FACS-aislamiento y cultivo de progenitores fibroadipogénicos y células madre musculares a partir de músculo esquelético de ratón imperturbable y lesionado

Resumen

La identificación precisa de las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) y las células madre musculares (MuSC) es fundamental para estudiar su función biológica en condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo proporciona pautas para el aislamiento, purificación y cultivo de FAP y MuSC de músculos de ratones adultos.

Resumen

Las células progenitoras fibro-adipogénicas (FAP) son una población de células estromales mesenquimales residentes en el músculo esquelético (MSC) capaces de diferenciarse a lo largo del linaje fibrogénico, adipogénico, osteogénico o condrogénico. Junto con las células madre musculares (MuSC), las FAP desempeñan un papel crítico en la homeostasis, reparación y regeneración muscular, al tiempo que mantienen y remodelan activamente la matriz extracelular (ECM). En condiciones patológicas, como daño crónico y distrofias musculares, los FAP experimentan una activación aberrante y se diferencian en fibroblastos y adipocitos productores de colágeno, lo que lleva a fibrosis e infiltración grasa intramuscular. Por lo tanto, los FAP desempeñan un doble papel en la regeneración muscular, ya sea manteniendo el recambio de MuSC y promoviendo la reparación de tejidos o contribuyendo a la formación de cicatrices fibróticas e infiltrados de grasa ectópica, que comprometen la integridad y la función del tejido muscular esquelético. Una purificación adecuada de FAPs y MuSCs es un requisito previo para comprender el papel biológico de estas células en condiciones fisiológicas y patológicas. Aquí, describimos un método estandarizado para el aislamiento simultáneo de FAP y MuSC de los músculos de las extremidades de ratones adultos utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). El protocolo describe en detalle la disociación mecánica y enzimática de células mononucleadas de músculos de extremidades enteras y músculos tibiales anteriores lesionados (TA). Los FAP y MuSC se aíslan posteriormente utilizando un clasificador celular semiautomático para obtener poblaciones celulares puras. Además, describimos un método optimizado para cultivar FAPs y MuSCs quiescentes y activados, ya sea solos o en condiciones de cocultivo.

Introducción

El músculo esquelético es el tejido más grande del cuerpo, representa ~ 40% del peso humano adulto, y es responsable de mantener la postura, generar movimiento, regular el metabolismo energético basal y la temperatura corporal¹. El músculo esquelético es un tejido altamente dinámico y posee una notable capacidad para adaptarse a una variedad de estímulos, como el estrés mecánico, las alteraciones metabólicas y los factores ambientales diarios. Además, el músculo esquelético se regenera en respuesta a una lesión aguda, lo que lleva a la restauración completa de su morfología y funciones². La plasticidad del músculo esquelético se basa principalmente en una población de células madre musculares residentes (MuSC), también denominadas células satélite, que se encuentran entre la membrana plasmática de miofibras y la lámina basal ^2,3. En condiciones normales, los MuSC residen en el nicho muscular en estado quiescente, con sólo unas pocas divisiones para compensar la renovación celular y para reponer el conjunto de células madre⁴. En respuesta a la lesión, los MuSCs entran en el ciclo celular, proliferan y contribuyen a la formación de nuevas fibras musculares o regresan al nicho en un proceso de auto-renovación ^2,3. Además de los MuSCs, el mantenimiento homeostático y la regeneración del músculo esquelético dependen del apoyo de una población de células musculares residentes denominadas progenitores fibroadipogénicos (PAF)^5,6,7. Los FAP son células estromales mesenquimales incrustadas en el tejido conectivo muscular y capaces de diferenciarse a lo largo del linaje fibrogénico, adipogénico, osteogénico o condrogénico 5,8,9,10. Los FAP proporcionan soporte estructural para los MuSC, ya que son una fuente de proteínas de la matriz extracelular en el nicho de las células madre musculares. Las PAF también promueven el mantenimiento a largo plazo del músculo esquelético mediante la secreción de citoquinas y factores de crecimiento que proporcionan apoyo trófico para la miogénesis y el crecimiento muscular ^6,11. Tras la lesión muscular aguda, los FAPs proliferan rápidamente para producir un nicho transitorio que apoya la integridad estructural del músculo regenerador y proporciona un ambiente favorable para sostener la proliferación y diferenciación de MuSCs de manera paracrina⁵. A medida que avanza la regeneración, los FAP se eliminan del músculo regenerativo por apoptosis, y su número regresa gradualmente al nivel basal¹². Sin embargo, en condiciones que favorecen la lesión muscular crónica, los FAP anulan la señalización proapoptótica y se acumulan en el nicho muscular, donde se diferencian en fibroblastos y adipocitos productores de colágeno, lo que lleva a infiltrados de grasa ectópica y formación de cicatrices fibróticas^12,13.

