Une méthode de nettoyage des tissus pour l’imagerie neuronale des échelles mésoscopiques aux échelles microscopiques

Résumé

Le protocole fournit une méthode détaillée d’imagerie neuronale dans une tranche de cerveau à l’aide d’une méthode de nettoyage destissus, Sca l eSF. Le protocole comprend la préparation des tissus cérébraux, la clarification des tissus, la manipulation des tranches nettoyées et l’imagerie par microscopie confocale à balayage laser des structures neuronales, des niveaux mésoscopiques aux niveaux microscopiques.

Résumé

Un protocole détaillé est fourni ici pour visualiser les structures neuronales des niveaux mésoscopiques aux niveaux microscopiques dans les tissus cérébraux. Les structures neuronales allant des circuits neuronaux aux structures neuronales subcellulaires sont visualisées dans des tranches de cerveau de souris optiquement nettoyées avec ScaleSF. Cette méthode de nettoyage est une version modifiée de ScaleS et est une méthode de nettoyage des tissus hydrophiles pour les tranches de tissu qui permet d’obtenir une capacité de nettoyage puissante ainsi qu’un haut niveau de préservation des signaux de fluorescence et de l’intégrité structurelle. Une chambre d’imagerie tridimensionnelle (3D) personnalisable est conçue pour un montage fiable des tissus cérébraux nettoyés. Les cerveaux de souris injectés avec un vecteur viral adéno-associé porteur d’un gène de protéine fluorescente verte amélioré ont été fixés avec 4% de paraformaldéhyde et coupés en tranches de 1 mm d’épaisseur avec une trancheuse de tissu vibrante. Les tranches de cerveau ont été éliminées en suivant le protocole de nettoyage, qui comprend des incubations séquentielles dans trois solutions, à savoir la solution ScaleS0, la solution saline tampon phosphate (–) et la solution ScaleS4, pour un total de 10,5 à 14,5 h. Les tranches de cerveau nettoyées ont été montées sur la chambre d’imagerie et incorporées dans du gel d’agarose à 1,5% dissous dans la solution ScaleS4D25(0). L’acquisition d’images 3D des tranches a été réalisée à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal équipé d’une lentille d’objectif multi-immersion d’une longue distance de travail. En commençant par l’imagerie neuronale mésoscopique, nous avons réussi à visualiser de fines structures neuronales subcellulaires, telles que les épines dendritiques et les boutons axonaux, dans les tranches de cerveau optiquement dégagées. Ce protocole faciliterait la compréhension des structures neuronales des circuits aux échelles des composants subcellulaires.

Introduction

Les méthodes de nettoyage des tissus ont amélioré l’imagerie indépendante de la profondeur des échantillons biologiques et cliniques avec la microscopie optique, permettant l’extraction d’informations structurelles sur des tissus intacts ^1,2. Les techniques de nettoyage optique pourraient également accélérer et réduire le coût de l’analyse histologique. À l’heure actuelle, trois grandes approches de défrichage sont disponibles : les méthodes^hydrophiles, hydrophobes et à base d’hydrogel ^1,2. Les approches hydrophiles surpassent en préservant les signaux de fluorescence et l’intégrité des tissus et sont moins toxiques que les deux autres approches ^3,4.

Une méthode de nettoyage hydrophile, ScaleS, occupe une position distinctive avec sa préservation de l’intégrité structurelle et moléculaire ainsi que sa puissante capacité de nettoyage (spectre de clairance-préservation)⁵. Dans une étude précédente, nous avons développé un protocole de nettoyage rapide et isométrique, ScaleSF, pour les tranches de tissu (~1 mm d’épaisseur) en modifiant la procédure de nettoyage de ScaleS⁶. Ce protocole de nettoyage nécessite des incubations séquentielles de tranches de cerveau dans trois solutions pendant 10,5 à 14,5 h. La méthode est dotée d’un spectre de conservation de clairance élevé, compatible même avec l’analyse par microscopie électronique (EM) (figure supplémentaire 1), permettant une imagerie tridimensionnelle (3D) haute résolution à plusieurs échelles avec une reconstruction précise du signal⁶. Ainsi, ScaleSF devrait être efficace en particulier dans le cerveau, où les cellules neuronales élaborent des processus exubérants d’une longueur énorme et organisent des structures subcellulaires fines spécialisées pour transmettre et recevoir des informations. L’extraction d’informations structurelles avec des échelles allant du circuit aux niveaux subcellulaires sur les cellules neuronales est très utile pour mieux comprendre les fonctions cérébrales.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour visualiser les structures neuronales avec des échelles allant du niveau mésoscopique / circuit au niveau microscopique / subcellulaire en utilisant ScaleSF. Le protocole comprend la préparation des tissus, la clarification des tissus, la manipulation des tissus nettoyés et l’imagerie par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) des tissus nettoyés. Notre protocole se concentre sur l’interrogation des structures neuronales des circuits aux échelles des composants subcellulaires. Pour une procédure détaillée de préparation des solutions et d’injection stéréotaxique de vecteurs du virus adéno-associé (AAV) dans le cerveau des souris, se référer à Miyawaki et al. 2016⁷ et Okamoto et al. 2021⁸, respectivement.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Juntendo (approbation n° 2021245, 2021246) et réalisées conformément aux Directives fondamentales pour la bonne conduite des expériences sur les animaux par le Conseil scientifique du Japon (2006). Ici, des souris mâles C57BL/6J injectées avec un vecteur AAV porteur du gène de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) et de la parvalbumine (PV)/myristoylation-EGFP-récepteur des lipoprotéines de basse densité C-terminal chromosome artificiel bactérien (BAC) souris transgéniques (souris PV-FGL)⁹ ont été utilisées. Les souris PV-FGL ont été maintenues en fond C57BL/6J. Aucune différence fondée sur le sexe n’a été observée en ce qui concerne cette étude.

