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요약

섬유-지방형성 전구세포(FAP)와 근육 줄기세포(MuSC)의 정확한 식별은 생리학적 및 병리학적 조건에서 생물학적 기능을 연구하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스 근육에서 FAP 및 MuSC의 분리, 정제 및 배양에 대한 지침을 제공합니다.

초록

섬유-지방형성 전구 세포(FAP)는 섬유원성, 지방형성성, 골인성 또는 연골성 계통을 따라 분화할 수 있는 골격근에 거주하는 중간엽 기질 세포(MSC)의 집단입니다. 근육 줄기 세포(MuSC)와 함께 FAP는 근육 항상성, 복구 및 재생에 중요한 역할을 하는 동시에 세포외 기질(ECM)을 적극적으로 유지 및 리모델링합니다. 만성 손상 및 근이영양증과 같은 병리학적 상태에서, FAP는 비정상적인 활성화를 거쳐 콜라겐-생성 섬유아세포 및 지방세포로 분화하여, 섬유증 및 근육내 지방 침윤을 유도한다. 따라서, FAP는 MuSC 회전율을 유지하고 조직 복구를 촉진하거나 골격근 조직의 완전성 및 기능을 손상시키는 섬유성 흉터 형성 및 이소성 지방 침윤에 기여함으로써 근육 재생에서 이중 역할을 한다. FAP 및 MuSC의 적절한 정제는 병리학적 조건뿐만 아니라 생리학적 조건에서 이들 세포의 생물학적 역할을 이해하기 위한 전제 조건이다. 여기에서는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 성인 마우스의 사지 근육으로부터 FAP 및 MuSC를 동시에 분리하기위한 표준화 된 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전체 사지 근육 및 손상된 경골 전방 (TA) 근육에서 단핵 세포의 기계적 및 효소 적 해리를 자세히 설명합니다. FAP 및 MuSC는 순수 세포 집단을 얻기 위해 반자동 세포 분류기를 사용하여 연속적으로 분리됩니다. 또한 대기 및 활성화된 FAP 및 MuSC를 단독으로 또는 공동 배양 조건에서 배양하기 위한 최적화된 방법을 설명합니다.

서문

골격근은 성인 체중의 ~40%를 차지하는 신체에서 가장 큰 조직으로 자세 유지, 움직임 생성, 기초 에너지 대사 조절 및 체온1을 담당합니다. 골격근은 매우 역동적인 조직이며 기계적 스트레스, 대사 변화 및 일상적인 환경 요인과 같은 다양한 자극에 적응하는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 또한 골격근은 급성 손상에 반응하여 재생되어 형태와 기능을 완전히 회복시킵니다2. 골격근 가소성은 주로 근섬유 원형질막과 기저층 2,3 사이에 위치한 위성 세포라고도 하는 상주 근육 줄기 세포(MuSC) 집단에 의존합니다. 정상적인 조건에서 MuSC는 정지 상태로 근육 틈새에 상주하며 세포 회전율을 보상하고 줄기 세포 풀을 보충하기 위해 몇 개의 분할 만 있습니다4. 부상에 대한 반응으로 MuSC는 세포주기에 들어가 증식하며 새로운 근육 섬유의 형성에 기여하거나자가 재생 과정에서 틈새로 돌아갑니다 2,3. MuSC 외에도 골격근의 항상성 유지 및 재생은 섬유-지방형성 전구세포(FAP)5,6,7라고 하는 근육 상주 세포 집단의 지원에 의존합니다. FAP는 근육 결합 조직에 내재된 중간엽 기질 세포이며 섬유원성, 지방원성, 골인성 또는 연골성 계통 5,8,9,10을 따라 분화할 수 있습니다. FAP는 근육 줄기 세포 틈새에서 세포 외 기질 단백질의 공급원이기 때문에 MuSC에 대한 구조적 지원을 제공합니다. FAP는 또한 근형성 및 근육 성장에 대한 영양 지원을 제공하는 사이토카인및 성장 인자를 분비하여 골격근의 장기 유지를 촉진합니다6,11. 급성 근육 손상시, FAP는 빠르게 증식하여 재생 근육의 구조적 완전성을 지지하고 파라크린 방식으로 MuSCs 증식 및 분화를 유지하기 위한 유리한 환경을 제공하는 일시적인 틈새를 생성한다5. 재생이 진행됨에 따라 FAP는 세포 사멸에 의해 재생 근육에서 제거되고 그 수는 점차 기초 수준12로 돌아갑니다. 그러나, 만성 근육 손상을 선호하는 조건에서, FAP는 프로 세포 사멸 신호 전달을 무시하고 근육 틈새에 축적되어 콜라겐 생성 섬유 아세포 및 지방 세포로 분화하여 이소성 지방 침윤 및 섬유 성 흉터 형성을 유도한다12,13.