Debido a su multipotencia y sus capacidades regenerativas, los FAP y MuSC han sido identificados como objetivos prospectivos en medicina regenerativa para el tratamiento de trastornos del músculo esquelético. Por lo tanto, para investigar su función y potencial terapéutico, es importante establecer protocolos eficientes y reproducibles para el aislamiento y cultivo de FAPs y MuSCs.

La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) puede identificar diferentes poblaciones celulares en función de características morfológicas como el tamaño y la granularidad, y permite el aislamiento específico de células basado en el uso de anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie celular. En ratones adultos, los MuSC expresan la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1, también conocida como CD106)14,15 y α7-Integrina 15, mientras que los FAP expresan el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas α (PDGFRα) y el antígeno de células madre 1 (Sca1 o Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . En el protocolo descrito aquí, los MuSC se identificaron como CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, mientras que los FAP se identificaron como CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativamente, se emplearon ratones PDGFRαEGFP para aislar FAPs como eventos CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-^18,19. Además, comparamos la superposición entre la señal fluorescente de las células PDGFRα-GFP+ con las células identificadas por el marcador de superficie Sca1. Nuestro análisis mostró que todas las células que expresan GFP también fueron positivas para Sca1, lo que indica que cualquiera de los enfoques puede emplearse para la identificación y aislamiento de FAPs. Finalmente, la tinción con anticuerpos marcadores específicos confirmó la pureza de cada población celular.

Protocolo

Todos los experimentos con animales realizados se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (ACUC) del Instituto Nacional de Artritis, Musculoesquelético y Enfermedades de la Piel (NIAMS). Los investigadores que realizan este protocolo deben cumplir con sus pautas locales de ética animal.

NOTA: Este protocolo describe en detalle cómo aislar FAPs y MuSCs de las extremidades posteriores y los músculos lesionados del tibial anterior (TA) de ratones machos y hembras adultos (3-6 meses) y proporciona pautas para el cocultivo de FAPs y MuSCs. Una visión general del procedimiento experimental se muestra en la Figura 1. Todos los pasos de este protocolo deben realizarse en condiciones estériles y a temperatura ambiente (RT) a menos que se especifique lo contrario.

1. Configuración del reactivo

1. Medio de lavado (WM): Prepare esta solución agregando 10% (vol / vol) de suero de caballo y 1x penicilina / estreptomicina al medio celular F-10 Nutrient Mix de Ham. WM puede prepararse de antemano y almacenarse a 4 °C.
2. Tampón de disociación muscular (MDB): Prepare este tampón disolviendo la colagenasa II en WM. Si recolecta músculos enteros de las extremidades posteriores, disuelva 1000 U/ml de colagenasa II en 10 ml de WM para cada ratón (para preparar en un tubo cónico de 50 ml). Si se recogen los músculos TA, disolver 800 U/ml de colagenasa II en 7 ml de WM para cada ratón (para preparar en un tubo cónico de 15 ml). Para los músculos TA, esto ayudará a visualizar mejor los gránulos celulares y obtener un mayor rendimiento de FAPs y MuSCs. Prepare MDB fresco antes de recoger los músculos y manténgalo en hielo hasta que sea necesario.
3. Cepas de solución de colagenasa II: Prepare esta solución disolviendo colagenasa II en solución salina estéril 1x tamponada con fosfato (PBS) hasta una concentración final de 1000 U/mL. Filtrar la solución a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm y alícuota en cepos de 1 ml. Conservar la solución a -20 °C.
4. Cepa de solución de Dispasa: prepare esta solución disolviendo Dispasa en 1x PBS estéril hasta una concentración final de 11 U/mL. Filtrar la solución a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm y alícuota en cepos de 1 ml. Conservar la solución a -20 °C.
5. Preparar el medio de cultivo de FAP complementando DMEM con suero fetal bovino al 10% (vol/vol), 1x penicilina/estreptomicina y 2,5 ng/ml FGF. Conservar el medio a 4 °C.
6. Preparar el medio de cultivo de MuSC que complementa F10 con suero de caballo al 10% (vol/vol), 1x penicilina/estreptomicina y 2,5 ng/ml de FGF. Conservar el medio a 4 °C.
7. Preparar el medio de cocultivo complementando DMEM con suero fetal bovino al 10% (vol/vol), suero de caballo al 10% (vol/vol), 1x penicilina/estreptomicina y 2,5 ng/ml de FGF. Conservar el medio a 4 °C.

