Метод очистки тканей для визуализации нейронов от мезоскопических до микроскопических масштабов

Резюме

Протокол предоставляет подробный метод визуализации нейронов в срезе мозга с использованием метода очистки тканей ScaleSF. Протокол включает в себя подготовку тканей головного мозга, осветление тканей, обработку очищенных срезов и конфокальную лазерную сканирующую микроскопическую визуализацию нейронных структур от мезоскопического до микроскопического уровней.

Аннотация

Здесь представлен подробный протокол для визуализации нейронных структур от мезоскопического до микроскопического уровней в тканях мозга. Нейронные структуры, начиная от нейронных цепей и заканчивая субклеточными нейронными структурами, визуализируются в срезах мозга мыши, оптически очищенных с помощью ScaleSF. Этот метод очистки является модифицированной версией ScaleS и представляет собой гидрофильный метод очистки тканей для срезов тканей, который обеспечивает мощную очищающую способность, а также высокий уровень сохранения флуоресцентных сигналов и структурной целостности. Настраиваемая трехмерная (3D)-печатная камера визуализации предназначена для надежного монтажа очищенных тканей мозга. Мозг мыши, которому вводили аденоассоциированный вирусный вектор, несущий усиленный ген зеленого флуоресцентного белка, фиксировали 4% параформальдегидом и разрезали на срезы толщиной 1 мм с помощью вибрирующего слайсера тканей. Срезы мозга очищали в соответствии с протоколом очистки, который включал последовательные инкубации в трех растворах, а именно: раствор scaleS0, фосфатный буферный физиологический раствор (-) и раствор ScaleS4, в общей сложности 10,5-14,5 ч. Очищенные срезы мозга были установлены на камере визуализации и встроены в 1,5% агарозный гель, растворенный в растворе ScaleS4D25(0). Получение 3D-изображения срезов осуществлялось с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, оснащенного мульти-погружным объективом большого рабочего расстояния. Начиная с мезоскопической нейрональной визуализации, нам удалось визуализировать тонкие субклеточные нейронные структуры, такие как дендритные шипы и аксональные бутоны, в оптически очищенных срезах мозга. Этот протокол облегчит понимание нейронных структур от схемы до субклеточных компонентных масштабов.

Введение

Методы очистки тканей улучшили глубинно-независимую визуализацию биологических и клинических образцов с помощью световой микроскопии, что позволяет извлекать структурную информацию на интактных тканях ^1,2. Методы оптической очистки также могут потенциально ускорить и снизить стоимость гистологического анализа. В настоящее время существуют три основных подхода к очистке: гидрофильный, гидрофобный и гидрогелевой методы ^1,2. Гидрофильные подходы превосходят в сохранении флуоресцентных сигналов и целостности тканей и менее токсичны по сравнению с двумя другими подходами ^3,4.

Гидрофильный метод очистки, ScaleS, занимает отличительное положение с сохранением структурной и молекулярной целостности, а также мощной очищающей способностью (спектр очистки-сохранения)⁵. В предыдущем исследовании мы разработали протокол быстрой и изометрической очистки, ScaleSF, для срезов тканей (толщина ~ 1 мм), изменив процедуру очистки ScaleS⁶. Этот протокол очистки требует последовательных инкубаций срезов мозга в трех растворах в течение 10,5-14,5 ч. Метод отличается высоким спектром очистки-сохранения, который совместим даже с электронным микроскопическим (ЭМ) анализом (дополнительный рисунок 1), что позволяет создавать многомасштабную трехмерную (3D) визуализацию высокого разрешения с точной реконструкцией сигнала⁶. Таким образом, ScaleSF должен быть эффективен, особенно в головном мозге, где нейронные клетки развивают буйные процессы огромной длины и организуют специализированные тонкие субклеточные структуры для передачи и приема информации. Извлечение структурной информации с помощью шкал от контурного до субклеточного уровней на нейронных клетках весьма полезно для лучшего понимания функций мозга.

