Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

Zusammenfassung

Das Protokoll bietet eine detaillierte Methode der neuronalen Bildgebung in Gehirnschnitten unter Verwendung einer Gewebereinigungsmethode, ScaleSF. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung des Hirngewebes, die Gewebeklärung, die Handhabung von abgeräumten Schnitten und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Bildgebung neuronaler Strukturen von mesoskopischer bis mikroskopischer Ebene.

Zusammenfassung

Hier wird ein detailliertes Protokoll bereitgestellt, um neuronale Strukturen von mesoskopischen bis hin zu mikroskopischen Ebenen im Hirngewebe sichtbar zu machen. Neuronale Strukturen, die von neuronalen Schaltkreisen bis hin zu subzellulären neuronalen Strukturen reichen, werden in Maus-Gehirnschnitten visualisiert, die mit ScaleSF optisch gelöscht wurden. Diese Clearing-Methode ist eine modifizierte Version von ScaleS und ist eine hydrophile Gewebereinigungsmethode für Gewebeschnitte, die eine starke Clearing-Fähigkeit sowie ein hohes Maß an Erhaltung von Fluoreszenzsignalen und struktureller Integrität erreicht. Eine anpassbare dreidimensionale (3D)-gedruckte Bildgebungskammer wurde für die zuverlässige Montage von gereinigtem Hirngewebe entwickelt. Mäusegehirne, denen ein Adeno-assoziierter Virusvektor injiziert wurde, der ein verbessertes grün fluoreszierendes Proteingen trägt, wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit einem vibrierenden Gewebeschneider in Scheiben von 1 mm Dicke geschnitten. Die Gehirnschnitte wurden unter Befolgung des Clearing-Protokolls gereinigt, das sequentielle Inkubationen in drei Lösungen, nämlich Sca l eS0-Lösung, Phosphatpufferkochsalzlösung (–) und ScaleS4-Lösung, für insgesamt 10,5-14,5 h umfasst. Die gereinigten Hirnschnitte wurden auf die Bildgebungskammer montiert und in 1,5%iges Agarosegel eingebettet, gelöst in ScaleS4D25(0)-Lösung. Die 3D-Bildaufnahme der Scheiben erfolgte mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem Multi-Immersionsobjektiv mit großem Arbeitsabstand ausgestattet war. Beginnend mit der mesoskopischen neuronalen Bildgebung ist es uns gelungen, feine subzelluläre neuronale Strukturen, wie dendritische Stacheln und axonale Boutons, in den optisch gereinigten Hirnschnitten sichtbar zu machen. Dieses Protokoll würde das Verständnis neuronaler Strukturen von Schaltkreis- bis hin zu subzellulären Komponentenskalen erleichtern.

Einleitung

Gewebereinigungsmethoden haben die tiefenunabhängige Bildgebung biologischer und klinischer Proben mit Lichtmikroskopie verbessert, so dass strukturelle Informationen über intaktes Gewebe extrahiert werden^{können 1,2}. Optische Clearing-Techniken könnten möglicherweise auch die Kosten für die histologische Analyse beschleunigen und senken. Derzeit stehen drei Hauptclearing-Ansätze zur Verfügung: hydrophile, hydrophobe und hydrogelbasierte Methoden ^1,2. Hydrophile Ansätze übertreffen die Fluoreszenzsignale und die Gewebeintegrität und sind im Vergleich zu den beiden anderen Ansätzen weniger toxisch ^3,4.