1. Préparation des tissus

1. Fixation par perfusion
   REMARQUE : Effectuer les étapes 1.1.1 à 1.1.3 dans une hotte pour limiter l’exposition au paraformaldéhyde (PFA).
   1. Anesthésier des souris mâles adultes (âgées de 8 à 16 semaines) par injection intrapéritonéale de surdosage de pentobarbital de sodium (200 mg/kg). Confirmer l’adéquation de l’anesthésie par l’absence de sevrage par pincement des orteils et de réflexes de clignement des yeux.
   2. Ouvrez la cavité thoracique et coupez l’appendice auriculaire droit avec des ciseaux chirurgicaux. Perfuser les souris avec 20 mL de solution saline tampon phosphate glacée (PBS) à l’aide d’une aiguille de 23 G attachée à une seringue de 20 mL, suivie d’une perfusion de 20 mL de PFA glacé à 4 % dans un tampon phosphate (PB) glacé à l’aide d’une autre seringue de 20 mL.
      ATTENTION : Le PFA est toxique et tératogène. Évitez l’inhalation ou le contact avec la peau, les yeux et les muqueuses.
   3. Retirez les tissus cérébraux du crâne avec une pince à épiler. Transférer les tissus cérébraux dans un tube de 15 mL contenant 4 % de PFA dans 0,1 M PB, protéger les échantillons de la lumière et basculer doucement pendant la nuit à 4 °C sur un agitateur à 50-100 tr/min.
   4. REMARQUE: Les tissus cérébraux récoltés peuvent être conservés pendant plusieurs semaines dans de l’azoture de sodium à 0,02% (NaN₃) dans du PBS à 4 ° C.
      ATTENTION : NaN₃ est toxique. Évitez l’inhalation ou le contact avec la peau, les yeux et les muqueuses. Manipulez-le à l’intérieur d’une hotte aspirante.
2. Préparation de tranches de cerveau
   1. Préparer une gélose à 4 % dans du PBS en ajoutant 2 g de gélose à 50 mL de PBS. Cuire le mélange au micro-ondes jusqu’à ce que la gélose soit complètement dissoute. Laisser refroidir la solution à 40-45 °C.
      REMARQUE: La propriété visqueuse fournie par l’agaropectine, un composant majeur de la gélose, améliore la facilité de coupe des tranches de tissu.
   2. Ajouter 10 mL de la solution de gélose à une plaque de culture à 6 puits. Immergez le tissu cérébral dans la solution d’agar à l’aide de pinces. Laissez la gélose se solidifier sur la glace.
   3. Retirez le tissu cérébral incrusté du puits et coupez la gélose avec une lame de rasoir. Fixez le bloc de gélose sur le fond du bain vibratome avec de la superglue et versez 0,1 M PB dans le bac tampon.
   4. Nettoyez une autre lame de rasoir à l’aide d’un papier de soie non pelucheux imbibé d’éthanol et fixez la lame au support de lame de la trancheuse de tissu vibrante.
   5. Réglez la vitesse de sectionnement à 0,14 mm/s avec une amplitude de 1,4 mm et la fréquence à 75–77 Hz. Coupez le tissu cérébral en tranches de 1 mm d’épaisseur et collectez les tranches dans une plaque de culture cellulaire de 6 puits contenant du PBS.
      REMARQUE: Les tranches de cerveau peuvent être stockées pendant plusieurs semaines dans 0,02% NaN₃ dans PBS à 4 ° C.

