FACS-İzolasyon ve Fibro-Adipojenik Progenitörlerin ve Kas Kök Hücrelerinin Bozulmamış ve Yaralı Fare İskelet Kasından Kültürü

Özet

Fibro-adipojenik progenitör hücrelerin (FAP'lar) ve kas kök hücrelerinin (MuSC'ler) kesin olarak tanımlanması, fizyolojik ve patolojik koşullarda biyolojik işlevlerini incelemek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin fare kaslarından izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için kılavuzlar sağlar.

Özet

Fibro-adipojenik progenitör hücreler (FAP'ler), fibrojenik, adipojenik, osteojenik veya kondrojenik soy boyunca farklılaşabilen iskelet kası yerleşik mezenkimal stromal hücrelerin (MSC'ler) bir popülasyonudur. Kas kök hücreleri (MuSC'ler) ile birlikte FAP'lar, hücre dışı matrisi (ECM) aktif olarak korurken ve yeniden şekillendirirken, kas homeostazı, onarımı ve yenilenmesinde kritik bir rol oynar. Kronik hasar ve kas distrofileri gibi patolojik durumlarda, FAP'lar anormal aktivasyona uğrar ve kollajen üreten fibroblastlara ve adipositlere farklılaşarak fibroz ve kas içi yağ infiltrasyonuna yol açar. Bu nedenle, FAP'lar kas rejenerasyonunda, MuSC döngüsünü sürdürerek ve doku onarımını teşvik ederek veya iskelet kası dokusunun bütünlüğünü ve işlevini tehlikeye atan fibrotik skar oluşumuna ve ektopik yağ infiltrasyonlarına katkıda bulunarak ikili bir rol oynamaktadır. FAP ve MuSC'lerin uygun şekilde saflaştırılması, bu hücrelerin fizyolojik ve patolojik koşullardaki biyolojik rolünü anlamak için bir ön koşuldur. Burada, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanarak FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin farelerin uzuv kaslarından eşzamanlı izolasyonu için standartlaştırılmış bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol, mononüklee hücrelerin tüm ekstremite kaslarından ve yaralı tibialis anterior (TA) kaslarından mekanik ve enzimatik ayrışmasını ayrıntılı olarak açıklamaktadır. FAP'lar ve MuSC'ler daha sonra saf hücre popülasyonları elde etmek için yarı otomatik bir hücre sıralayıcısı kullanılarak izole edilir. Ek olarak, sessiz ve aktif FAP'ları ve MuSC'leri tek başına veya kokültür koşullarında kültürlemek için optimize edilmiş bir yöntem açıklıyoruz.

Giriş

İskelet kası, yetişkin insan ağırlığının ~% 40'ını oluşturan vücuttaki en büyük dokudur ve duruşun korunmasından, hareket üretilmesinden, bazal enerji metabolizmasının düzenlenmesinden ve vücut ısısından sorumludur¹. İskelet kası oldukça dinamik bir dokudur ve mekanik stres, metabolik değişiklikler ve günlük çevresel faktörler gibi çeşitli uyaranlara uyum sağlama konusunda olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. Ek olarak, iskelet kası akut yaralanmaya yanıt olarak yenilenir ve morfolojisinin ve fonksiyonlarının tamamen restorasyonuna yol açar². İskelet kası plastisitesi, esas olarak, miyofiber plazma zarı ile bazal lamina ^2,3 arasında yer alan uydu hücreleri olarak da adlandırılan yerleşik kas kök hücrelerinin (MuSC'ler) popülasyonuna dayanır. Normal koşullar altında, MuSC'ler kas nişinde sessiz bir durumda bulunur, hücresel ciroyu telafi etmek ve kök hücre havuzunu yenilemek için sadece birkaç bölüm^{vardır 4}. Yaralanmaya yanıt olarak, MuSC'ler hücre döngüsüne girer, çoğalır ve ya yeni kas liflerinin oluşumuna katkıda bulunur ya da kendini yenileme sürecinde nişe geri döner ^2,3. MuSC'lere ek olarak, iskelet kasının homeostatik bakımı ve yenilenmesi, fibro-adipojenik progenitörler (FAP'ler) olarak adlandırılan bir kas yerleşik hücre popülasyonunun ^{desteğine dayanır5,6,7}. FAP'lar kas bağ dokusuna gömülü mezenkimal stromal hücrelerdir ve fibrojenik, adipojenik, osteojenik veya kondrojenik soy 5,8,9,10 boyunca farklılaşabilir. FAP'lar, kas kök hücre nişinde hücre dışı matriks proteinlerinin bir kaynağı oldukları için MuSC'ler için yapısal destek sağlar. FAP'lar ayrıca sitokinler ve miyogenez ve kas büyümesi için trofik destek sağlayan büyüme faktörleri salgılayarak iskelet kasının uzun süreli bakımını teşvik eder ^6,11. Akut kas hasarı üzerine, FAP'lar yenilenen kasın yapısal bütünlüğünü destekleyen ve MuSC'lerin proliferasyonunu ve farklılaşmasını parakrin bir şekilde sürdürmek için elverişli bir ortam sağlayan geçici bir niş üretmek için hızla çoğalırlar⁵. Rejenerasyon ilerledikçe, FAP'lar apoptoz ile rejeneratif kastan temizlenir ve sayıları yavaş yavaş bazal seviye^12'ye geri döner. Bununla birlikte, kronik kas hasarını destekleyen koşullarda, FAP'lar pro-apoptotik sinyallemeyi geçersiz kılar ve kollajen üreten fibroblastlara ve adipositlere farklılaşarak ektopik yağ infiltrasyonlarına ve fibrotik skar oluşumuna yol açan kas nişinde birikir^12,13.