Eine hydrophile Clearingmethode, ScaleS, nimmt mit ihrer Erhaltung der strukturellen und molekularen Integrität sowie der starken Clearingfähigkeit (Clearing-Konservierungsspektrum) eine herausragende Position ^ein5. In einer früheren Studie haben wir ein schnelles und isometrisches Clearing-Protokoll, Sca l eSF, für Gewebeschnitte (~ 1 mm Dicke) entwickelt, indem wir das Clearingverfahrenvon ScaleS^{6 modifiziert haben}. Dieses Clearing-Protokoll erfordert sequentielle Inkubationen von Gehirnschnitten in drei Lösungen für 10,5-14,5 h. Die Methode zeichnet sich durch ein hohes Clearing-Konservierungsspektrum aus, das sogar mit der elektronenmikroskopischen (EM) Analyse kompatibel ist (Ergänzende Abbildung 1), was eine hochauflösende dreidimensionale (3D) Multiskalen-Bildgebung mit genauer Signalrekonstruktion^{ermöglicht 6}. Daher sollte ScaleSF vor allem im Gehirn wirksam sein, wo neuronale Zellen überschwängliche Prozesse von enormer Länge ausarbeiten und spezialisierte feine subzelluläre Strukturen zum Senden und Empfangen von Informationen anordnen. Die Extraktion struktureller Informationen mit Skalen von Schaltkreis- bis subzellulären Ebenen auf neuronalen Zellen ist sehr nützlich, um die Gehirnfunktionen besser zu verstehen.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung neuronaler Strukturen mit Skalen von der mesoskopischen / Schaltung bis zur mikroskopischen / subzellulären Ebene mit ScaleSF zur Verfügung. Das Protokoll umfasst die Gewebepräparation, die Gewebeklärung, die Handhabung von gereinigtem Gewebe und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) der Bildgebung von gereinigtem Gewebe. Unser Protokoll konzentriert sich auf die Abfrage neuronaler Strukturen von Schaltkreis- bis hin zu subzellulären Komponentenskalen. Ein detailliertes Verfahren zur Herstellung der Lösungen und zur stereotaktischen Injektion von Adeno-assoziierten Virusvektoren (AAV) in das Gehirn von Mäusen finden Sie in Miyawaki et al. 2016 7 bzw. Okamoto et al.^{2021 8}.

Protokoll

Alle Experimente wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees der Juntendo University genehmigt (Approval No. 2021245, 2021246) und in Übereinstimmung mit den Fundamental Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments des Science Council of Japan (2006) durchgeführt. Hier wurden männliche C57BL/6J-Mäuse, denen AAV-Vektor injiziert wurde, das das Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) -Gen und Parvalbumin (PV) / Myristoylation-EGFP-Low-Density-Lipoproteinrezeptor C-terminale bakterielle künstliche Chromosom (BAC) transgene Mäuse (PV-FGL-Mäuse⁾⁹ injiziert wurden, verwendet. PV-FGL-Mäuse wurden im C57BL/6J-Hintergrund gewartet. In Bezug auf diese Studie wurden keine geschlechtsspezifischen Unterschiede gefunden.