2. Recolección de músculo de las extremidades posteriores

1. Añadir 2-3 ml de WM en un plato de 6 cm (un plato por ratón) y colocarlo en hielo.
2. Realizar la eutanasia por asfixia: colocar al ratón en una cámara de_CO2 e introducir 100% de CO₂. Use la luxación cervical para confirmar la muerte.
3. Coloque el ratón en decúbito supino en una almohadilla de disección y rocíelo con etanol al 70% (vol / vol) para evitar la contaminación.
4. Use fórceps para pellizcar el centro de la piel del vientre del ratón y corte una abertura de ~ 1 cm horizontalmente. Agarre los bordes de la herida y el escritorio en el ratón tirando de la abertura en direcciones opuestas para descubrir los músculos debajo. Exponga un lado de la extremidad posterior del ratón a la vez.
5. Antes de recolectar músculos, elimine la grasa intermuscular entre los isquiotibiales y el extremo proximal de los cuádriceps. Esto mejorará el aislamiento de los FAP y MuSC.
6. Sin dañar el tejido, use pinzas afiladas para romper y despegar la fascia para exponer los músculos debajo de TA y extensor largo de los dedos (EDL). Pase la punta afilada de los fórceps debajo de los músculos TA/EDL para separar los músculos de la tibia.
7. Corte los tendones que unen el TA / EDL al tobillo y, mientras lo sostiene con fórceps, recorte los músculos con tijeras a lo largo de la línea longitudinal del TA / EDL. Corte los tendones alrededor de la rodilla para separar todos los músculos TA/EDL. Coloque los músculos en un plato de 6 cm mantenido en hielo.
8. Proceda a aislar los músculos gastrocnemio y sóleo cortando todos los tendones en el tobillo y separando los músculos de la tibia y el peroné. Corte alrededor de la rodilla y transfiera los músculos al plato de 6 cm.
9. Despegue la fascia alrededor del cuádriceps y sepárela del fémur pasando la punta afilada de los fórceps entre el músculo y el hueso. Corte los tendones alrededor de la rodilla y, mientras sostiene los cuádriceps con fórceps en el extremo distal, recorte el resto del músculo cortando a lo largo del fémur. Coloque los músculos en el plato de 6 cm.
10. Separe los isquiotibiales y los músculos restantes alrededor del fémur y transfiéralos al plato de 6 cm. Reúna los músculos de las extremidades posteriores en un plato de 6 cm mantenido en hielo.
    NOTA: Evite dañar los vasos sanguíneos, cuando sea posible, para evitar la formación de grupos sanguíneos que podrían interferir con el aislamiento aguas abajo. Si se produce sangrado, seque el vaso extirpado inmediatamente con una gasa estéril para absorber la sangre.
11. Recolectar TA, EDL, gastrocnemio, sóleo, cuádriceps y músculos isquiotibiales de la extremidad contralateral.
    NOTA: Al aislar todos los músculos de las extremidades posteriores, no agrupe dos o más ratones. Si se aíslan los músculos TA, se pueden agrupar hasta tres músculos TA.