Çok etkili olmaları ve rejeneratif yetenekleri nedeniyle, FAP'lar ve MuSC'ler iskelet kası bozukluklarının tedavisinde rejeneratif tıpta prospektif hedefler olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, fonksiyonlarını ve terapötik potansiyellerini araştırmak için, FAP ve MuSC'lerin izolasyonu ve kültürü için etkili ve tekrarlanabilir protokoller oluşturmak önemlidir.

Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), boyut ve granülerlik gibi morfolojik özelliklere dayanarak farklı hücre popülasyonlarını tanımlayabilir ve hücre yüzey belirteçlerine karşı yönlendirilmiş antikorların kullanımına dayalı olarak hücreye özgü izolasyona izin verir. Yetişkin farelerde, MuSC'ler vasküler hücre adezyon molekülü 1'i (VCAM-1, CD106 olarak da bilinir) 14,15 ve α7-Integrin^15'i ifade ederken, FAP'lar trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü α (PDGFRa) ve kök hücre antijeni 1'i (Sca1 veya Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 olarak ifade eder. . Burada açıklanan protokolde MuSC'ler CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ olarak tanımlanırken, FAP'lar CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- olarak tanımlanmıştır. Alternatif olarak, PDGFRαEGFP fareleri, FAP'ları CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- olayları^18,19 olarak izole etmek için kullanıldı. Ayrıca, PDGFRa-GFP + hücrelerinin floresan sinyali ile yüzey belirteci Sca1 tarafından tanımlanan hücreler arasındaki örtüşmeyi karşılaştırdık. Analizimiz, GFP eksprese eden tüm hücrelerin Sca1 için de pozitif olduğunu gösterdi, bu da her iki yaklaşımın da FAP'ların tanımlanması ve izolasyonu için kullanılabileceğini gösterdi. Son olarak, spesifik belirteç antikorları ile boyama, her hücre popülasyonunun saflığını doğruladı.

Protokol

Yapılan tüm hayvan deneyleri, Ulusal Artrit, Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü (NIAMS) Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ACUC) tarafından onaylanan kurumsal kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolü uygulayan araştırmacılar, yerel hayvan etiği kurallarına uymalıdır.

NOT: Bu protokol, FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin erkek ve dişi farelerin (3-6 ay) arka ekstremite ve yaralı tibialis anterior (TA) kaslarından nasıl izole edileceğini ayrıntılı olarak açıklamakta ve FAP ve MuSC'lerin birlikte kültürlenmesi için kılavuzlar sunmaktadır. Deneysel prosedüre genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokolün tüm adımları, aksi belirtilmedikçe steril koşullarda ve oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilmelidir.

1. Reaktif kurulumu

1. Yıkama Ortamı (WM): Ham'ın F-10 Nutrient Mix hücre ortamına% 10 (hacim / hacim) at serumu ve 1x penisilin / streptomisin ekleyerek bu çözeltiyi hazırlayın. WM önceden hazırlanabilir ve 4 °C'de saklanabilir.
2. Kas Ayrışma Tamponu (MDB): Kollajenaz II'yi WM'de çözerek bu tamponu hazırlayın. Tüm arka ekstremite kaslarını topluyorsanız, her fare için 1000 U / mL Kollajenaz II'yi 10 mL WM'de çözün (50 mL'lik bir konik tüp içine hazırlanmalıdır). TA kaslarını topluyorsanız, her fare için 7 mL WM'de 800 U / mL Kollajenaz II'yi çözün (15 mL'lik bir konik tüp içine hazırlanmalıdır). TA kasları için bu, hücre peletlerini daha iyi görselleştirmeye ve daha yüksek FAP ve MuSC verimi elde etmeye yardımcı olacaktır. Kasları toplamadan önce MDB'yi taze hazırlayın ve ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutun.
3. Kollajenaz II çözelti stoğu: Kollajenaz II'yi steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1000 U/mL'lik son konsantrasyona eriterek bu çözeltiyi hazırlayın. Çözeltiyi 0,45 μm'lik bir şırınga filtresinden ve aliquot'tan 1 mL stoklara süzün. Çözeltiyi -20 °C'de saklayın.
4. Dispase çözelti stoğu: Dispase'ı steril 1x PBS'de 11 U/mL'lik son konsantrasyona kadar çözerek bu çözeltiyi hazırlayın. Çözeltiyi 0,45 μm'lik bir şırınga filtresinden ve aliquot'tan 1 mL stoklara süzün. Çözeltiyi -20 °C'de saklayın.
5. DMEM'i% 10 (hacim / hacim) fetal sığır serumu, 1x penisilin / streptomisin ve 2.5 ng / mL FGF ile destekleyerek FAP'ın kültür ortamını hazırlayın. Ortamı 4 °C'de saklayın.
6. F10'u %10 (hacim/hacim) at serumu, 1x penisilin/streptomisin ve 2.5 ng/mL FGF ile tamamlayan MuSC'nin kültür ortamını hazırlayın. Ortamı 4 °C'de saklayın.
7. DMEM'i% 10 (hacim / hacim) fetal sığır serumu,% 10 (hacim / hacim) at serumu, 1x penisilin / streptomisin ve 2.5 ng / mL FGF ile destekleyerek kokültür ortamını hazırlayın. Ortamı 4 °C'de saklayın.