2. Clarification des tissus

NOTE: Les compositions des solutions ScaleS utilisées sont énumérées dans le tableau 1. Les échantillons doivent être protégés de la lumière en les recouvrant d’une feuille d’aluminium. Les étapes de compensation sont illustrées à la figure 1A.

1. Ajouter 8 mL de solution ScaleS0 à un puits d’une plaque de culture cellulaire à 6 puits et ajouter 8 mL de solution ScaleS4 à un autre puits de la plaque et préchauffer à 37 °C dans un incubateur.
2. Transférer les tranches de cerveau dans la solution préchauffée ScaleS0 à l’aide d’une spatule et incuber pendant 2 h à 37 °C dans un incubateur à agitation à 90 tr/min.
3. Transférer les tranches de cerveau perméabilisées dans 8 mL de PBS(–) dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits avec une spatule et laver pendant 15 min en les maintenant dans un shaker orbital à 40-60 tr / min. Répétez cette opération deux fois.
4. Transférer les tranches de cerveau dans les 8 mL préchauffés de la solution ScaleS4 avec une spatule et les éliminer en les couplant dans un incubateur à agitation à 90 tr/min pendant 8–12 h à 37 °C. Une tranche de cerveau dégagée peut être vue à la figure 1.

3. Montage de tranches de cerveau

REMARQUE : Une chambre d’imagerie personnalisable est utilisée pour un montage fiable des tranches de cerveau nettoyées (Figure 2)⁶. La chambre se compose du cadre de la chambre et du couvercle inférieur. Les adaptateurs d’étage de microscope sont également conçus pour monter directement la chambre d’imagerie sur les étages de microscope (Figure 2A,B). Les adaptateurs de monture de chambre et d’étage de microscope peuvent être imprimés en 3D à l’aide de services d’impression 3D internes ou externalisés. Les données de conception assistée par ordinateur (CAO) 3D de la chambre d’imagerie sont fournies dans Furuta et al. 2022⁶.

1. Pour la préparation de la chambre, fixez le cadre de la chambre à un couvercle à l’aide d’un adhésif sensible à la pression.
2. Préparer l’agarose à 1,5 % dans une solution ScaleS4D25(0) (gel ScaleS4) en ajoutant 1,5 g d’agarose à 100 mL de la solution dans un flacon. Bien mélanger la solution en remuant et la cuire au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute. Une fois cela fait, laissez la solution refroidir à 37 °C.
3. Montez la tranche de cerveau dégagée sur le couvercle inférieur de la chambre d’imagerie à l’aide d’une spatule. Essuyez l’excès de solution de la tranche nettoyée à l’aide d’un papier de soie propre et non pelucheux.
4. Ajouter le gel ScaleS4 sur la tranche de cerveau à l’aide d’une micropipette pour remplir la chambre d’imagerie. Placez un autre couvercle sur le dessus avec une pince et placez un morceau de papier de soie non pelucheux et une glissière en verre sur le couvercle dans cet ordre.
5. Transférer la chambre d’imagerie au réfrigérateur à 4 °C. Placez des poids métalliques sur la glissière en verre et laissez-les pendant 30 min.
6. Retirez les poids métalliques, la lame de verre, le papier de soie non pelucheux et le couvercle de la chambre d’imagerie et essuyez l’excès de gel (Figure 2A, B).
7. Placez la chambre d’imagerie dans une boîte de Petri en verre de 60 mm et fixez le bord de la chambre d’imagerie à la boîte avec un adhésif sensible à la pression semblable à du mastic. Fixez la chambre en plusieurs points à la boîte de Pétri.
8. Verserlasolution Sca l eS4 dans le plat et agiter doucement pendant 1 h à 20-25 °C sur un agitateur orbital à 40-60 tr/min. Remplacer par une solution fraîche et éliminer les bulles d’air sur la surface du gel en grattant doucement la surface à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL. Montez la chambre d’imagerie immergée sur une scène de microscope (Figure 2C).