3. Digestión muscular mecánica y enzimática

1. Aspire WM del plato de 6 cm y agregue 1-2 ml de MDB para mantener los músculos húmedos.
2. Picar los músculos a fondo hasta obtener una pasta de purín de tejido bien picado. Para hacerlo, use fórceps para sostener un extremo de un pedazo de músculo, luego use un bisturí para rasgar y cortar el músculo hasta que esté menos apretado.
3. Usando tijeras, siga cortando el músculo en trozos pequeños durante 1-2 minutos. Repita este paso para cada grupo de músculos hasta obtener un lodo muscular bien picado.
   NOTA: Este es un paso muy crítico para maximizar el rendimiento de los FAP y MuSC. Se recomienda pasar 8-10 minutos (4-5 minutos si solo se aíslan los músculos TA) en este paso para garantizar una picada muscular adecuada.
4. Transfiera los músculos picados de cada ratón al tubo cónico que contiene MDB.
5. Sellar los tubos con film de laboratorio e incubar en un baño maría a 37 °C con agitación (75 rpm) durante 1 h. Coloque los tubos horizontalmente a lo largo del camino de agitación y use pesas para mantener los tubos sumergidos en agua.
6. Descongele 1 ml de cepas de colagenasa II y 1 ml de cepas de dispasas por ratón. Antes de su uso, gire la culata de dispasa en un rotor de cucharón oscilante a 10.000 x g durante 1 min a 4 °C. Use solo el sobrenadante.
7. Si se recolectaron músculos enteros de las extremidades posteriores, proceda de la siguiente manera:
   1. Después de 1 h, retire el tubo del agitador y llénelo a 50 ml con WM. Invierta suavemente un par de veces para asegurar la mezcla.
   2. Centrifugar las células en un rotor de cangilón oscilante a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Transfiera 42 ml de sobrenadante en dos tubos nuevos (~21 ml en cada tubo) y deje ~8 ml en el tubo original.
      1. Llene los nuevos tubos que contienen 21 ml del sobrenadante hasta 50 ml con WM. Centrifugar las células de nuevo en un rotor de cangilón oscilante a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Aspirar todo el sobrenadante y mantener los gránulos en hielo.
   3. Agregue 1 ml de cepas de colagenasa II y 1 ml de stock de dispasas en el tubo original que contiene ~ 8 ml de MDB.
   4. Con una pipeta serológica de 5 ml, resuspender el pellet 10 veces sin obstruirlo. Expulse la solución hacia la pared del tubo, evitando la formación de burbujas. Si se produce una obstrucción durante la resuspensión, empuje la punta de la pipeta contra la parte inferior del tubo para interrumpir mecánicamente los trozos musculares. Continúe con el paso 3.9.
8. Si se recolectaron músculos TA, proceda de la siguiente manera:
   1. Después de 1 h, retire el tubo del agitador y llénelos a 15 ml con WM. Invierta suavemente un par de veces para asegurar la mezcla.
   2. Centrifugar las células en un rotor de cangilón oscilante a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Transfiera 13 ml de sobrenadante a un nuevo tubo de 15 ml y deje ~ 2 ml en el tubo original.
      1. Llene el nuevo tubo que contiene 13 ml del sobrenadante hasta 15 ml con WM. Centrifugar las células de nuevo en un rotor de cangilón oscilante a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Aspirar todo el sobrenadante y mantener el pellet en hielo.
   3. Con una punta de pipeta de 1000 μL, vuelva a suspender el pellet en el tubo original hacia arriba y hacia abajo sin obstruirlo.
   4. Añadir 1 ml de cepa de colagenasa II y 1 ml de material de dispasas en el tubo original que contiene 2 ml de MDB y llenar hasta 10 ml con WM. Continúe con el paso 3.9.
9. Sellar los tubos con film de laboratorio e incubar en un baño maría a 37 °C con agitación (75 rpm) durante 30 min. Coloque los tubos como en el paso 3.5.

4. Generación de células mononucleadas

NOTA: Si trabaja con músculos TA recogidos en un tubo cónico de 15 ml, transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 ml antes de continuar con el paso 4.1.

1. Después de 30 minutos, retire el tubo de la coctelera. Aspirar y expulsar la suspensión muscular a través de una jeringa de 10 ml con una aguja de 20 G con éxito 10 veces.
   NOTA: Expulse la suspensión muscular hacia la pared del tubo para evitar burbujas y espuma. Pequeños trozos de tendones o cartílagos no digeridos pueden obstruir la aguja durante las primeras rondas de aspiración. Si se produce una obstrucción, use fórceps estériles para extraer la obstrucción de la punta de la aguja.
2. Llene cada tubo hasta 50 ml con WM e invierta suavemente un par de veces para asegurar la mezcla.
3. Centrifugar las células en un rotor de cangilón oscilante a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo (~42 ml) y deje ~8 ml en el tubo original.
   1. Llene el nuevo tubo que contiene 42 ml del sobrenadante hasta 50 ml con WM. Centrifugar las células de nuevo en un rotor de cangilón oscilante a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Aspirar todo el sobrenadante y mantener el pellet en hielo.
4. Coloque un filtro de células de nylon de 40 μm en el tubo cónico original de 50 ml que contiene 8 ml de WM y humedezca previamente el filtro celular con 1-2 ml de WM.
5. Mientras sostiene el colador de células de nylon de 40 μm, use una pipeta de 10 ml para resuspender suavemente el pellet 5-10 veces. Filtre los gránulos a través del filtro celular de nuevo en el mismo tubo para minimizar la pérdida de células.
6. En este paso, asegúrese de que haya tubos adicionales con pellets de células en hielo. Filtre esos gránulos de nuevo en el tubo original agregando 4-5 ml de WM a cada tubo para resuspender los gránulos y transferir la solución al filtro celular colocado en el tubo original. Permitir filtrar por gravedad.
7. Después de recoger todos los gránulos en el tubo cónico original de 50 ml, enjuague el colador celular con otros 4-5 ml de WM. Utilice una pipeta de 1000 μL para recoger todo el líquido de la parte inferior del filtro celular.
8. Llene cada tubo con WM hasta 50 ml e invierta suavemente un par de veces para asegurar la mezcla.
9. Centrifugar las células en un rotor de cangilón oscilante a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar inmediatamente todo el sobrenadante después de la centrifugación sin alterar el pellet.
10. Resuspender el pellet en 600 μL de WM y transferirlo a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.