Здесь мы предоставляем подробный протокол для визуализации нейронных структур с масштабами от мезоскопического / схемы до микроскопического / субклеточного уровня с использованием ScaleSF. Протокол включает в себя подготовку тканей, осветление тканей, обработку очищенных тканей и конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (CLSM) визуализацию очищенных тканей. Наш протокол фокусируется на опросе нейронных структур от схемы до субклеточных компонентных масштабов. Подробную процедуру приготовления растворов и стереотаксической инъекции векторов аденоассоциированного вируса (AAV) в мозг мыши см. в Miyawaki et al. 2016⁷ и Okamoto et al. 2021⁸, соответственно.

протокол

Все эксперименты были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию Университета Дзюнтендо (одобрение No 2021245, 2021246) и выполнены в соответствии с Фундаментальными руководящими принципами надлежащего проведения экспериментов на животных Научным советом Японии (2006). Здесь использовали самцов мышей C57BL/6J, которым вводили вектор AAV, несущий ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) и трансгенных мышей парвалбумина (PV)/миристоилирования-EGFP-рецептора липопротеинов низкой плотности C-концевой бактериальной искусственной хромосомы (BAC) трансгенных мышей (мыши PV-FGL)⁹ . Мыши PV-FGL поддерживались на фоне C57BL/6J. В отношении этого исследования не было обнаружено различий по признаку пола.

1. Тканевая подготовка

1. Перфузионная фиксация
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 1.1.1-1.1.3 в вытяжном шкафу, чтобы ограничить воздействие параформальдегида (PFA).
   1. Обезболить взрослых самцов мышей (8–16 недель) внутрибрюшинной инъекцией передозировки пентобарбитала натрия (200 мг/кг). Подтверждают адекватность анестезии отсутствием снятия пальцев ног и рефлексов моргания глаз.
   2. Откройте грудную полость и срежьте хирургическими ножницами правый предсердный придаток. Перфьминируйте мышей 20 мл ледяного фосфатного буферного раствора (PBS) с помощью иглы 23 Г, прикрепленной к шприцу объемом 20 мл, с последующей перфузией 20 мл ледяного холодного 4% PFA в 0,1 М фосфатном буфере (ПБ) с использованием другого шприца объемом 20 мл.
      ВНИМАНИЕ: ПФА токсичен и тератогенен. Избегайте вдыхания или контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой.
   3. Удалите ткани мозга из черепа пинцетом. Переложите ткани мозга в трубку объемом 15 мл, содержащую 4% PFA в 0,1 М ПБ, защитите образцы от света и осторожно качайте в течение ночи при 4 °C на шейкере при 50–100 об/мин.
   4. ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные ткани мозга могут храниться в течение нескольких недель в 0,02% азида натрия (NaN₃) в PBS при 4 °C.
      ВНИМАНИЕ: NaN₃ токсичен. Избегайте вдыхания или контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. Поместите его внутрь вытяжного капюшона.
2. Подготовка мозгового среза
   1. Приготовьте 4% агар в PBS, добавив 2 г агара к 50 мл PBS. Разогрейте смесь в микроволновой печи до полного растворения агара. Дайте раствору остыть до 40-45 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вязкое свойство, обеспечиваемое агаропектином, основным компонентом агара, улучшает легкость разрезания срезов ткани.
   2. Добавьте 10 мл раствора агара в 6-луночную культуральную пластину. Погрузите мозговую ткань в раствор агара с помощью щипцов. Дайте агару затвердеть на льду.
   3. Извлеките внедренную мозговую ткань из колодца и обрежьте агар лезвием бритвы. Закрепите блок агара на дне вибратомной ванны с помощью суперклея и налейте 0,1 М ПБ в буферный лоток.
   4. Очистите другое лезвие бритвы, используя безворсовую папиросную бумагу, пропитанную этанолом, и прикрепите лезвие к держателю лезвия вибрирующего слайсера тканей.
   5. Установите скорость сечения 0,14 мм/с с амплитудой 1,4 мм и частотой 75–77 Гц. Разрежьте ткань мозга на кусочки толщиной 1 мм и соберите срезы в 6-луночную пластину клеточной культуры, содержащую PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы мозга могут храниться в течение нескольких недель в 0,02% NaN₃ в PBS при 4 °C.