다분화능과 재생 능력으로 인해 FAP와 MuSC는 골격근 장애 치료를 위한 재생 의학의 잠재적 표적으로 확인되었습니다. 따라서, 이들의 기능 및 치료 잠재력을 조사하기 위해서는 FAP 및 MuSC의 분리 및 배양을 위한 효율적이고 재현 가능한 프로토콜을 수립하는 것이 중요하다.

형광 활성화 세포 분류(FACS)는 크기 및 입도와 같은 형태학적 특성을 기반으로 다양한 세포 집단을 식별할 수 있으며 세포 표면 마커에 대한 항체의 사용을 기반으로 세포 특이적 분리를 허용합니다. 성체 마우스에서 MuSC는 혈관 세포 접착 분자 1 (VCAM-1, CD106이라고도 함) 14,15 및 α7- 인테그린 15를 발현하는 반면, FAP는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 α (PDGFRα) 및 줄기 세포 항원 1 (Sca1 또는 Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 . 여기에 설명된 프로토콜에서 MuSC는 CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-인테그린+로 식별된 반면, FAP는 CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-인테그린-으로 식별되었습니다. 대안적으로, PDGFRαEGFP 마우스를 사용하여 FAP를 CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-인테그린-이벤트18,19로 단리하였다. 또한 PDGFRα-GFP+ 세포의 형광 신호 간의 중첩을 표면 마커 Sca1로 식별된 세포와 비교했습니다. 우리의 분석은 모든 GFP-발현 세포가 Sca1에 대해서도 양성임을 보여주었으며, 이는 FAP의 식별 및 분리를 위해 두 접근법 중 하나를 사용할 수 있음을 나타냅니다. 마지막으로, 특이적 마커 항체로 염색하여 각 세포군의 순도를 확인하였다.

프로토콜

수행된 모든 동물 실험은 국립 관절염, 근골격계 및 피부 질환 연구소(NIAMS)의 동물 관리 및 사용 위원회(ACUC)에서 승인한 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜을 수행하는 조사관은 현지 동물 윤리 지침을 준수해야합니다.

참고: 이 프로토콜은 성인 수컷 및 암컷 마우스(3-6개월)의 뒷다리 및 손상된 경골 전방(TA) 근육에서 FAP 및 MuSC를 분리하는 방법을 자세히 설명하고 FAP 및 MuSC를 배양하기 위한 지침을 제공합니다. 실험 절차의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜의 모든 단계는 달리 명시되지 않는 한 멸균 조건 및 실온(RT)에서 수행해야 합니다.

1. 시약 설정

  1. 세척 배지(WM): Ham의 F-10 Nutrient Mix 세포 배지에 10%(vol/vol) 말 혈청과 1x 페니실린/스트렙토마이신을 추가하여 이 용액을 준비합니다. WM은 미리 제조하여 4°C에서 보관할 수 있다.
  2. 근육 해리 완충액 (MDB) : 콜라게나제 II를 WM에 용해시켜이 완충액을 준비하십시오. 뒷다리 근육 전체를 채취하는 경우 각 마우스에 대해 10mL의 WM에 1000U/mL 콜라게나제 II를 녹입니다(50mL 원추형 튜브에 준비). TA 근육을 수집하는 경우 각 마우스에 대해 800 mL 콜라게나제 II를 7 mL의 WM에 녹입니다 (15 mL 원추형 튜브에 준비). TA 근육의 경우 이는 세포 펠릿을 더 잘 시각화하고 FAP 및 MuSC의 더 높은 수율을 얻는 데 도움이 됩니다. 근육을 모으기 전에 MDB를 신선하게 준비하고 필요할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
  3. 콜라게나제 II 용액 스톡: 콜라게나제 II를 멸균 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 최종 농도 1000U/mL로 용해시켜 이 용액을 준비합니다. 0.45μm 주사기 필터를 통해 용액을 여과하고 1mL 스톡에 분취합니다. 용액을 -20°C에서 보관한다.
  4. 디스파제 용액 스톡: 디스파아제를 멸균 1x PBS에 용해시켜 최종 농도 11U/mL로 이 용액을 준비합니다. 0.45μm 주사기 필터를 통해 용액을 여과하고 1mL 스톡에 분취합니다. 용액을 -20°C에서 보관한다.
  5. DMEM에 10%(부피/부피) 태아 소 혈청, 1x 페니실린/스트렙토마이신 및 2.5ng/mL FGF를 보충하여 FAP의 배양 배지를 준비합니다. 배지를 4°C에서 보관한다.
  6. F10에 10%(부피/부피) 말 혈청, 1x 페니실린/스트렙토마이신 및 2.5ng/mL FGF가 보충된 MuSC의 배양 배지를 준비합니다. 배지를 4°C에서 보관한다.
  7. DMEM에 10%(부피/부피) 소 태아 혈청, 10%(부피/부피) 말 혈청, 1x 페니실린/스트렙토마이신 및 2.5ng/mL FGF를 보충하여 공동 배양 배지를 준비합니다. 배지를 4°C에서 보관한다.

