完全性?.......

ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ
プロトコルには、意味のある結果を得るために細心の注意を払って実行する必要があるいくつかの重要なステップがあります。サンプルの均一な固定は、大規模組織内の3Dイメージングに不可欠です。対物レンズ、サンプル、および液浸液は、RI と一致する必要があります。それらの間のRIミスマッチは、クリアされた脳スライス内のEGFP発現細?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x multi-immersion objective lens	Leica Microsystems	HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
Agar	Nacalai Tesque	01028-85
Agarose	TaKaRa Bio	L03
Dimethyl sulfoxide	Nacalai Tesque	13407-45
D-Sorbitol	Nacalai Tesque	06286-55
γ-cyclodextrin	Wako Pure Chemical Industries	037-10643
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Huygens Essential	Scientific Volume Imaging	ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
Imaris	Bitplane	ver. 9.0.0
Leica Application Suite X	Leica Microsystems	LAS X, ver. 3.5.5.19976
Methyl-β-cyclodextrin	Tokyo Chemical Industry	M1356
Paraformaldehyde	Merck Millipore	1.04005.1000
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)	Nacalai Tesque	27575-31	10x PBS(–)
Sodium azide	Nacalai Tesque	31233-55
Sodium pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
TCS SP8	Leica Microsystems	N/A
Triton X-100	Nacalai Tesque	35501-15
Urea	Nacalai Tesque	35940-65
Vibrating tissue slicer	Dosaka EM	PRO7N