2. Осветление тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Композиции используемых растворов ScaleS перечислены в таблице 1. Образцы должны быть защищены от света, покрываясь фольгой. Этапы очистки показаны на рисунке 1A.

1. Добавьте 8 мл раствора ScaleS0 в одну лунку 6-луночной клеточной культуральной пластины и добавьте 8 мл раствора ScaleS4 в другую лунку пластины и предварительно нагрейте до 37 °C в инкубаторе.
2. Переложите срезы мозга в предварительно подогретый раствор ScaleS0 шпателем и высиживайте в течение 2 ч при 37 °C в встряхивающемся инкубаторе при 90 об/мин.
3. Переложите пермеабилизированные срезы мозга в 8 мл PBS(–) в 6-луночную пластину для культивирования клеток шпателем и промывайте в течение 15 мин, держа в орбитальном шейкере при 40–60 об/мин. Повторите это дважды.
4. Переложите кусочки мозга в предварительно разогретый 8 мл раствора ScaleS4 шпателем и очистите их путем инкубации в встряхивающем инкубаторе при 90 об/мин в течение 8–12 ч при 37 °C. Очищенные срезы мозга можно увидеть на рисунке 1.

3. Монтаж мозгового среза

ПРИМЕЧАНИЕ: Настраиваемая камера визуализации используется для надежного монтажа очищенных срезов мозга (рисунок 2)⁶. Камера состоит из рамы камеры и нижней крышки. Адаптеры ступени микроскопа также предназначены для установки камеры визуализации непосредственно на ступенях микроскопа (рисунок 2A, B). Каркас камеры и адаптеры ступени микроскопа могут быть напечатаны на 3D-принтере с использованием собственных или аутсорсинговых услуг 3D-печати. Данные 3D-автоматизированного проектирования (CAD) камеры визуализации представлены в Furuta et al. 2022⁶.

1. Для подготовки камеры прикрепите раму камеры к крышке с помощью чувствительного к давлению клея.
2. Готовят 1,5% агарозу в растворе ScaleS4D25(0) (гель ScaleS4), добавляя 1,5 г агарозы в 100 мл раствора во флаконе. Хорошо перемешайте раствор, перемешав и разогрейте раствор в микроволновой печи до полного растворения агарозы. После этого дайте раствору остыть до 37 °C.
3. Установите очищенный мозговой срез на нижнюю крышку камеры визуализации шпателем. Протрите лишний раствор с очищенного среза с помощью чистой папиросной бумаги без ворса.
4. Добавьте гель ScaleS4 на срез мозга с помощью микропипетки, чтобы заполнить камеру визуализации. Поместите сверху еще одну крышку с щипцами и поместите кусок безворсовой папиросной бумаги и стеклянный слайд на крышку в указанном порядке.
5. Перенесите камеру визуализации в холодильник при температуре 4 °C. Поместите металлические гири на стеклянную горку и оставьте их на 30 минут.
6. Извлеките металлические гири, стеклянную горку, безворсовую папиросную бумагу и крышку из камеры визуализации и вытрите лишний гель (рисунок 2A, B).
7. Поместите камеру визуализации в стеклянную чашку Петри диаметром 60 мм и прикрепите ободок камеры визуализации к чашке с помощью клея, похожего на давление. Прикрепите камеру в нескольких точках к чашке Петри.
8. Вылейте раствор ScaleS4 в посуду и аккуратно встряхивайте в течение 1 ч при 20-25 °C на орбитальном шейкере при 40-60 об/мин. Замените свежим раствором и удалите пузырьки воздуха на поверхности геля, аккуратно соскребая поверхность с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл. Установите погруженную камеру визуализации на ступень микроскопа (рисунок 2C).