5. Tinción de anticuerpos para citometría de flujo

NOTA: Para cada experimento, configure los siguientes controles: i) control sin teñir, ii) control de viabilidad para seleccionar para la población de células vivas, iii) controles de compensación de tinción única para corregir el derrame de emisiones de fluorocromo, y iv) controles de fluorescencia menos uno (FMO) para establecer límites de compuerta teniendo en cuenta la propagación del derrame. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista completa de los controles de tinción.

1. Para preparar el control no teñido, transfiera 10 μL de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga 190 μL de WM. Resuspenda la suspensión celular y filtre a través de un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml con una tapa de filtro celular de 35 μm. Permita que la suspensión se filtre por gravedad.
2. Utilice una pipeta de 200 μL para recoger todo el líquido de la parte inferior del filtro celular. Sellar con una tapa y dejarlo en hielo, protegido de la luz.
3. Preparar controles de viabilidad, FMO y teñidos individuales: etiquete 10 tubos de microcentrífuga de 2 ml y agregue 190 μL de WM en cada tubo y 10 μL de suspensión celular. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista completa de los controles. Añadir anticuerpos al tubo apropiado dependiendo del control experimental. Consulte la Tabla 1 para obtener información sobre la combinación y concentración de anticuerpos.
4. Transfiera el resto de la suspensión celular (500 μL) a un tubo de microcentrífuga de 2 ml (tubo experimental) y agregue los siguientes anticuerpos: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pacific Blue, VCAM-1-biotina y α7-Integrin-PE. Consulte la Tabla 1 para obtener información sobre la combinación y concentración de anticuerpos.
5. Mezclar suavemente bien cada tubo para asegurar una distribución uniforme e incubar las células en un agitador giratorio a 4 °C durante 45 min protegido de la luz.
6. Después de 45 minutos, llene todos los tubos de microcentrífuga hasta 2 ml con WM. Invierta suavemente los tubos un par de veces para asegurar una mezcla completa. Centrifugar los tubos en una centrífuga refrigerada con un rotor de ángulo fijo a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin alterar la bolita.
7. Resuspender las células en todos los tubos de microcentrífuga en 300 μL de WM.
8. Agregue el anticuerpo de estreptavidina en los tubos apropiados. Consulte la Tabla 1 para obtener información sobre la combinación y concentración de anticuerpos. Mezclar suavemente bien cada tubo para asegurar una distribución uniforme e incubar las células en un agitador giratorio a 4 °C durante 20 min protegido de la luz. Deje los tubos restantes en hielo, protegidos de la luz.
9. Después de 20 minutos, llene los tubos de microcentrífuga que contienen anticuerpos contra la estreptavidina hasta 2 ml con WM. Invierta suavemente los tubos varias veces para asegurar una mezcla completa. Centrifugar los tubos en una centrífuga refrigerada con un rotor de ángulo fijo a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar completamente el sobrenadante y resuspender las células en 300 μL de WM.
10. Prehumedezca el capuchón del filtro de células de 35 μm de 10 tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 ml con 200 μL de WM. Filtre las células de los tubos de control a través de los tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 ml apropiados. Utilice una pipeta de 200 μL para recoger todo el líquido de la parte inferior del filtro celular. Selle con tapas, deje los tubos en hielo y protéjalos de la luz.
11. Resuspender las células en el tubo experimental con 200 μL adicionales de WM para un total de 500 μL de WM. Prehumedezca una tapa de filtro celular de un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml con 200 μL de WM. Transfiera la suspensión celular del tubo experimental al tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml y permita que se filtre por gravedad.
12. Enjuague el tubo de microcentrífuga de 2 ml que contiene la suspensión de la muestra experimental con 300 μL de WM y páselo a través del mismo tapón filtrante. Utilice una pipeta de 200 μL para recoger todo el líquido de la parte inferior del filtro celular. Selle con una tapa, deje los tubos en hielo y protéjalos de la luz.
    NOTA: Si se produce una obstrucción de la tapa del filtro celular de 35 μm, golpee suavemente el tubo en el banco para facilitar el flujo.
13. Prepare y etiquete los tubos de recolección para FAP y MuSC. Si aísla células de músculos enteros de las extremidades posteriores, clasifique las células en tubos de fondo redondo de polipropileno de 5 ml con hasta 1 ml de medio de cultivo FAP o MuSC suplementado con suero 2x. Si aísla células de los músculos TA, clasifique los FAP y MuSC en tubos de microcentrífuga de 2 ml que contengan hasta 400 μL de medio de cultivo suplementado con suero 2x.

6. Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)

NOTA: Este protocolo emplea un citómetro de flujo de investigación compacto de sobremesa equipado con una boquilla de 100 μm y con una configuración de tres láseres (488 nm, 640 nm, 405 nm) con la capacidad de analizar hasta nueve fluorocromos diferentes (11 parámetros, incluida la dispersión hacia adelante y hacia el lado). Los fluorocromos utilizados en este protocolo y sus filtros de paso de banda de detector asociados son los siguientes: PE 586/42; PE-Cy7 783/56; APC 660/10; Pacific Blue 448/45; 7-Aminoactinomicina D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. Las células se clasifican a 4 °C y permanecen en hielo después de la clasificación. Antes de operar este instrumento, asegúrese de que el usuario esté debidamente capacitado por un especialista en aplicaciones técnicas.

1. Configure y verifique el rendimiento del clasificador de celdas de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
2. Establezca una estrategia jerárquica de acceso para identificar FAP y MuSC (Figura 2).
   1. Aislar los FAP en función del siguiente esquema: i) área de dispersión de celda directa vs área de dispersión de celda lateral (FSC-A vs. SSC-A) para separar celdas versus desechos, ii) altura de dispersión de celda lateral vs ancho de dispersión de celda lateral (SSC-H vs. SSC-W) para discriminar singletes de dobletes en el rango SSC, iii) altura de dispersión de celda directa vs ancho de dispersión de celda directa (FSC-H vs. FSC-W) para discriminar singletes de dobletes en el rango FSC, y iv) área 7-AAD vs SSC-A para distinguir células vivas de células muertas.
      1. Si aísla FAPs a través del método basado en anticuerpos, use el siguiente esquema: v) área APC-CD45/CD31 vs área Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) para excluir las células CD31+ y CD45+ de análisis adicionales, y vi) área PE-Cy7-VCAM-1 vs área PE-α7-Integrina de la población CD31-/CD45-/Sca1+ para distinguir FAPs. Los FAP se identifican como eventos CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-.
      2. Si aísla FAP a través del método informador endógeno de GFP, use el siguiente esquema: v) área APC-CD45/CD31 vs área GFP-PDGFRα para excluir las células CD31+ y CD45+ del análisis adicional y aislar las células GFP+. Los FAP se identifican como eventos CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-.
   2. Aislar MuSC en función del siguiente esquema: i) área de dispersión de celda directa vs área de dispersión de celda lateral (FSC-A vs. SSC-A) para separar celdas versus desechos, ii) altura de dispersión de celda lateral vs ancho de dispersión de celda lateral (SSC-H vs. SSC-W) para discriminar singletes de dobletes en el rango SSC, iii) altura de dispersión de celda directa vs ancho de dispersión de celda directa (FSC-H vs. FSC-W) para discriminar singletes de dobletes en el rango FSC, iv) área 7-AAD vs SSC-A para distinguir células vivas vs muertas, v) área APC-CD45/CD31 vs área Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) para excluir células CD31+ y CD45+ de análisis adicionales, y vi) área PE-Cy7-VCAM-1 vs área PE-α7-Integrina de la población CD31-/CD45-/Sca1- para distinguir MuSCs. Los MuSC se identifican como eventos CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+.
3. Ejecute el control no teñido y el control de viabilidad para garantizar que la población celular esté correctamente posicionada en la gráfica SSC-A vs FSC-A y para bloquear correctamente las celdas individuales vivas.
4. Adquiera todos los controles de una sola mancha y genere la matriz de compensación de derrame.
5. Ejecute todos los controles FMO y determine el punto de corte entre la propagación de fluorescencia de fondo y la población teñida positivamente.
6. Aproximadamente 5-10 minutos antes de la adquisición de la muestra experimental, agregue el colorante de viabilidad 7-AAD y mezcle suavemente.
7. Una vez que se hayan procesado todos los controles, establezca las puertas de ordenación de acuerdo con los controles FMO; Adquirir y clasificar las muestras experimentales.
8. Después de que se hayan procesado todas las muestras, limpie el citómetro de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Exporte todos los datos .fcs para su análisis.