4. Imagerie CLSM

1. Acquérir des images à l’aide d’un CLSM équipé d’un objectif multi-immersion d’une longue distance de travail (WD) (ouverture numérique 16x/0,60 [NA], WD = 2,5 mm).
   REMARQUE: Les objectifs à NA élevé peuvent fournir une résolution élevée limitée par diffraction.
2. Allumez tous les équipements d’imagerie pertinents (station de travail, microscope, scanner, lasers et lampe au mercure) et lancez un logiciel d’imagerie CLSM.
3. Réglez le collier de correction de l’objectif multi-immersion sur 1,47. La solution ScaleS4 a un indice de réfraction (RI) d’environ 1,47 ^5,7. Les aberrations induites par l’incompatibilité de RI peuvent perturber la formation de l’image (Figure 3).
4. Immergez l’objectif dans la solution et laissez-le s’approcher lentement de la tranche. Retirez toutes les bulles d’air piégées sur la pointe de l’objectif. Trouvez des régions d’intérêt (ROI) dans les tissus nettoyés en utilisant l’épifluorescence.
5. Définissez les paramètres d’acquisition d’image en testant les paramètres appropriés.
   1. Déterminez la profondeur de bits pour l’acquisition d’images. La taille des données de l’image augmente avec la profondeur de bits.
   2. Définissez la longueur d’onde de détection. Ajustez la grille appropriée pour le détecteur en fonction du spectre d’émission. Assurez-vous que la longueur d’onde de détection ne couvre aucune ligne laser.
   3. Définissez la résolution xy . Les formats plus grands offrent de meilleures résolutions xy , mais il faut plus de temps pour collecter les images.
   4. Définissez la vitesse d’analyse. Une vitesse de balayage plus lente fournit un rapport signal/bruit élevé. Cependant, il augmente également le temps de séjour des pixels et le risque de photoblanchiment. Choisissez en conséquence.
   5. Ajustez la taille du sténopé. La taille du sténopé contrôle l’épaisseur de la section optique. Une taille de sténopé plus petite crée une section optique plus mince, et donc une meilleure résolution z , mais réduit le signal de fluorescence. L’agrandissement de la taille du sténopé fournit une section optique plus épaisse avec un signal de fluorescence plus fort.
   6. Réglez la puissance du laser, le gain du détecteur / amplificateur et le décalage. Augmentez progressivement la puissance du laser et le gain du détecteur/amplificateur jusqu’à ce qu’une image appropriée soit obtenue. Une puissance laser élevée comporte le risque de photoblanchiment. Ajustez le décalage (contraste) de manière appropriée pour obtenir un rapport signal/bruit élevé.
   7. Déterminez la surface de labour nécessaire en fonction de la taille du retour sur investissement. Assurez-vous que toute la longueur et la largeur du retour sur investissement sont capturées.
   8. Naviguez dans les tissus dégagés dans tous les plans et définissez les points de départ et d’arrivée de la pile. Définissez la taille z-step en fonction de la résolution z souhaitée.
6. Collectez des images lorsque vous êtes satisfait des paramètres d’acquisition d’images et enregistrez les images capturées. Traitez les images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

Résultats

Le nettoyage optique d’une tranche de cerveau de souris de 1 mm d’épaisseur a été réalisé à l’aide de ce protocole. La figure 1B représente les images de transmission d’une tranche de cerveau de souris avant et après le traitement de nettoyage. La méthode de nettoyage des tissus a rendu transparente une tranche de cerveau de souris de 1 mm d’épaisseur. Une légère expansion de la taille finale des tranches de cerveau a été constatée après l’incubation dans la solution de claira...

Discussion

Étapes critiques du protocole
Il y a quelques étapes critiques dans le protocole qui doivent être menées avec la plus grande prudence pour obtenir des résultats significatifs. La fixation uniforme des échantillons est impérative pour l’imagerie 3D dans les tissus à grande échelle. La lentille de l’objectif, l’échantillon et le fluide d’immersion doivent avoir une IR correspondante. L’inadéquation de l’IR entre eux conduira à une imagerie très perturbée des cellules exprimant ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x multi-immersion objective lens	Leica Microsystems	HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
Agar	Nacalai Tesque	01028-85
Agarose	TaKaRa Bio	L03
Dimethyl sulfoxide	Nacalai Tesque	13407-45
D-Sorbitol	Nacalai Tesque	06286-55
γ-cyclodextrin	Wako Pure Chemical Industries	037-10643
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Huygens Essential	Scientific Volume Imaging	ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
Imaris	Bitplane	ver. 9.0.0
Leica Application Suite X	Leica Microsystems	LAS X, ver. 3.5.5.19976
Methyl-β-cyclodextrin	Tokyo Chemical Industry	M1356
Paraformaldehyde	Merck Millipore	1.04005.1000
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)	Nacalai Tesque	27575-31	10x PBS(–)
Sodium azide	Nacalai Tesque	31233-55
Sodium pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
TCS SP8	Leica Microsystems	N/A
Triton X-100	Nacalai Tesque	35501-15
Urea	Nacalai Tesque	35940-65
Vibrating tissue slicer	Dosaka EM	PRO7N