2. 뒷다리 근육 적출

  1. 2cm 접시(마우스당 접시 1개)에 WM 2-3mL를 넣고 얼음 위에 놓습니다.
  2. 질식으로 안락사 수행 : 마우스를 CO 2 챔버에 넣고 100 % CO2를 도입하십시오. 자궁 경부 탈구를 사용하여 사망을 확인하십시오.
  3. 마우스 앙와위를 해부 패드에 놓고 오염을 피하기 위해 70 % (vol / vol) 에탄올을 뿌립니다.
  4. 집게를 사용하여 마우스 배꼽 피부의 중앙을 꼬집고 수평으로 ~1cm 구멍을 자릅니다. 상처 가장자리를 잡고 구멍을 반대 방향으로 당겨 마우스의 책상을 잡고 아래 근육을 드러냅니다. 이때 마우스 뒷다리의 한쪽을 노출시킵니다.
  5. 근육을 모으기 전에 햄스트링과 대퇴사 두근의 근위 끝 사이의 근육 간 지방을 제거하십시오. 이렇게 하면 FAP 및 MuSC의 격리가 향상됩니다.
  6. 조직을 손상시키지 않고 날카로운 집게를 사용하여 근막을 부수고 벗겨 TA 및 신근 디지토룸 롱구스(EDL) 근육 아래를 노출시킵니다. TA/EDL 근육 아래에 있는 집게의 날카로운 끝을 움직여 경골에서 근육을 분리합니다.
  7. TA / EDL을 발목에 부착하는 힘줄을 잘라 내고 집게로 잡으면서 TA / EDL의 세로선을 따라 가위로 근육을 다듬습니다. 무릎 주위의 힘줄을 잘라 전체 TA/EDL 근육을 분리합니다. 얼음 위에 보관 된 6cm 접시에 근육을 놓습니다.
  8. 발목의 모든 힘줄을 절단하고 경골과 비골에서 근육을 분리하여 비복근과 솔레 우스 근육을 분리하십시오. 무릎 주위를 자르고 근육을 6cm 접시에 옮깁니다.
  9. 대퇴사 두근 주위의 근막을 떼어 내고 근육과 뼈 사이에 집게의 날카로운 끝을 움직여 대퇴골에서 분리하십시오. 무릎 주위의 힘줄을 자르고 말단에 집게로 대퇴사 두근을 잡고 대퇴골을 따라 절단하여 나머지 근육을 자릅니다. 근육을 6cm 접시에 넣으십시오.
  10. 햄스트링과 대퇴골 주변의 남은 근육을 분리하여 6cm 접시로 옮깁니다. 얼음 위에 보관 된 6cm 접시에 뒷다리 근육을 모으십시오.
    알림: 다운스트림 격리를 방해할 수 있는 혈액 덩어리 형성을 방지하기 위해 가능하면 혈관 손상을 피하십시오. 출혈이 발생하면 혈액을 흡수하기 위해 멸균 거즈로 절제 된 혈관을 즉시 닦아냅니다.
  11. 반대쪽 사지에서 TA, EDL, 비복근, 솔루스, 대퇴사두근 및 햄스트링 근육을 수집합니다.
    알림: 뒷다리 근육 전체를 분리 할 때 두 개 이상의 마우스를 풀링하지 마십시오. TA 근육을 분리하는 경우 최대 3개의 TA 근육을 풀링할 수 있습니다.