2. Arka bacak kas hasadı

1. 6 cm'lik bir kaba (fare başına bir tabak) 2-3 mL WM ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.
2. Boğulma yoluyla ötenazi yapın: fareyi bir CO 2 odasına yerleştirin ve% 100 CO_{2 ekleyin}. Ölümü doğrulamak için servikal çıkık kullanın.
3. Fare sırtüstü yatağını bir diseksiyon pedine yerleştirin ve kontaminasyonu önlemek için% 70 (hacim / hacim) etanol ile püskürtün.
4. Fare göbeği derisinin merkezini sıkıştırmak ve ~ 1 cm'lik bir açıklığı yatay olarak kesmek için forseps kullanın. Yara kenarlarını ve masayı kavrayın, altındaki kasları ortaya çıkarmak için açıklığı zıt yönlere çekerek farenin içinde. O sırada farenin arka bacağındaki bir tarafı ortaya çıkarın.
5. Kasları toplamadan önce, hamstringler ile kuadrisepsin proksimal ucu arasındaki kaslar arası yağları çıkarın. Bu, FAP'ların ve MuSC'lerin izolasyonunu artıracaktır.
6. Dokuya zarar vermeden, alttaki TA ve ekstansör digitorum longus (EDL) kaslarını açığa çıkarmak için fasyayı kırmak ve soymak için keskin forseps kullanın. Kasları tibiadan ayırmak için forsepslerin keskin ucunu TA / EDL kaslarının altında çalıştırın.
7. TA / EDL'yi ayak bileğine bağlayan tendonları kesin ve forseps ile tutarken, TA / EDL'nin uzunlamasına çizgisi boyunca kasları makasla kesin. Tüm TA/EDL kaslarını ayırmak için diz çevresindeki tendonları kesin. Kasları buz üzerinde tutulan 6 cm'lik bir kaba yerleştirin.
8. Gastroknemius ve soleus kaslarını ayak bileğindeki tüm tendonları keserek ve kasları tibia ve fibuladan ayırarak izole etmeye devam edin. Diz çevresini kesin ve kasları 6 cm'lik tabağa aktarın.
9. Kuadrisepslerin etrafındaki fasyayı soyun ve forsepslerin keskin ucunu kas ve kemik arasında çalıştırarak femurdan ayırın. Diz çevresindeki tendonları kesin ve kuadrisepsleri distal uçta forseps ile tutarken, femur boyunca keserek kasın geri kalanını kesin. Kasları 6 cm'lik tabağa yerleştirin.
10. Hamstringleri ve femur etrafındaki kalan kasları ayırın ve bunları 6 cm'lik tabağa aktarın. Arka ekstremite kaslarını buz üzerinde tutulan 6 cm'lik bir tabakta toplayın.
    NOT: Mümkün olduğunda, aşağı akış izolasyonuna müdahale edebilecek kan kümelerinin oluşumunu önlemek için kan damarlarına zarar vermekten kaçının. Kanama meydana gelirse, eksize edilen damarı derhal kanı emmek için steril bir gazlı bezle lekeleyin.
11. Kontralateral ekstremiteden TA, EDL, gastroknemius, soleus, kuadrisep ve hamstring kaslarını toplayın.
    NOT: Tüm arka ekstremite kaslarını izole ederken, iki veya daha fazla fareyi bir araya getirmeyin. TA kasları izole edilirse, üç adede kadar TA kası bir araya getirilebilir.