1. Gewebepräparation

1. Perfusionsfixierung
   HINWEIS: Führen Sie die Schritte 1.1.1 bis 1.1.3 in einem Abzug aus, um die Exposition gegenüber Paraformaldehyd (PFA) zu begrenzen.
   1. Anästhesien erwachsener männlicher Mäuse (8–16 Wochen alt) durch eine intraperitoneale Injektion einer Überdosierung von Natriumpentobarbital (200 mg/kg). Bestätigen Sie die Angemessenheit der Anästhesie durch das Fehlen von Zehenkneifentzug und Augenblinzelreflexen.
   2. Öffnen Sie die Brusthöhle und schneiden Sie das rechte Vorhofanhängsel mit einer chirurgischen Schere. Perfusionieren Sie die Mäuse mit 20 ml eiskalter Phosphatpufferkochsalzlösung (PBS) mit einer 23-G-Nadel, die an einer 20-ml-Spritze befestigt ist, gefolgt von einer Perfusion von 20 ml eiskaltem 4% PFA in 0,1 m Phosphatpuffer (PB) mit einer weiteren 20-ml-Spritze.
      ACHTUNG: PFA ist toxisch und teratogen. Vermeiden Sie das Einatmen oder den Kontakt mit Haut, Augen und Schleimhaut.
   3. Entfernen Sie Hirngewebe aus dem Schädel mit einer Pinzette. Übertragen Sie das Hirngewebe in ein 15-ml-Röhrchen, das 4% PFA in 0,1 Mio. PB enthält, schützen Sie die Proben vor Licht und schaukeln Sie sanft über Nacht bei 4 ° C auf einem Shaker bei 50-100 U / min.
   4. HINWEIS: Das entnommene Hirngewebe kann mehrere Wochen in 0,02% Natriumazid (_NaN3) in PBS bei 4 °C gelagert werden.
      ACHTUNG: NaN 3 ist giftig_. Vermeiden Sie das Einatmen oder den Kontakt mit Haut, Augen und Schleimhaut. Behandeln Sie es in einem Abzug.
2. Brain Slice Vorbereitung
   1. Bereiten Sie 4% Agar in PBS vor, indem Sie 2 g Agar zu 50 ml PBS hinzufügen. Mikrowelle der Mischung, bis sich das Agar vollständig aufgelöst hat. Lassen Sie die Lösung auf 40-45 °C abkühlen.
      HINWEIS: Die viskose Eigenschaft, die Agaropectin, ein Hauptbestandteil von Agar, bietet, verbessert das Schneiden von Gewebeschnitten.
   2. Fügen Sie 10 ml der Agarlösung zu einer 6-Well-Kulturplatte hinzu. Tauchen Sie das Hirngewebe mit einer Pinzette in die Agarlösung. Lassen Sie das Agar auf Eis erstarren.
   3. Entfernen Sie das eingebettete Hirngewebe aus dem Brunnen und schneiden Sie das Agar mit einer Rasierklinge ab. Befestigen Sie den Agarblock mit Sekundenkleber auf dem Boden des Vibratombades und gießen Sie 0,1 M PB in die Pufferschale.
   4. Reinigen Sie eine weitere Rasierklinge mit einem fusselfreien Seidenpapier, das in Ethanol getränkt ist, und befestigen Sie die Klinge am Klingenhalter des vibrierenden Tissue-Slicers.
   5. Stellen Sie die Schnittgeschwindigkeit auf 0,14 mm/s mit 1,4 mm Amplitude und die Frequenz auf 75–77 Hz ein. Schneiden Sie das Hirngewebe in 1 mm dicke Scheiben und sammeln Sie die Scheiben in einer 6-Well-Zellkulturplatte, die PBS enthält.
      HINWEIS: Die Hirnschnitte können mehrere Wochen in 0,02_{% NaN3} in PBS bei 4 °C gelagert werden.

2. Gewebeklärung

HINWEIS: Die Zusammensetzungen der verwendeten ScaleS-Lösungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Proben sollten vor Licht geschützt werden, indem sie mit einer Folie abgedeckt werden. Die Löschschritte sind in Abbildung 1A dargestellt.

1. 8 ml Sca l eS0-Lösung in eine Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturplatte geben und 8 ml ScaleS4-Lösungin eine andere Vertiefung der Platte geben und in einem Inkubator auf 37 °C vorwärmen.
2. Die Hirnschnitte mit einem Spatel in die vorgewärmte ScaleS0-Lösung überführen und 2 h bei 37 °C in einem Schüttelinkubator bei 90 U/min inkubieren.
3. Übertragen Sie die permeabilisierten Gehirnschnitte in 8 ml PBS (–) in einer 6-Well-Zellkulturplatte mit einem Spatel und waschen Sie sie für 15 Minuten, indem Sie sie in einem Orbitalschüttler bei 40-60 U / min halten. Wiederholen Sie dies zweimal.
4. Übertragen Sie die Gehirnscheiben in die vorgewärmten 8 ml ScaleS4-Lösung mit einem Spatel und reinigen Sie sie, indem Sie sie in einem Schüttelinkubator bei 90 U / min für 8–12 h bei 37 ° C inkubieren. Ein gereinigter Gehirnschnitt ist in Abbildung 1 zu sehen.

3. Halterung der Gehirnscheibe

HINWEIS: Eine anpassbare Bildgebungskammer wird für die zuverlässige Montage von abgeräumten Gehirnschnitten verwendet (Abbildung 2)⁶. Die Kammer besteht aus dem Kammerrahmen und dem Bodendeckglas. Die Mikroskop-Tischadapter sind auch so konzipiert, dass die Bildgebungskammer direkt auf Mikroskoptischen montiert werden kann (Abbildung 2A,B). Die Adapter für den Kammerrahmen und den Mikroskoptisch können mit internen oder ausgelagerten 3D-Druckdiensten in 3D gedruckt werden. 3D-CAD-Daten (Computer-Aided Design) der Bildgebungskammer werden in Furuta et al. 2022⁶ bereitgestellt.