3. 기계적 및 효소적 근육 소화

  1. 6cm 접시에서 WM을 흡입하고 1-2mL의 MDB를 추가하여 근육을 촉촉하게 유지합니다.
  2. 잘 다진 조직의 슬러리 페이스트를 얻을 때까지 근육을 철저히 말하십시오. 이렇게하려면 집게를 사용하여 근육 조각의 한쪽 끝을 잡은 다음 메스를 사용하여 덜 단단해질 때까지 근육을 찢고 자릅니다.
  3. 가위를 사용하여 근육을 1-2 분 동안 작은 조각으로 자릅니다. 잘 다진 근육 슬러지를 얻을 때까지 각 근육 그룹에 대해이 단계를 반복하십시오.
    참고: 이는 FAP 및 MuSC의 수율을 최대화하기 위한 매우 중요한 단계입니다. 적절한 근육 다질을 보장하기 위해 이 단계에서 8-10분(TA 근육만 분리하는 경우 4-5분)을 보내는 것이 좋습니다.
  4. 각 마우스에서 다진 근육을 MDB가 들어있는 원추형 튜브로 옮깁니다.
  5. 튜브를 실험실 필름으로 밀봉하고 37°C 수조에서 교반(75rpm)하여 1시간 동안 배양합니다. 흔들림 경로를 따라 튜브를 수평으로 놓고 추를 사용하여 튜브를 물에 잠긴 상태로 유지합니다.
  6. 마우스당 1mL의 콜라게나제 II 스톡과 1mL의 디스파아제 스톡을 해동합니다. 사용하기 전에 스윙 버킷 로터에서 디스파제 스톡을 10,000 x g 에서 4°C에서 1분 동안 회전시킵니다. 상청액 만 사용하십시오.
  7. 뒷다리 근육 전체를 모은 경우 다음과 같이 진행하십시오.
    1. 1 시간 후, 셰이커에서 튜브를 제거하고 WM으로 50mL까지 채 웁니다. 혼합을 보장하기 위해 부드럽게 몇 번 뒤집습니다.
    2. 스윙 버킷 로터에서 셀을 250 x g 로 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 42mL의 상청액을 두 개의 새 튜브(각 튜브에 ~21mL)로 옮기고 원래 튜브에 ~8mL를 남겨 둡니다.
      1. 21mL의 상청액을 포함하는 새 튜브를 WM으로 최대 50mL까지 채웁니다. 4°C에서 8분 동안 350 x g 의 스윙 버킷 로터에서 세포를 다시 원심분리합니다. 모든 상청액을 흡입하고 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오.
    3. ~8mL의 MDB가 들어 있는 원래 튜브에 1mL의 콜라게나제 II 스톡과 1mL의 디스파아제 스톡을 추가합니다.
    4. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 펠릿을 막히지 않고 10회 재현탁합니다. 거품 형성을 피하면서 튜브 벽쪽으로 용액을 배출하십시오. 재부유 중에 막힘이 발생하면 피펫 끝을 튜브 바닥에 대고 밀어 근육 덩어리를 기계적으로 방해합니다. 3.9단계로 진행합니다.
  8. TA 근육이 수집 된 경우 다음과 같이 진행하십시오.
    1. 1 시간 후, 셰이커에서 튜브를 제거하고 WM으로 15mL까지 채 웁니다. 혼합을 보장하기 위해 부드럽게 몇 번 뒤집습니다.
    2. 스윙 버킷 로터에서 셀을 250 x g 로 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 13mL의 상청액을 하나의 새로운 15mL 튜브로 옮기고 원래 튜브에 ~2mL를 남겨둡니다.
      1. 13mL의 상청액을 포함하는 새 튜브를 최대 15mL까지 WM으로 채웁니다. 4°C에서 8분 동안 350 x g 의 스윙 버킷 로터에서 세포를 다시 원심분리합니다. 모든 상청액을 흡인하고 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오.
    3. 1000μL 피펫 팁을 사용하여 막힘 없이 원래 튜브에 펠릿을 위아래로 재현탁합니다.
    4. 2mL의 MDB가 들어있는 원래 튜브에 1mL의 콜라게나제 II 스톡과 1mL의 디스파제 스톡을 추가하고 WM으로 최대 10mL를 채 웁니다. 3.9단계로 진행합니다.
  9. 튜브를 실험실 필름으로 밀봉하고 37°C 수조에서 교반(75rpm)하여 30분 동안 배양합니다. 3.5단계와 같이 튜브를 놓습니다.

4. 단핵세포의 생성

알림: 15mL 원뿔형 튜브에서 수집된 TA 근육으로 작업하는 경우 50mL 원뿔형 튜브에 현탁액을 옮기고 4.1단계를 진행합니다.

  1. 30분 후 셰이커에서 튜브를 제거합니다. 20G 바늘로 10mL 주사기를 통해 근육 현탁액을 흡입하고 10 번 성공적으로 꺼냅니다.
    알림: 기포와 거품을 피하기 위해 튜브 벽을 향해 근육 현탁액을 배출하십시오. 소화되지 않은 힘줄이나 연골의 작은 조각은 첫 번째 흡인 라운드 동안 바늘을 막을 수 있습니다. 막힘이 발생하면 멸균 집게를 사용하여 바늘 끝에서 막힘을 제거하십시오.
  2. 각 튜브에 WM을 최대 50mL까지 채우고 혼합되도록 부드럽게 몇 번 뒤집습니다.
  3. 스윙 버킷 로터에서 셀을 250 x g 로 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 새 튜브(~42mL)로 옮기고 원래 튜브에 ~8mL를 남겨둡니다.
    1. 42mL의 상청액을 포함하는 새 튜브를 WM으로 최대 50mL까지 채웁니다. 4°C에서 8분 동안 350 x g 의 스윙 버킷 로터에서 세포를 다시 원심분리합니다. 모든 상청액을 흡인하고 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오.
  4. 8mL의 WM이 들어 있는 원래의 50mL 원뿔형 튜브에 40μm 나일론 세포 여과기를 놓고 1-2mL의 WM으로 세포 여과기를 미리 적십니다.
  5. 40μm 나일론 세포 여과기를 잡고 10mL 피펫을 사용하여 펠릿을 5-10회 부드럽게 재현탁합니다. 세포 스트레이너를 통해 펠릿을 동일한 튜브로 다시 여과하여 세포 손실을 최소화합니다.
  6. 이 단계에서 얼음 위에 셀 펠릿이 있는 추가 튜브가 있는지 확인하십시오. 각 튜브에 4-5mL의 WM을 추가하여 펠릿을 원래 튜브로 다시 여과하여 펠릿을 재현탁하고 용액을 원래 튜브에 위치한 셀 스트레이너로 옮깁니다. 중력에 의한 필터링을 허용합니다.
  7. 모든 펠릿을 원래의 50mL 원뿔형 튜브에 모은 후 다른 4-5mL의 WM으로 세포 여과기를 헹굽니다. 1000μL 피펫을 사용하여 세포 여과기 아래쪽에서 모든 액체를 수집합니다.
  8. 각 튜브에 WM을 최대 50mL까지 채우고 혼합되도록 부드럽게 몇 번 뒤집습니다.
  9. 스윙 버킷 로터에서 셀을 250 x g 로 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 원심분리 후 모든 상청액을 즉시 흡인합니다.
  10. 펠릿을 600μL의 WM에 재현탁하고 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.