3. Mekanik ve enzimatik kas sindirimi

1. WM'yi 6 cm'lik çanaktan aspire edin ve kasları nemli tutmak için 1-2 mL MDB ekleyin.
2. İyi kıyılmış dokudan oluşan bir bulamaç macunu elde edene kadar kasları iyice kesin. Bunu yapmak için, bir kas parçasının bir ucunu tutmak için forseps kullanın, ardından kasları daha az sıkı olana kadar yırtmak ve dilimlemek için bir neşter kullanın.
3. Makas kullanarak, kası 1-2 dakika boyunca küçük parçalara ayırmaya devam edin. İyi kıyılmış bir kas çamuru elde edene kadar her kas grubu için bu adımı tekrarlayın.
   NOT: Bu, FAP'ların ve MuSC'lerin verimini en üst düzeye çıkarmak için çok kritik bir adımdır. Uygun bir kas kıyma sağlamak için bu adımda 8-10 dakika (sadece TA kaslarını izole ediyorsa 4-5 dakika) harcamanız önerilir.
4. Kıyılmış kasları her fareden MDB içeren konik tüpe aktarın.
5. Tüpleri laboratuvar filmi ile kapatın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 saat boyunca ajitasyonlu (75 rpm) inkübe edin. Tüpleri sallanma yolu boyunca yatay olarak yerleştirin ve tüpleri suya batırılmış halde tutmak için ağırlıklar kullanın.
6. Fare başına 1 mL Kollajenaz II stoğu ve 1 mL dispase stoğu çözün. Kullanmadan önce, dispase stoğu sallanan bir kova rotorunda 10.000 x g'de 4 ° C'de 1 dakika boyunca döndürün. Sadece süpernatant kullanın.
7. Tüm arka bacak kasları toplandıysa, aşağıdaki gibi devam edin:
   1. 1 saat sonra, tüpü çalkalayıcıdan çıkarın ve WM ile 50 mL'ye doldurun.
   2. Hücreleri, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de sallanan bir kova rotorunda santrifüj edin. 42 mL süpernatantı iki yeni tüpe aktarın (her tüpte ~21 mL) ve orijinal tüpte ~8 mL bırakın.
      1. 50 mL'ye kadar 21 mL süpernatant içeren yeni tüpleri WM ile doldurun. hücreleri 4 ° C'de 8 dakika boyunca 350 x g'de sallanan bir kova rotorunda tekrar santrifüj edin. Tüm süpernatantları aspire edin ve peletleri buz üzerinde tutun.
   3. ~8 mL MDB içeren orijinal tüpe 1 mL kollajenaz II stoğu ve 1 mL dispase stoğu ekleyin.
   4. 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, peleti tıkanmadan 10 kez askıya alın. Çözeltiyi tüpün duvarına doğru dışarı çıkarın ve kabarcık oluşumunu önleyin. Yeniden süspansiyon sırasında tıkanma meydana gelirse, kas parçalarını mekanik olarak bozmak için pipetin ucunu tüpün dibine doğru itin. Adım 3.9'a geçin.
8. TA kasları toplandıysa, aşağıdaki gibi devam edin:
   1. 1 saat sonra, tüpü çalkalayıcıdan çıkarın ve WM ile 15 mL'ye doldurun.
   2. Hücreleri, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de sallanan bir kova rotorunda santrifüj edin. 13 mL süpernatantı yeni bir 15 mL tüpe aktarın ve orijinal tüpte ~ 2 mL bırakın.
      1. 15 mL'ye kadar süpernatantın 13 mL'sini içeren yeni tüpü WM ile doldurun. hücreleri 4 ° C'de 8 dakika boyunca 350 x g'de sallanan bir kova rotorunda tekrar santrifüj edin. Tüm süpernatantı aspire edin ve peleti buz üzerinde tutun.
   3. 1000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, peleti orijinal tüpte tıkanmadan yukarı ve aşağı doğru yeniden askıya alın.
   4. 2 mL MDB içeren orijinal tüpe 1 mL Kollajenaz II stoğu ve 1 mL dispase stoğu ekleyin ve WM ile 10 mL'ye kadar doldurun.
9. Tüpleri laboratuvar filmi ile kapatın ve 30 dakika boyunca ajitasyonlu (75 rpm) 37 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin. Tüpleri adım 3.5'teki gibi yerleştirin.

4. Mononüklee hücrelerin üretimi

NOT: 15 mL'lik bir konik tüpte toplanan TA kaslarıyla çalışıyorsanız, adım 4.1'e geçmeden önce süspansiyonu 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın.

1. 30 dakika sonra, tüpü çalkalayıcıdan çıkarın. Kas süspansiyonunu 20 G'lik bir iğne ile 10 mL'lik bir şırıngadan başarıyla 10 kez aspire edin ve çıkarın.
   NOT: Kabarcıkları ve köpüklenmeyi önlemek için kas süspansiyonunu tüpün duvarına doğru çıkarın. Küçük sindirilmemiş tendon veya kıkırdak parçaları, aspirasyonun ilk turlarında iğneyi tıkayabilir. Tıkanma meydana gelirse, tıkanıklığı iğnenin ucundan çıkarmak için steril forseps kullanın.
2. Her tüpü 50 mL'ye kadar WM ile doldurun ve karıştırmayı sağlamak için birkaç kez hafifçe ters çevirin.
3. Hücreleri, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de sallanan bir kova rotorunda santrifüj edin. Süpernatantı yeni bir tüpe (~ 42 mL) aktarın ve orijinal tüpte ~ 8 mL bırakın.
   1. 50 mL'ye kadar 42 mL süpernatant içeren yeni tüpü WM ile doldurun. hücreleri 4 ° C'de 8 dakika boyunca 350 x g'de sallanan bir kova rotorunda tekrar santrifüj edin. Tüm süpernatantı aspire edin ve peleti buz üzerinde tutun.
4. 8 mL WM içeren orijinal 50 mL konik tüpe 40 μm naylon hücre süzgeci yerleştirin ve hücre süzgecini 1-2 mL WM ile önceden ıslatın.
5. 40 μm naylon hücre süzgecini tutarken, peleti 5-10 kez nazikçe yeniden askıya almak için 10 mL'lik bir pipet kullanın. Hücre kaybını en aza indirmek için peletleri hücre süzgecinden tekrar aynı tüpe filtreleyin.
6. Bu adımda, buz üzerinde hücre peletleri olan ek tüpler olduğundan emin olun. Peletleri yeniden askıya almak ve çözeltiyi orijinal tüpte bulunan hücre süzgecine aktarmak için her tüpe 4-5 mL WM ekleyerek bu peletleri orijinal tüpe geri filtreleyin. Yerçekimi ile filtrelemeye izin verin.
7. Tüm peletleri orijinal 50 mL konik tüpe topladıktan sonra, hücre süzgecini başka bir 4-5 mL WM ile durulayın. hücre süzgecinin alt tarafındaki tüm sıvıyı toplamak için 1000 μL'lik bir pipet kullanın.
8. Her tüpü 50 mL'ye kadar WM ile doldurun ve karıştırmayı sağlamak için birkaç kez hafifçe ters çevirin.
9. Hücreleri, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de sallanan bir kova rotorunda santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra peleti rahatsız etmeden tüm süpernatantı derhal aspire edin.
10. Peleti 600 μL WM içinde yeniden askıya alın ve 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