1. Zur Kammervorbereitung befestigen Sie den Kammerrahmen mit einem Haftkleber an einem Deckglas.
2. Bereiten Sie 1,5% Agarose in Sca l eS4D25(0) Lösung (ScaleS4 Gel) vor, indem Sie 1,5 g Agarose zu 100 ml der Lösung in einer Flasche hinzufügen. Mischen Sie die Lösung gut durch Rühren und Mikrowelle der Lösung, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist. Lassen Sie die Lösung nach dem Fertig auf 37 ° C abkühlen.
3. Montieren Sie die gereinigte Gehirnscheibe mit einem Spatel auf das untere Deckglas der Bildgebungskammer. Wischen Sie die überschüssige Lösung mit einem sauberen, fusselfreien Seidenpapier von der gereinigten Scheibe ab.
4. Fügen Sie das ScaleS4-Gel mit einer Mikropipette auf die Gehirnscheibe auf, um die Bildgebungskammer zu füllen. Legen Sie ein weiteres Deckglas mit einer Pinzette darauf und legen Sie ein Stück fusselfreies Seidenpapier und einen Glasträger in dieser Reihenfolge auf das Deckglas.
5. Geben Sie die Bildgebungskammer bei 4 °C in einen Kühlschrank. Legen Sie Metallgewichte auf den Glasschieber und lassen Sie sie 30 min stehen.
6. Entfernen Sie die Metallgewichte, den Glasobjektträger, das fusselfreie Seidenpapier und das Deckglas aus der Bildgebungskammer und wischen Sie das überschüssige Gel ab (Abbildung 2A, B).
7. Legen Sie die Bildkammer in eine 60 mm große Petrischale aus Glas und befestigen Sie den Rand der Bildkammer mit einem kittartigen Haftkleber an der Schale. Befestigen Sie die Kammer an mehreren Stellen an der Petrischale.
8. Gießen Sie ScaleS4-Lösung in die Schale und schütteln Sie sie vorsichtig für 1 h bei 20-25 °C auf einem Orbitalschüttler bei 40-60 U / min. Ersetzen Sie es durch frische Lösung und entfernen Sie Luftblasen auf der Geloberfläche, indem Sie die Oberfläche vorsichtig mit einer 200 μL Pipettenspitze abkratzen. Montieren Sie die eingetauchte Bildgebungskammer auf einem Mikroskoptisch (Abbildung 2C).