4. Визуализация CLSM

1. Получайте изображения с помощью CLSM, оснащенного объективом с несколькими погружениями на большое рабочее расстояние (WD) (числовая диафрагма 16x/0,60 [NA], WD = 2,5 мм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объективы с высоким NA могут обеспечить высокое дифракционное разрешение.
2. Включите все необходимое оборудование для обработки изображений (рабочую станцию, микроскоп, сканер, лазеры и ртутную лампу) и запустите программное обеспечение для визуализации CLSM.
3. Установите корректирующий воротник объектива с несколькими погружениями на 1,47. Раствор ScaleS4 имеет показатель преломления (RI) около 1,47 ^5,7. Аберрации, вызванные несоответствием RI, могут нарушить формирование изображения (рисунок 3).
4. Погрузите объектив в раствор и позвольте ему медленно приблизиться к срезу. Удалите все пузырьки воздуха, захваченные на кончике объектива. Найдите интересующие области (ROI) в очищенных тканях с помощью эпифлуоресценции.
5. Задайте параметры получения изображения, проверив соответствующие настройки.
   1. Определите битовую глубину для получения изображения. Размер данных изображения увеличивается с битовой глубиной.
   2. Задайте длину волны обнаружения. Отрегулируйте соответствующий затвор для детектора в соответствии со спектром излучения. Убедитесь, что длина волны обнаружения не покрывает лазерные линии.
   3. Установите разрешение xy . Большие форматы обеспечивают лучшее разрешение xy , но для сбора изображений требуется больше времени.
   4. Установите скорость сканирования. Более медленная скорость сканирования обеспечивает высокое отношение сигнал/шум. Тем не менее, это также увеличивает время выдержки пикселя и риск фотоотбеливания. Выбирайте соответственно.
   5. Отрегулируйте размер точечного отверстия. Размер точечного отверстия контролирует толщину оптического сечения. Меньший размер точечного отверстия создает более тонкое оптическое сечение и, следовательно, лучшее разрешение z , но уменьшает флуоресцентный сигнал. Увеличение размера точечного отверстия обеспечивает более толстый оптический участок с более сильным флуоресцентным сигналом.
   6. Установите мощность лазера, усиление детектора/усилителя и смещение. Постепенно увеличивайте мощность лазера и коэффициент усиления детектора/усилителя до получения подходящего изображения. Высокая мощность лазера несет в себе риск фотоотбеливания. Отрегулируйте смещение (контрастность) соответствующим образом, чтобы получить высокое отношение сигнал/шум.
   7. Определите необходимую площадь обработки почвы на основе размера ROI. Убедитесь, что вся длина и ширина ROI зафиксированы.
   8. Перемещайтесь по очищенным тканям во всех плоскостях и устанавливайте начальную и конечную точки стека. Установите размер z-шага в соответствии с требуемым z-разрешением.
6. Собирайте изображения, когда вы удовлетворены настройками получения изображений, и записывайте захваченные изображения. Обрабатывайте изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Результаты

Оптическая очистка среза мозга мыши толщиной 1 мм была достигнута с использованием этого протокола. Рисунок 1B представляет собой изображения передачи среза мозга мыши до и после очистки. Метод очистки тканей сделал срез мозга мыши толщиной 1 мм прозрачным. Незначительное расш?...

Обсуждение

Критические шаги в рамках протокола
В протоколе есть несколько критических шагов, которые следует выполнять с максимальной осторожностью для получения значимых результатов. Равномерная фиксация образцов необходима для 3D-визуализации в крупномасштабных тканях. Объектив, о...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x multi-immersion objective lens	Leica Microsystems	HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
Agar	Nacalai Tesque	01028-85
Agarose	TaKaRa Bio	L03
Dimethyl sulfoxide	Nacalai Tesque	13407-45
D-Sorbitol	Nacalai Tesque	06286-55
γ-cyclodextrin	Wako Pure Chemical Industries	037-10643
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Huygens Essential	Scientific Volume Imaging	ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
Imaris	Bitplane	ver. 9.0.0
Leica Application Suite X	Leica Microsystems	LAS X, ver. 3.5.5.19976
Methyl-β-cyclodextrin	Tokyo Chemical Industry	M1356
Paraformaldehyde	Merck Millipore	1.04005.1000
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)	Nacalai Tesque	27575-31	10x PBS(–)
Sodium azide	Nacalai Tesque	31233-55
Sodium pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
TCS SP8	Leica Microsystems	N/A
Triton X-100	Nacalai Tesque	35501-15
Urea	Nacalai Tesque	35940-65
Vibrating tissue slicer	Dosaka EM	PRO7N