5. Akış sitometrisi için antikor boyama

NOT: Her deney için aşağıdaki kontrolleri ayarlayın: i) lekesiz kontrol, ii) canlı hücre popülasyonu için seçilecek canlılık kontrolü, iii) florokrom emisyon yayılımını düzeltmek için tek lekeli kompanzasyon kontrolleri ve iv) floresan eksi bir (FMO) kontrolleri, yayılma yayılımını hesaba katarak geçit sınırlarını belirlemek. Boyama kontrollerinin tam listesi için Tablo 1'e bakın.

1. Lekesiz kontrol hazırlamak için, hücre süspansiyonunun 10 μL'sini, 190 μL WM içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. hücre süspansiyonunu yeniden askıya alın ve 35 μm hücre süzgeci kapağına sahip 5 mL'lik bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpten süzün. Süspansiyonun yerçekimine göre filtrelenmesine izin verin.
2. Hücre süzgecinin alt tarafındaki tüm sıvıyı toplamak için 200 μL'lik bir pipet kullanın. Bir kapakla kapatın ve ışıktan korunan buz üzerinde bırakın.
3. Canlılık, FMO ve tek lekeli kontroller hazırlayın: 10 adet 2 mL mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin ve her tüpe 190 μL WM ve 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Denetimlerin tam listesi için Tablo 1'e bakın. Deneysel kontrole bağlı olarak uygun tüpe antikorlar ekleyin. Antikor kombinasyonu ve konsantrasyonu hakkında bilgi için Tablo 1'e bakınız.
4. Hücre süspansiyonunun geri kalanını (500 μL) 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne (deneysel tüp) aktarın ve aşağıdaki antikorları ekleyin: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pasifik Mavisi, VCAM-1-biyotin ve α7-İntegrin-PE. Antikor kombinasyonu ve konsantrasyonu hakkında bilgi için Tablo 1'e bakınız.
5. Düzgün dağılım sağlamak için her tüpü yavaşça iyice karıştırın ve hücreleri ışıktan korunan 45 dakika boyunca 4 ° C'de dönen bir çalkalayıcıda inkübe edin.
6. 45 dakika sonra, 2 mL'ye kadar tüm mikrosantrifüj tüplerini WM ile doldurun. Tüpleri, 4 °C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de sabit açılı rotorlu soğutulmuş bir santrifüjde santrifüj yapın. Pelet'i rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin.
7. Tüm mikrosantrifüj tüplerindeki hücreleri 300 μL WM'de yeniden askıya alın.
8. Streptavidin antikorunu uygun tüplere ekleyin. Antikor kombinasyonu ve konsantrasyonu hakkında bilgi için Tablo 1'e bakınız. Düzgün dağılım sağlamak için her tüpü iyice karıştırın ve hücreleri ışıktan korunan 20 dakika boyunca 4 ° C'de dönen bir çalkalayıcıda inkübe edin. Kalan tüpleri ışıktan korunan buz üzerinde bırakın.
9. 20 dakika sonra, streptavidin antikoru içeren mikrosantrifüj tüplerini WM ile 2 mL'ye kadar doldurun. Tüpleri, 4 °C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de sabit açılı rotorlu soğutulmuş bir santrifüjde santrifüj yapın. Süpernatantı tamamen aspire edin ve 300 μL WM'deki hücreleri yeniden askıya alın.
10. 10 adet 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpün 35 μm hücre süzgeç kapağını 200 μL WM ile önceden ıslatın. Kontrol tüplerinden hücreleri uygun 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplerden filtreleyin. Hücre süzgecinin alt tarafındaki tüm sıvıyı toplamak için 200 μL'lik bir pipet kullanın. Kapaklarla kapatın, tüpleri buz üzerinde bırakın ve ışıktan koruyun.
11. Deney tüpündeki hücreleri, toplam 500 μL WM için ilave 200 μL WM ile yeniden askıya alın. 200 μL WM ile 5 mL'lik bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpün bir hücre süzgeci kapağını önceden ıslatın. Hücre süspansiyonunu deney tüpünden 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpe aktarın ve yerçekimi ile filtrelemesine izin verin.
12. Deneysel numune süspansiyonunu içeren 2 mL mikrosantrifüj tüpünü 300 μL WM ile durulayın ve aynı süzgeç kapağından geçirin. Hücre süzgecinin alt tarafındaki tüm sıvıyı toplamak için 200 μL'lik bir pipet kullanın. Bir kapakla kapatın, tüpleri buz üzerinde bırakın ve ışıktan koruyun.
    NOT: 35 μm hücre süzgeci kapağının tıkanması meydana gelirse, akışı kolaylaştırmak için tezgahtaki tüpe hafifçe dokunun.
13. FAP'lar ve MuSC'ler için toplama tüplerini hazırlayın ve etiketleyin. Hücreleri tüm arka ekstremite kaslarından izole ediyorsanız, hücreleri 5 mL'lik polipropilen yuvarlak tabanlı tüplerde, 2x serum ile desteklenmiş 1 mL'ye kadar FAP veya MuSC kültür ortamı ile sıralayın. Hücreleri TA kaslarından izole ediyorsanız, FAP'ları ve MuSC'leri, 2x serum ile desteklenmiş 400 μL'ye kadar kültür ortamı içeren 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde sıralayın.

6. Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS)

NOT: Bu protokol, 100 μm nozul ile donatılmış ve dokuz adede kadar farklı florokromu (ileri ve yan saçılma dahil 11 parametre) analiz etme kapasitesine sahip üç lazerli bir konfigürasyona (488 nm, 640 nm, 405 nm) sahip kompakt bir tezgah üstü araştırma akışı sitometresi kullanır. Bu protokolde kullanılan florokromlar ve bunlara bağlı dedektör bandpass filtreleri aşağıdaki gibidir: PE 586/42; PE-Cy7 783/56; APC 660/10; Pasifik Mavisi 448/45; 7-Aminoaktinomisin D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. Hücreler 4 ° C'de sıralanır ve sıralamayı takiben buz üzerinde kalır. Bu cihazı çalıştırmadan önce, kullanıcının bir teknik uygulama uzmanı tarafından uygun şekilde eğitildiğinden emin olun.

1. Kurulum ve performans, hücre sıralayıcıyı üreticinin spesifikasyonlarına göre kontrol edin.
2. FAP'ları ve MuSC'leri tanımlamak için hiyerarşik bir geçit stratejisi oluşturun (Şekil 2).
   1. FAT'leri aşağıdaki şemaya göre izole edin: i) hücreleri enkaz ile ayırmak için ileri hücre saçılma alanı ile yan hücre saçılma alanı (FSC-A'ya karşı SSC-A), ii) yan hücre saçılma yüksekliği ile yan hücre saçılma genişliği (SSC-H'ye karşı SSC-W), SSC aralığındaki çiftlerden teklileri ayırt etmek, iii) ileri hücre saçılma yüksekliği ile ileri hücre saçılma genişliği (FSC-H'ye karşı FSC-W), ve iv) Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için SSC-A'ya karşı 7-AAD alanı.
      1. FAP'ları antikor bazlı yöntemle izole ediyorsanız, aşağıdaki şemayı kullanın: v) CD31 + ve CD45 + hücrelerini daha fazla analizden dışlamak için APC-CD45 / CD31 alanı vs Pasifik Mavisi-Ly-6A / E (Sca1) alanı ve vi) PE-Cy7-VCAM-1 alanı vs PE-α7-Integrin alanı CD31-/CD45-/Sca1+ popülasyonundan FAP'ları ayırt etmek için. FAP'lar CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- olayları olarak tanımlanır.
      2. FAT'leri endojen GFP muhabir yöntemiyle izole ediyorsanız, aşağıdaki şemayı kullanın: v) CD31 + ve CD45 + hücrelerini daha fazla analizden dışlamak ve GFP + hücrelerini izole etmek için APC-CD45 / CD31 alanı vs GFP-PDGFRα alanı. FAP'lar CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- olayları olarak tanımlanır.
   2. MuSC'leri aşağıdaki şemaya göre izole edin: i) hücreleri enkaz karşısında ayırmak için ileri hücre saçılma alanı vs yan hücre saçılma alanı (FSC-A vs SSC-A), ii) yan hücre saçılma yüksekliği vs yan hücre saçılma genişliği (SSC-H vs SSC-W) SSC aralığındaki çiftlerden teklileri ayırt etmek, iii) ileri hücre saçılma yüksekliği vs ileri hücre saçılma genişliği (FSC-H vs FSC-W) FSC aralığındaki çiftlerden teklileri ayırt etmek, iv) Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için 7-AAD alanı vs SSC-A, v) CD31 + ve CD45+ hücrelerini daha ileri analizlerden dışlamak için APC-CD45 / CD31 alanı vs Pasifik Mavisi-Ly-6A / E (Sca1) alanı ve vi) MuSC'leri ayırt etmek için CD31-/CD45-/Sca1- popülasyonundan PE-Cy7-VCAM-1 alanı vs PE-α7-Integrin alanı. MuSC'ler CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ olayları olarak tanımlanır.
3. Hücre popülasyonunun SSC-A vs FSC-A grafiğinde düzgün bir şekilde konumlandırıldığından emin olmak ve canlı tek hücrelere düzgün bir şekilde geçiş yapmak için lekesiz kontrol ve canlılık kontrolünü çalıştırın.
4. Tüm tek lekeli kontrolleri edinin ve yayılma telafisi matrisini oluşturun.
5. Tüm FMO kontrollerini çalıştırın ve arka plan floresan yayılımı ile pozitif lekeli popülasyon arasındaki kesme noktasını belirleyin.
6. Deneysel numunenin alınmasından yaklaşık 5-10 dakika önce, 7-AAD canlılık boyası ekleyin ve yavaşça karıştırın.
7. Tüm kontroller işlendikten sonra, sıralama kapılarını FMO kontrollerine göre ayarlayın; deneysel örnekleri elde etmek ve sıralamak.
8. Tüm numuneler işlendikten sonra, sitometreyi üreticinin spesifikasyonuna göre temizleyin. Analiz için tüm .fcs verilerini dışarı aktarın.

