FACS-aislamiento y cultivo de progenitores fibroadipogénicos y células madre musculares a partir de músculo esquelético de ratón imperturbable y lesionado

Resumen

La identificación precisa de las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) y las células madre musculares (MuSC) es fundamental para estudiar su función biológica en condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo proporciona pautas para el aislamiento, purificación y cultivo de FAP y MuSC de músculos de ratones adultos.

Resumen

Las células progenitoras fibro-adipogénicas (FAP) son una población de células estromales mesenquimales residentes en el músculo esquelético (MSC) capaces de diferenciarse a lo largo del linaje fibrogénico, adipogénico, osteogénico o condrogénico. Junto con las células madre musculares (MuSC), las FAP desempeñan un papel crítico en la homeostasis, reparación y regeneración muscular, al tiempo que mantienen y remodelan activamente la matriz extracelular (ECM). En condiciones patológicas, como daño crónico y distrofias musculares, los FAP experimentan una activación aberrante y se diferencian en fibroblastos y adipocitos productores de colágeno, lo que lleva a fibrosis e infiltración grasa intramuscular. Por lo tanto, los FAP desempeñan un doble papel en la regeneración muscular, ya sea manteniendo el recambio de MuSC y promoviendo la reparación de tejidos o contribuyendo a la formación de cicatrices fibróticas e infiltrados de grasa ectópica, que comprometen la integridad y la función del tejido muscular esquelético. Una purificación adecuada de FAPs y MuSCs es un requisito previo para comprender el papel biológico de estas células en condiciones fisiológicas y patológicas. Aquí, describimos un método estandarizado para el aislamiento simultáneo de FAP y MuSC de los músculos de las extremidades de ratones adultos utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). El protocolo describe en detalle la disociación mecánica y enzimática de células mononucleadas de músculos de extremidades enteras y músculos tibiales anteriores lesionados (TA). Los FAP y MuSC se aíslan posteriormente utilizando un clasificador celular semiautomático para obtener poblaciones celulares puras. Además, describimos un método optimizado para cultivar FAPs y MuSCs quiescentes y activados, ya sea solos o en condiciones de cocultivo.

Introducción

El músculo esquelético es el tejido más grande del cuerpo, representa ~ 40% del peso humano adulto, y es responsable de mantener la postura, generar movimiento, regular el metabolismo energético basal y la temperatura corporal¹. El músculo esquelético es un tejido altamente dinámico y posee una notable capacidad para adaptarse a una variedad de estímulos, como el estrés mecánico, las alteraciones metabólicas y los factores ambientales diarios. Además, el músculo esquelético se regenera en respuesta a una lesión aguda, lo que lleva a la restauración completa de su morfología y funciones². La plasticidad del músculo esquel....

Protocolo

Todos los experimentos con animales realizados se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (ACUC) del Instituto Nacional de Artritis, Musculoesquelético y Enfermedades de la Piel (NIAMS). Los investigadores que realizan este protocolo deben cumplir con sus pautas locales de ética animal.

NOTA: Este protocolo describe en detalle cómo aislar FAPs y MuSCs de las extremidades posteriores y los músculos lesionados del tibial anterior (TA) de ratones machos y hembras adultos (3-6 meses) y proporciona pautas para el cocultivo de FAPs y MuSCs. Una visión general del procedimiento expe....

Resultados

Este protocolo permite el aislamiento de aproximadamente un millón de FAPs y hasta 350.000 MuSCs de extremidades posteriores no lesionadas de ratones adultos de tipo salvaje (3-6 meses), lo que corresponde a un rendimiento del 8% para FAPs y 3% para MuSCs del total de eventos. Al clasificar las células de TA dañadas 7 días después de la lesión, se agrupan de dos a tres músculos TA para obtener hasta 300,000 FAP y 120,000 MuSC, que corresponden a un rendimiento del 11% y 4%, respectivamente. Los valores de pureza p.......

Discusión

El establecimiento de protocolos eficientes y reproducibles para la identificación y el aislamiento de poblaciones de células madre adultas puras es el primer y más crítico paso hacia la comprensión de su función. Los FAP y MuSC aislados se pueden usar para realizar análisis multiómicos en experimentos de trasplante como un tratamiento potencial para enfermedades musculares o pueden modificarse genéticamente para modelar enfermedades en la terapia con células madre.

El protocolo des.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	Falcon	352235
20 G BD Needle 1 in. single use, sterile	BD Biosciences	305175
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)	The University of British Columbia	53-0010-01
APC anti-mouse CD31 Antibody	BioLegend	102510
APC anti-mouse CD45 Antibody	BioLegend	103112
BD FACSMelody Cell Sorter	BD Biosciences
BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL	BD Biosciences	309604
Biotin anti-mouse CD106 Antibody	BioLegend	105703
C57BL/6J  mouse (Female and Male)	The Jackson Laboratory	000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse	The Jackson Laboratory	007669
Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356400
Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356500
Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356408
DAPI Solution (1 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	62248
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile	VWR	414004-265
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11055
Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile	Corning	352340
Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile	Corning	353002
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL	VWR	352196
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL	Corning	352070
Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning	VWR	60819-728
Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning	VWR	21008-948
Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)	Promega	G5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, powder	ThermoFisher Scientific	17101015
Gibco Dispase, powder	ThermoFisher Scientific	17105041
Gibco DMEM, high glucose, HEPES	ThermoFisher Scientific	12430054
Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States	ThermoFisher Scientific	16000044
Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix	ThermoFisher Scientific	11550043
Gibco Horse Serum, New Zealand origin	ThermoFisher Scientific	16050122
Gibco PBS, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Gibco PBS (10x), pH 7.4	ThermoFisher Scientific	70011044
Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	ThermoFisher Scientific	10378016
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21127
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools Inc	14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)	ThermoFisher Scientific	A1310
Mouse PDGF R alpha Antibody	R&D Systems	AF1062
Normal Donkey Serum	Fisher Scientific	NC9624464
Normal Goat Serum	ThermoFisher Scientific	31872
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody	BioLegend	108120
Paraformaldehyde, 16%	Fisher Scientific	NCC0528893
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)	Developmental Study Hybridoma Bank	N/A
PE/Cyanine7 Streptavidin	BioLegend	405206
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools Inc	91500-09
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools Inc	91150-20
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787