5. 유세포분석을 위한 항체염색

참고: 각 실험에 대해 i) 염색되지 않은 대조군, ii) 살아있는 세포 집단에 대해 선택할 생존력 제어, iii) 형광 색소 방출 유출을 보정하기 위한 단일 염색 보정 제어, iv) 유출 확산을 고려하여 게이팅 경계를 설정하기 위한 형광 마이너스 1(FMO) 제어를 설정합니다. 염색 대조군의 전체 목록은 표 1 을 참조하십시오.

  1. 염색되지 않은 대조군을 준비하려면 10μL의 세포 현탁액을 190μL의 WM이 포함된 2mL 미세 원심분리 튜브에 옮깁니다. 세포 현탁액을 재현탁하고 35μm 세포 여과기 캡이 있는 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브를 통해 여과합니다. 서스펜션이 중력에 의해 필터링되도록 합니다.
  2. 200μL 피펫을 사용하여 세포 여과기 아래쪽에서 모든 액체를 수집합니다. 뚜껑으로 밀봉하고 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 두십시오.
  3. 생존력, FMO 및 단일 염색 대조군 준비: 10개의 2mL 미세 원심분리 튜브에 라벨을 붙이고 각 튜브에 190μL의 WM과 10μL의 세포 현탁액을 추가합니다. 컨트롤의 전체 목록은 표 1 을 참조하십시오. 실험 대조군에 따라 적절한 튜브에 항체를 추가합니다. 항체 조합 및 농도에 관한 정보는 표 1 을 참조한다.
  4. 나머지 세포 현탁액(500μL)을 2mL 미세원심분리 튜브(실험 튜브)에 옮기고 CD31-APC, CD45-APC, Sca1-퍼시픽 블루, VCAM-1-비오틴 및 α7-인테그린-PE 항체를 추가합니다. 항체 조합 및 농도에 관한 정보는 표 1 을 참조한다.
  5. 균일한 분포를 보장하기 위해 각 튜브를 부드럽게 잘 혼합하고 빛으로부터 보호되는 4°C의 회전 셰이커에서 45분 동안 세포를 배양합니다.
  6. 45분 후 모든 미세 원심분리 튜브를 최대 2mL까지 WM으로 채웁니다. 완전히 혼합되도록 튜브를 부드럽게 몇 번 뒤집습니다. 250 x g 의 고정 각도 로터가 있는 냉장 원심분리기에서 튜브를 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인합니다.
  7. 모든 마이크로 원심분리 튜브에 세포를 300μL의 WM에 재현탁시킵니다.
  8. 스트렙타비딘 항체를 적절한 튜브에 추가합니다. 항체 조합 및 농도에 관한 정보는 표 1 을 참조한다. 균일한 분포를 보장하기 위해 각 튜브를 부드럽게 잘 혼합하고 빛으로부터 보호되는 4°C의 회전 셰이커에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 나머지 튜브는 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 두십시오.
  9. 20분 후, 스트렙타비딘 항체가 포함된 미세원심분리기 튜브를 WM으로 2mL까지 채웁니다. 완전히 혼합되도록 튜브를 몇 번 부드럽게 뒤집습니다. 250 x g 의 고정 각도 로터가 있는 냉장 원심분리기에서 튜브를 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 완전히 흡인하고 300μL의 WM에 세포를 재현탁시킵니다.
  10. 10 5 mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브의 35 μm 세포 여과기 캡을 200 μL의 WM으로 미리 적시고, 적절한 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브를 통해 컨트롤 튜브에서 세포를 필터링합니다. 200μL 피펫을 사용하여 세포 여과기 아래쪽에서 모든 액체를 수집합니다. 뚜껑으로 밀봉하고 튜브를 얼음 위에 놓고 빛으로부터 보호하십시오.
  11. 총 500μL의 WM에 대해 추가 200μL의 WM으로 실험 튜브의 세포를 재현탁합니다. 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브의 세포 여과기 캡을 200μL의 WM으로 미리 적십니다. 실험 튜브에서 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 세포 현탁액을 옮기고 중력에 의해 여과되도록 합니다.
  12. 실험 샘플 현탁액이 들어 있는 2mL 미세 원심분리 튜브를 300μL의 WM으로 헹구고 동일한 스트레이너 캡을 통과시킵니다. 200μL 피펫을 사용하여 세포 여과기 아래쪽에서 모든 액체를 수집합니다. 뚜껑으로 밀봉하고 튜브를 얼음 위에 놓고 빛으로부터 보호하십시오.
    알림: 35μm 셀 스트레이너 캡이 막히면 벤치의 튜브를 부드럽게 두드려 흐름을 촉진합니다.
  13. FAP 및 MuSC용 수집 튜브를 준비하고 라벨을 붙입니다. 전체 뒷다리 근육에서 세포를 분리하는 경우 2x 혈청이 보충된 최대 1mL의 FAP 또는 MuSC 배양 배지와 함께 5mL 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브에서 세포를 분류합니다. TA 근육에서 세포를 분리하는 경우 2x 혈청이 보충된 최대 400μL의 배양 배지를 포함하는 2mL 미세 원심분리 튜브에서 FAP 및 MuSC를 분류합니다.

6. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)

참고: 이 프로토콜은 100μm 노즐이 장착된 소형 벤치탑 연구용 유세포분석기를 사용하며 최대 9개의 서로 다른 형광색소(전방 및 측면 산란을 포함한 11개 파라미터)를 분석할 수 있는 3개의 레이저 구성(488nm, 640nm, 405nm)을 특징으로 합니다. 이 프로토콜에 사용되는 형광 색소 및 관련 검출기 대역 통과 필터는 다음과 같습니다 : PE 586/42; PE-Cy7 783/56; APC 660/10; 퍼시픽 블루 448/45; 7- 아미노 악티 노 마이신 D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. 세포는 4°C에서 분류되고 분류 후 얼음 위에 남아 있습니다. 이 기기를 작동하기 전에 사용자가 기술 응용 전문가로부터 적절한 교육을 받았는지 확인하십시오.

  1. 설정 및 성능 제조업체의 사양에 따라 셀 분류기를 확인하십시오.
  2. FAP 및 MuSC를 식별하기 위한 계층적 게이팅 전략을 설정합니다(그림 2).
    1. 다음의 반응식에 기초하여 FAP를 분리한다: i) 순방향 세포 산란 영역 대 측면 세포 산란 영역 (FSC-A 대 SSC-A)을 분리하여 세포 대 파편을 분리하고, ii) 측면 세포 산란 높이 대 측면 세포 산란 폭 (SSC-H 대 SSC-W)을 사용하여 단일렛을 SSC 범위의 이중선으로부터 구별하고, iii) 순방향 세포 산란 높이 대 순방향 세포 산란 폭(FSC-H 대 FSC-W)을 사용하여 단일렛을 FSC 범위의 이중선으로부터 구별하고, iv) 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위한 7-AAD 영역 대 SSC-A.
      1. 항체 기반 방법을 통해 FAP를 단리하는 경우, 다음 스킴을 사용하십시오: v) APC-CD45/CD31 영역 대 태평양 청색-Ly-6A/E (Sca1) 영역 대 CD31+ 및 CD45+ 세포를 추가 분석에서 제외하고, vi) PE-Cy7-VCAM-1 영역 대 PE-α7-인테그린 영역을 CD31-/CD45-/Sca1+ 집단에서 FAP를 구별합니다. FAP는 CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-인테그린- 이벤트로 식별됩니다.
      2. 내인성 GFP 리포터 방법을 통해 FAP를 단리하는 경우, 다음 스킴을 사용하십시오: v) APC-CD45/CD31 영역 대 GFP-PDGFRα 영역을 사용하여 추가 분석에서 CD31+ 및 CD45+ 세포를 배제하고 GFP+ 세포를 분리합니다. FAP는 CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-인테그린- 이벤트로 식별됩니다.
    2. 다음 계획에 따라 MuSC를 분리합니다 : i) 순방향 세포 산란 영역 대 측면 세포 산란 영역 (FSC-A 대 SSC-A)을 분리하여 세포 대 파편을 분리하고, ii) 측면 셀 산란 높이 대 측면 셀 산란 폭 (SSC-H 대 SSC-W)을 사용하여 단일 렛을 SSC 범위의 이중선과 구별하고, iii) 순방향 셀 산란 높이 대 순방향 셀 산란 폭 (FSC-H 대 FSC-W)을 통해 단일 렛을 FSC 범위의 이중선과 구별하고, iv) 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위한 7-AAD 영역 대 SSC-A, v) 추가 분석에서 CD31+ 및 CD45+ 세포를 제외하기 위한 APC-CD45/CD31 영역 대 Pacific Blue-Ly-6A/E(Sca1) 영역, vi) MuSC를 구별하기 위한 CD31-/CD45-/Sca1- 집단에서 PE-Cy7-VCAM-1 영역 대 PE-α7-인테그린 영역. MuSC는 CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-인테그린+ 이벤트로 식별됩니다.
  3. 염색되지 않은 제어 및 생존력 제어를 실행하여 세포 집단이 SSC-A 대 FSC-A 플롯에 적절하게 배치되고 살아있는 단일 세포에서 적절하게 게이트되는지 확인합니다.
  4. 모든 단일 염색 컨트롤을 획득하고 스필오버 보상 매트릭스를 생성합니다.
  5. 모든 FMO 컨트롤을 실행하고 배경 형광 확산과 양성으로 염색된 집단 사이의 컷오프 지점을 결정합니다.
  6. 실험 샘플을 획득하기 약 5-10 분 전에 7-AAD 생존 염료를 첨가하고 부드럽게 혼합하십시오.
  7. 모든 컨트롤이 처리되면 FMO 컨트롤에 따라 정렬 게이트를 설정합니다. 실험 샘플을 수집하고 정렬합니다.
  8. 모든 샘플이 처리된 후 제조업체의 사양에 따라 세포분석기를 청소하십시오. 분석을 위해 모든 .fcs 데이터를 내보냅니다.