7. FAP ve MuSC Kültürü

NOT: Sıralanmış hücreler, sıralamadan hemen sonra, kollajen I kaplı plakalar üzerinde uygun bir ortamda kültürlenmelidir.

1. Toplama borularını 250 x g'de sabit açılı bir rotorda 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
2. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin.
3. MuSC kültürü için, hücreleri uygun miktarda MuSC kültür ortamında yeniden askıya alın ve standart koşullarda 37 ° C ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
   1. 20.000 hücre^{/ cm2} yoğunluğunda taze izole edilmiş MuSC'ler ve 15.000 hücre /^cm2 yoğunluğunda aktive edilmiş MuSC'ler plaka.
   2. Kaplamadan sonra, hücreler küçük, küresel ve yarı saydam görünür. 36 saat içinde, MuSC'ler plakanın yüzeyine yapışır ve ilk 48 saat boyunca boyutlarını yavaşça arttırır.
   3. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
      NOT: MuSC'ler hücre yoğunluğuna karşı çok hassastır. MuSC'leri çoğalma durumlarında tutmak için,% 60 -% 70 oranında birleşene kadar onları büyütün. Hücreleri yeni kollajen I kaplı tabaklara veya tabaklara geçirin ve her 2 günde bir yeni taze ortam ekleyin. MuSC'ler aynı tabakta veya tabakta 3-4 günden daha uzun süre tutulursa, uzun bir form kazanırlar ve birbirine kaynaşana kadar komşu hücrelerle hizalanırlar.
4. FAP'ın kültürü için, hücreleri uygun miktarda MuSC kültür ortamında yeniden askıya alın ve standart koşullarda 37 ° C ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
   1. 15.000 hücre / cm2 yoğunluğunda bozulmamış kastan izole edilen FAP'lar ve 9.000 hücre /^cm2'de yaralı kastan izole edilen FAP'ları^plakalayın.
      NOT: Kaplamadan sonra, FAP'lar plakanın yüzeyine 48 saat içinde tamamen yapışırken, aktif FAC'lar plakaya birkaç saat içinde yapışır. Bağlandıktan sonra, FAP'lar küçük bir hücre gövdesi ve uzun hücre süreçleri ile karakteristik şekillerini kazanırlar ve hızla çoğalırlar.
   2. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
      NOT: FAP'lar hücre yoğunluğuna karşı çok hassastır. Düşük yoğunluklarda FAP'ların tohumlanması, zayıf hücre büyümesine ve hücre ölümüne neden olabilir. Aksine, FAP'ların yüksek tohumlama yoğunluğunda kaplanması, hücre sağkalımını artıracak ve genişlemelerini artıracaktır. Hasarlı kaslardan türeyen FAP'lar, zaten aktive oldukları için genellikle hasarsız kastan daha düşük hücre yoğunluğu gerektirir. FAP kaplama yoğunluğunun, kişinin deneysel koşullarına ve numunelerin kaynağına göre ayarlanması önerilir.
5. Kokültür için, FAP'ları ve MuSC'leri kokültür ortamında 1: 1 oranında yeniden askıya alın ve standart koşullarda olanları 37 ° C ve% 5 CO_2'de inkübe edin. Hücrelerin 48 saat boyunca bağlanmasına izin verin ve ortamı her 2 günde bir değiştirin.