7. Cultura de FAPs y MuSCs

NOTA: Las células clasificadas deben cultivarse inmediatamente después de la clasificación, en un medio apropiado sobre placas recubiertas de colágeno I.

1. Centrifugar los tubos colectores en un rotor de ángulo fijo a 250 x g durante 5 min a 4 °C.
2. Aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet celular.
3. Para el cultivo de MuSC, resuspender las células en un volumen apropiado de medio de cultivo MuSC e incubarlas en condiciones estándar a 37 °C y 5% de_CO2.
   1. Placa MuSCs recién aislados a una densidad de 20.000 células/cm2 y MuSCs activados a una densidad de 15.000 células/^cm2.
   2. Después del recubrimiento, las células aparecen pequeñas, esféricas y translúcidas. Dentro de las 36 h, los MuSC se adhieren a la superficie de la placa y aumentan lentamente su tamaño durante las primeras 48 h.
   3. Reemplace el medio cada 2 días.
      NOTA: Los MuSC son muy sensibles a la densidad celular. Para mantener los MuSC en su estado de proliferación, hágalos crecer hasta que sean 60% -70% confluentes. Pasar las células a nuevos platos o platos recubiertos de colágeno y agregar nuevo medio fresco cada 2 días. Si los MuSC se mantienen en el mismo plato o plato durante más de 3-4 días, adquirirán una forma alargada y se alinearán con las células vecinas hasta que se fusionen.
4. Para el cultivo de FAP, resuspender las células en un volumen apropiado de medio de cultivo MuSC e incubarlas en condiciones estándar a 37 °C y 5% de_CO2.
   1. Placa de los FAPs aislados del músculo imperturbable a una densidad de 15.000 células/cm2 y FAPs aislados del músculo lesionado a 9.000 células/^cm2.
      NOTA: Después del recubrimiento, los FAP se adhieren completamente a la superficie de la placa dentro de las 48 horas, mientras que los FAP activados se adhieren a la placa en unas pocas horas. Una vez que se unen, los FAP adquieren su forma característica, con un cuerpo celular pequeño y procesos celulares alargados, y proliferan rápidamente.
   2. Reemplace el medio cada 2 días.
      NOTA: Los FAP son muy sensibles a la densidad celular. La siembra de FAP a bajas densidades puede conducir a un crecimiento celular deficiente y a la muerte celular. Por el contrario, el recubrimiento de FAP a alta densidad de siembra aumentará la supervivencia celular y mejorará su expansión. Los FAP derivados del músculo dañado generalmente requieren una densidad celular más baja que el músculo no dañado, ya que ya están activados. Se recomienda ajustar la densidad del revestimiento FAP en función de las condiciones experimentales y de la fuente de las muestras.
5. Para el cocultivo, resuspender FAPs y MuSCs en el medio de cocultivo en una proporción de 1:1 e incubarlos en condiciones estándar a 37 °C y 5% de_CO2. Deje que las células se adhieran durante 48 h y reemplace el medio cada 2 días.