7. FAP와 MuSC의 문화

참고: 분류된 세포는 분류 직후 콜라겐 I 코팅된 플레이트의 적절한 배지에서 배양해야 합니다.

  1. 수집 튜브를 250 x g 의 고정각 로터에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  2. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인합니다.
  3. MuSC의 배양을 위해, 적절한 부피의 MuSC 배양 배지에 세포를 재현탁시키고 37°C 및 5%CO2의 표준 조건에서 배양한다.
    1. 20,000 세포/cm2 의 밀도에서 새로 단리된 MuSC를 플레이트화하고 15,000 세포/cm2의 밀도에서 활성화된 MuSC를 플레이트화합니다.
    2. 도금 후 세포는 작고 구형이며 반투명하게 보입니다. 36 시간 이내에 MuSC는 플레이트 표면에 부착되어 처음 48 시간 동안 천천히 크기를 늘립니다.
    3. 2일마다 배지를 교체하십시오.
      참고: MuSC는 세포 밀도에 매우 민감합니다. MuSC를 증식 상태로 유지하려면 60%-70% 합류할 때까지 성장시킵니다. 세포를 새로운 콜라겐 I 코팅 접시 또는 접시에 통과시키고 2일마다 새로운 신선한 배지를 추가합니다. MuSC를 3-4 일 이상 같은 접시 나 접시에 보관하면 길쭉한 형태를 얻고 함께 융합 될 때까지 이웃 세포와 정렬됩니다.
  4. FAP의 배양을 위해, 세포를 적절한 부피의 MuSC 배양 배지에 재현탁시키고, 37°C 및 5%CO2에서 표준 조건에서 배양한다.
    1. 교란되지 않은 근육으로부터 단리된 FAP를 15,000 세포/cm2 의 밀도로 플레이트하고, 손상된 근육으로부터 단리된 FAP를 9,000 세포/cm2로 플레이트화한다.
      참고: 도금 후 FAP는 48시간 이내에 플레이트 표면에 완전히 부착되는 반면 활성화된 FAP는 몇 시간 내에 플레이트에 부착됩니다. 일단 부착되면 FAP는 작은 세포체와 길쭉한 세포 과정을 가진 특징적인 모양을 얻고 빠르게 증식합니다.
    2. 2일마다 배지를 교체하십시오.
      참고: FAP는 셀 밀도에 매우 민감합니다. 낮은 밀도에서 FAP를 시딩하면 세포 성장 및 세포 사멸이 불량해질 수 있습니다. 반대로, 높은 시딩 밀도에서 도금 FAP는 세포 생존을 촉진하고 그들의 확장을 향상시킬 것이다. 손상된 근육으로부터 유래된 FAP는 이미 활성화되어 있기 때문에 일반적으로 손상되지 않은 근육보다 낮은 세포 밀도를 필요로 한다. 실험 조건과 샘플 소스에 따라 FAP 도금 밀도를 조정하는 것이 좋습니다.
  5. 공동 배양의 경우, FAP 및 MuSC를 공동 배양 배지에 1:1의 비율로 재현탁시키고 37°C 및 5%CO2에서 표준 조건에서 배양합니다. 세포를 48시간 동안 부착하고 2일마다 배지를 교체합니다.