8. Kültürlenmiş FAP'ların ve MuSC'lerin immünofloresan analizi

1. Hücre ortamını aspire edin ve 1x PBS ile iki veya üç yıkama yapın.
2. RT'de 15 dakika boyunca hücreleri 1x PBS'de% 2 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.
3. % 2 PFA'yı aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki veya üç kez hızlı bir şekilde yıkayın.
4. Hücre geçirgenliği ve blokajı gerçekleştirin:
   1. Yeni izole edilmiş FAP'ların immün boyaması için, RT'de 30 dakika boyunca 1x PBS +% 0.1 Triton X-100 (PBST) +% 1 sığır serum albümini (BSA) +% 5 Normal Eşek Serumu (NDS) ile hücreleri inkübe ederek hücre geçirgenliği ve blokajı gerçekleştirin.
   2. Yeni izole edilmiş MuSC'lerin immün boyaması için, RT'de 30 dakika boyunca PBST +% 1 BSA +% 5 Normal Keçi Serumu (NGS) ile hücreleri inkübe ederek hücre geçirgenliği ve blokajı gerçekleştirin.
5. Birincil antikorları uygulayın:
   1. Yeni izole edilmiş FAP'ların immünoboyaması için, 4 ° C'de gece boyunca PBST +% 1 BSA +% 5 NDS ile seyreltilmiş keçi anti PDGFRα primer antikoru (1:300) uygulayın.
   2. Yeni izole edilmiş MuSC'lerin immünoboyaması için, RT'de 45 dakika boyunca PBST + %1 BSA + %5 NGS ile seyreltilmiş fare anti Pax7 primer antikoru (1:10) uygulayın.
6. Birincil antikor çözeltisini çıkarmak için hücreleri 1x PBS ile iki veya üç kez yıkayın.
7. İkincil antikorlar uygulayın:
   1. Yeni izole edilmiş FAP'ların immünoboyaması için, RT'de 1 saat boyunca PBST +% 1 BSA'da seyreltilmiş eşek anti-keçi IgG (H + L) Alexa Fluor 488 sekonder antikoru (1:500) uygulayın.
   2. Yeni izole edilmiş MuSC'lerin immün boyaması için, RT'de 45 dakika boyunca PBST +% 1 BSA'da seyreltilmiş keçi anti-fare IgG 1 Alexa Fluor 555 sekonder antikoru (₁ :500) uygulayın.
8. Birincil antikor çözeltisini çıkarmak için hücreleri 1x PBS ile iki veya üç kez yıkayın.
9. RT'de 5 dakika boyunca PBST'de (1:1000) DAPI içeren hücreleri inkübe ederek nükleer karşı boyama gerçekleştirin.
10. DAPI çözeltisini çıkarmak için hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın.
    DİKKAT: DAPI toksik ve tehlikelidir; Dikkatli bir şekilde kullanın ve tehlikeli atık şişesine atın.
11. Hücreleri ışıktan korunan 4 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Bu protokol, yaklaşık bir milyon FAP'ın ve 350.000'e kadar MuSC'nin vahşi tip yetişkin farelerin (3-6 ay) yaralanmamış arka bacaklarından izole edilmesine izin verir, bu da FAP'lar için% 8'lik bir verime ve toplam olayların MuSC'leri için% 3'lük bir verime karşılık gelir. Yaralanmadan 7 gün sonra hasarlı TA'dan hücreleri ayırırken, sırasıyla% 11 ve% 4'lük bir verime karşılık gelen 300.000 FAP ve 120.000 MuSC'ye kadar elde etmek için iki ila üç TA kası toplanır. Sıralama sonrası saflık de...

Tartışmalar

Saf yetişkin kök hücre popülasyonlarının tanımlanması ve izolasyonu için etkili ve tekrarlanabilir protokollerin oluşturulması, işlevlerini anlamaya yönelik ilk ve en kritik adımdır. İzole FAP'lar ve MuSC'ler, kas hastalıkları için potansiyel bir tedavi olarak transplantasyon deneylerinde multiomik analiz yapmak için kullanılabilir veya kök hücre tedavisinde hastalık modellemesi için genetik olarak değiştirilebilir.

Burada açıklanan protokol, yetişkin farelerin a...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	Falcon	352235
20 G BD Needle 1 in. single use, sterile	BD Biosciences	305175
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)	The University of British Columbia	53-0010-01
APC anti-mouse CD31 Antibody	BioLegend	102510
APC anti-mouse CD45 Antibody	BioLegend	103112
BD FACSMelody Cell Sorter	BD Biosciences
BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL	BD Biosciences	309604
Biotin anti-mouse CD106 Antibody	BioLegend	105703
C57BL/6J  mouse (Female and Male)	The Jackson Laboratory	000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse	The Jackson Laboratory	007669
Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356400
Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356500
Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356408
DAPI Solution (1 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	62248
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile	VWR	414004-265
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11055
Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile	Corning	352340
Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile	Corning	353002
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL	VWR	352196
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL	Corning	352070
Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning	VWR	60819-728
Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning	VWR	21008-948
Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)	Promega	G5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, powder	ThermoFisher Scientific	17101015
Gibco Dispase, powder	ThermoFisher Scientific	17105041
Gibco DMEM, high glucose, HEPES	ThermoFisher Scientific	12430054
Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States	ThermoFisher Scientific	16000044
Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix	ThermoFisher Scientific	11550043
Gibco Horse Serum, New Zealand origin	ThermoFisher Scientific	16050122
Gibco PBS, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Gibco PBS (10x), pH 7.4	ThermoFisher Scientific	70011044
Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	ThermoFisher Scientific	10378016
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21127
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools Inc	14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)	ThermoFisher Scientific	A1310
Mouse PDGF R alpha Antibody	R&D Systems	AF1062
Normal Donkey Serum	Fisher Scientific	NC9624464
Normal Goat Serum	ThermoFisher Scientific	31872
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody	BioLegend	108120
Paraformaldehyde, 16%	Fisher Scientific	NCC0528893
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)	Developmental Study Hybridoma Bank	N/A
PE/Cyanine7 Streptavidin	BioLegend	405206
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools Inc	91500-09
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools Inc	91150-20
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787