8. Análisis de inmunofluorescencia de FAPs y MuSCs cultivados

1. Aspirar el medio celular y realizar dos o tres lavados con 1x PBS.
2. Fijar las células con paraformaldehído al 2% (PFA) en 1x PBS durante 15 min en RT.
3. Aspire PFA al 2% y lave rápidamente las células dos o tres veces con 1x PBS.
4. Realizar permeabilización y bloqueo celular:
   1. Para la inmunotinción de FAP recién aislados, realice la permeabilización celular y el bloqueo mediante la incubación de células con 1x PBS + 0.1% Triton X-100 (PBST) + 1% de albúmina sérica bovina (BSA) + 5% de suero de burro normal (NDS) durante 30 min en RT.
   2. Para la inmunotinción de MuSC recién aislados, realice la permeabilización celular y el bloqueo mediante la incubación de células con PBST + 1% BSA + 5% de suero normal de cabra (NGS) durante 30 min a RT.
5. Aplicar anticuerpos primarios:
   1. Para la inmunotinción de FAP recién aislados, aplique anticuerpo primario anti PDGFRα de cabra (1:300) diluido en PBST + 1% BSA + 5% NDS durante la noche a 4 °C.
   2. Para la inmunotinción de MuSCs recién aislados, aplicar anticuerpo primario anti Pax7 de ratón (1:10) diluido en PBST + 1% BSA + 5% NGS durante 45 min en RT.
6. Lave las células dos o tres veces con 1x PBS para eliminar la solución de anticuerpos primarios.
7. Aplicar anticuerpos secundarios:
   1. Para la inmunotinción de FAP recién aislados, aplique anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 anti-cabra IgG (H+L) de burro (1:500) diluido en PBST + 1% BSA durante 1 h en RT.
   2. Para la inmunotinción de MuSC recién aislados, aplique el anticuerpo secundario IgG 1 Alexa Fluor 555 de cabra (1:500) diluido en PBST +₁ % BSA durante 45 min a RT.
8. Lave las células dos o tres veces con 1x PBS para eliminar la solución de anticuerpos primarios.
9. Realizar contratinción nuclear incubando células con DAPI en PBST (1:1000) durante 5 min en RT.
10. Lave las células tres veces con 1x PBS para eliminar la solución DAPI.
    PRECAUCIÓN: DAPI es tóxico y peligroso; Manéjelo con cuidado y deséchelo en la botella de residuos peligrosos.
11. Conservar las celdas a 4 °C protegidas de la luz.

Resultados

Este protocolo permite el aislamiento de aproximadamente un millón de FAPs y hasta 350.000 MuSCs de extremidades posteriores no lesionadas de ratones adultos de tipo salvaje (3-6 meses), lo que corresponde a un rendimiento del 8% para FAPs y 3% para MuSCs del total de eventos. Al clasificar las células de TA dañadas 7 días después de la lesión, se agrupan de dos a tres músculos TA para obtener hasta 300,000 FAP y 120,000 MuSC, que corresponden a un rendimiento del 11% y 4%, respectivamente. Los valores de pureza p...

Discusión

El establecimiento de protocolos eficientes y reproducibles para la identificación y el aislamiento de poblaciones de células madre adultas puras es el primer y más crítico paso hacia la comprensión de su función. Los FAP y MuSC aislados se pueden usar para realizar análisis multiómicos en experimentos de trasplante como un tratamiento potencial para enfermedades musculares o pueden modificarse genéticamente para modelar enfermedades en la terapia con células madre.

El protocolo des...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	Falcon	352235
20 G BD Needle 1 in. single use, sterile	BD Biosciences	305175
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)	The University of British Columbia	53-0010-01
APC anti-mouse CD31 Antibody	BioLegend	102510
APC anti-mouse CD45 Antibody	BioLegend	103112
BD FACSMelody Cell Sorter	BD Biosciences
BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL	BD Biosciences	309604
Biotin anti-mouse CD106 Antibody	BioLegend	105703
C57BL/6J  mouse (Female and Male)	The Jackson Laboratory	000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse	The Jackson Laboratory	007669
Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356400
Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356500
Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356408
DAPI Solution (1 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	62248
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile	VWR	414004-265
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11055
Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile	Corning	352340
Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile	Corning	353002
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL	VWR	352196
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL	Corning	352070
Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning	VWR	60819-728
Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning	VWR	21008-948
Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)	Promega	G5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, powder	ThermoFisher Scientific	17101015
Gibco Dispase, powder	ThermoFisher Scientific	17105041
Gibco DMEM, high glucose, HEPES	ThermoFisher Scientific	12430054
Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States	ThermoFisher Scientific	16000044
Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix	ThermoFisher Scientific	11550043
Gibco Horse Serum, New Zealand origin	ThermoFisher Scientific	16050122
Gibco PBS, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Gibco PBS (10x), pH 7.4	ThermoFisher Scientific	70011044
Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	ThermoFisher Scientific	10378016
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21127
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools Inc	14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)	ThermoFisher Scientific	A1310
Mouse PDGF R alpha Antibody	R&D Systems	AF1062
Normal Donkey Serum	Fisher Scientific	NC9624464
Normal Goat Serum	ThermoFisher Scientific	31872
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody	BioLegend	108120
Paraformaldehyde, 16%	Fisher Scientific	NCC0528893
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)	Developmental Study Hybridoma Bank	N/A
PE/Cyanine7 Streptavidin	BioLegend	405206
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools Inc	91500-09
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools Inc	91150-20
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787