4. CLSM-Bildgebung

1. Erfassen Sie Bilder mit einem CLSM, das mit einem Multi-Immersionsobjektiv mit großem Arbeitsabstand (WD) (16x/0,60 numerische Blende [NA], WD = 2,5 mm) ausgestattet ist.
   HINWEIS: Objektive mit hohem NA-Objektiv können eine hohe beugungsbegrenzte Auflösung bieten.
2. Schalten Sie alle relevanten Bildgebungsgeräte (Workstation, Mikroskop, Scanner, Laser und Quecksilberlampe) ein und starten Sie eine CLSM-Bildgebungssoftware.
3. Stellen Sie den Korrekturkragen des Multi-Immersionsobjektivs auf 1,47 ein. ScaleS4-Lösung hat einen Brechungsindex (RI) von etwa 1,47 ^5,7. RI-Mismatch-induzierte Aberrationen können die Bildbildung stören (Abbildung 3).
4. Tauchen Sie die Objektivlinse in die Lösung ein und lassen Sie sie sich langsam der Scheibe nähern. Entfernen Sie alle Luftblasen, die an der Spitze der Objektivlinse eingeschlossen sind. Finden Sie Regionen von Interesse (ROIs) in den gereinigten Geweben mit Epifluoreszenz.
5. Legen Sie die Bildaufnahmeparameter fest, indem Sie die entsprechenden Einstellungen testen.
   1. Bestimmen Sie die Bittiefe für die Bildaufnahme. Die Datengröße des Bildes nimmt mit der Bittiefe zu.
   2. Stellen Sie die Detektionswellenlänge ein. Stellen Sie das entsprechende Gate für den Detektor entsprechend dem Emissionsspektrum ein. Stellen Sie sicher, dass die Detektionswellenlänge keine Laserlinien abdeckt.
   3. Stellen Sie die XY-Auflösung ein. Größere Formate bieten bessere XY-Auflösungen , aber es dauert länger, die Bilder zu sammeln.
   4. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit ein. Eine langsamere Scangeschwindigkeit sorgt für ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis. Es erhöht jedoch auch die Pixelverweilzeit und das Risiko des Photobleachings. Wählen Sie entsprechend.
   5. Passen Sie die Lochgröße an. Die Lochgröße steuert die optische Schnittdicke. Eine kleinere Pinhole-Größe erzeugt einen dünneren optischen Schnitt und damit eine bessere Z-Auflösung , reduziert aber das Fluoreszenzsignal. Wenn Sie die Lochgröße vergrößern, erhalten Sie einen dickeren optischen Abschnitt mit stärkerem Fluoreszenzsignal.
   6. Stellen Sie die Laserleistung, die Detektor-/Verstärkerverstärkung und den Offset ein. Erhöhen Sie allmählich die Laserleistung und die Detektor-/Verstärkerverstärkung, bis ein geeignetes Bild erhalten wird. Eine hohe Laserleistung birgt die Gefahr des Photobleachings. Stellen Sie den Offset (Kontrast) entsprechend ein, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.
   7. Bestimmen Sie die benötigte Bodenbearbeitungsfläche basierend auf der Größe des ROI. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Länge und Breite des ROI erfasst wird.
   8. Navigieren Sie durch das gereinigte Gewebe in allen Ebenen und legen Sie den Start- und Endpunkt des Stapels fest. Stellen Sie die Z-Schritt-Größe entsprechend der gewünschten z-Auflösung ein.
6. Sammeln Sie Bilder, wenn Sie mit den Bildaufnahmeeinstellungen zufrieden sind, und zeichnen Sie aufgenommene Bilder auf. Verarbeiten Sie die Bilder mit einer Bildanalysesoftware.

Ergebnisse

Die optische Klärung einer Maus-Hirnscheibe von 1 mm Dicke wurde mit diesem Protokoll erreicht. Abbildung 1B zeigt Transmissionsbilder eines Maus-Gehirnschnitts vor und nach der Clearing-Behandlung. Die Gewebereinigungsmethode machte eine 1 mm dicke Gehirnscheibe der Maus transparent. Eine leichte Ausdehnung der Endgrößen der Hirnschnitte wurde nach der Inkubation in der Clearinglösung für 12 h festgestellt (lineare Ausdehnung: 102,5% ± 1,3%). Die Erhaltung der Fluoreszenz und strukturellen Integr...

Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Es gibt ein paar kritische Schritte im Protokoll, die mit äußerster Vorsicht durchgeführt werden sollten, um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen. Eine gleichmäßige Fixierung der Proben ist für die 3D-Bildgebung in großflächigen Geweben unerlässlich. Die Objektivlinse, die Probe und die Tauchflüssigkeit sollten über eine passende RI verfügen. RI-Mismatch zwischen ihnen führt zu einer stark gestörten Bildgebung von EGFP-exprimierenden Zellen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x multi-immersion objective lens	Leica Microsystems	HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
Agar	Nacalai Tesque	01028-85
Agarose	TaKaRa Bio	L03
Dimethyl sulfoxide	Nacalai Tesque	13407-45
D-Sorbitol	Nacalai Tesque	06286-55
γ-cyclodextrin	Wako Pure Chemical Industries	037-10643
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Huygens Essential	Scientific Volume Imaging	ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
Imaris	Bitplane	ver. 9.0.0
Leica Application Suite X	Leica Microsystems	LAS X, ver. 3.5.5.19976
Methyl-β-cyclodextrin	Tokyo Chemical Industry	M1356
Paraformaldehyde	Merck Millipore	1.04005.1000
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)	Nacalai Tesque	27575-31	10x PBS(–)
Sodium azide	Nacalai Tesque	31233-55
Sodium pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
TCS SP8	Leica Microsystems	N/A
Triton X-100	Nacalai Tesque	35501-15
Urea	Nacalai Tesque	35940-65
Vibrating tissue slicer	Dosaka EM	PRO7N