8. 배양된 FAP 및 MuSC의 면역형광 분석

  1. 세포 배지를 흡인하고 1x PBS로 2회 또는 3회 세척을 수행합니다.
  2. RT에서 15분 동안 1x PBS 중 2% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 고정합니다.
  3. 2% PFA를 흡인하고 1x PBS로 세포를 두세 번 빠르게 세척합니다.
  4. 세포 투과 및 차단 수행 :
    1. 새로 단리된 FAP의 면역염색을 위해, RT에서 30분 동안 1x PBS + 0.1% 트리톤 X-100(PBST) + 1% 소 혈청 알부민(BSA) + 5% 정상 당나귀 혈청(NDS)으로 세포를 인큐베이션하여 세포 투과화 및 차단을 수행한다.
    2. 새로 단리된 MuSC의 면역염색을 위해, RT에서 30분 동안 PBST + 1% BSA + 5% 정상 염소 혈청(NGS)으로 세포를 인큐베이션함으로써 세포 투과화 및 차단을 수행한다.
  5. 1 차 항체 적용 :
    1. 새로 단리된 FAP의 면역염색을 위해, PBST + 1% BSA + 5% NDS에 희석된 염소 항 PDGFRα 1차 항체 (1:300)를 4°C에서 밤새 적용한다.
    2. 새로 분리된 MuSC의 면역염색을 위해, PBST + 1% BSA + 5% NGS에 희석된 마우스 항 Pax7 1차 항체(1:10)를 RT에서 45분 동안 적용한다.
  6. 세포를 1x PBS로 2회 또는 3회 세척하여 1차 항체 용액을 제거하였다.
  7. 2 차 항체 적용 :
    1. 새로 단리된 FAP의 면역염색을 위해, PBST + 1% BSA에 희석된 당나귀 항염소 IgG (H+L) 알렉사 플루오르 488 2차 항체 (1:500)를 RT에서 1시간 동안 도포한다.
    2. 새로 단리된 MuSC의 면역염색을 위해, RT에서 45분 동안 PBST + 1% BSA에 희석된 염소 항-마우스 IgG 1 Alexa Fluor 555 2차 항체(1 :500)를 적용한다.
  8. 세포를 1x PBS로 2회 또는 3회 세척하여 1차 항체 용액을 제거하였다.
  9. RT에서 5분 동안 PBST(1:1000)에서 DAPI로 세포를 배양하여 핵 카운터 염색을 수행합니다.
  10. 세포를 1x PBS로 3회 세척하여 DAPI 용액을 제거하였다.
    주의 : DAPI는 독성이 있고 위험합니다. 조심스럽게 취급하고 유해 폐기물 병에 폐기하십시오.
  11. 세포를 빛으로부터 보호되는 4°C에서 보관한다.

결과

이 프로토콜은 야생형 성인 마우스(3-6개월)의 손상되지 않은 뒷다리로부터 약 100만 개의 FAP 및 최대 350,000개의 MuSC를 분리할 수 있게 하며, 이는 전체 이벤트의 FAP에 대해 8% 및 MuSC에 대해 3%의 수율에 해당합니다. 손상 후 7일 후에 손상된 TA로부터 세포를 분류할 때, 2 내지 3개의 TA 근육을 풀링하여 최대 300,000개의 FAP 및 120,000개의 MuSC를 얻으며, 이는 각각 11% 및 4%의 수율에 해당한다. 사후 정렬 순?...

토론

순수 성체 줄기 세포 집단의 식별 및 분리를 위한 효율적이고 재현 가능한 프로토콜을 수립하는 것은 그 기능을 이해하기 위한 첫 번째이자 가장 중요한 단계입니다. 분리된 FAP 및 MuSC는 근육 질환에 대한 잠재적인 치료법으로서 이식 실험에서 다중오믹스 분석을 수행하는 데 사용될 수 있거나 줄기 세포 치료에서 질병 모델링을 위해 유전적으로 변형될 수 있다.

여기에 설명...

공개

없음.

감사의 말

MuSC 격리에 대한 조언을 해주신 Tom Cheung (Hong Kong University of Science & Technology)에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 AR041126 및 AR041164를 통해 NIAMS-IRP에서 자금을 지원했습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL Polypropylene Round-Bottom TubeFalcon352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapFalcon352235
20 G BD Needle 1 in. single use, sterileBD Biosciences 305175
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)The University of British Columbia53-0010-01
APC anti-mouse CD31 AntibodyBioLegend102510
APC anti-mouse CD45 AntibodyBioLegend103112
BD FACSMelody Cell SorterBD Biosciences 
BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mLBD Biosciences 309604
Biotin anti-mouse CD106 AntibodyBioLegend105703
C57BL/6J  mouse (Female and Male)The Jackson Laboratory000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouseThe Jackson Laboratory007669
Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell PlateCorning356400
Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell PlateCorning356500
Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell PlateCorning356408
DAPI Solution (1 mg/mL)ThermoFisher Scientific62248
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, SterileVWR414004-265
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11055
Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, SterileCorning352340
Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, SterileCorning353002
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mLVWR352196
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mLCorning352070
Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, CorningVWR60819-728
Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap CorningVWR21008-948
Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)PromegaG5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, powderThermoFisher Scientific17101015
Gibco Dispase, powderThermoFisher Scientific17105041
Gibco DMEM, high glucose, HEPESThermoFisher Scientific12430054
Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United StatesThermoFisher Scientific16000044
Gibco Ham's F-10 Nutrient MixThermoFisher Scientific11550043
Gibco Horse Serum, New Zealand originThermoFisher Scientific16050122
Gibco PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010023
Gibco PBS (10x), pH 7.4ThermoFisher Scientific70011044
Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)ThermoFisher Scientific10378016
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA-21127
Hardened Fine ScissorsFine Science Tools Inc14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)ThermoFisher ScientificA1310
Mouse PDGF R alpha AntibodyR&D SystemsAF1062
Normal Donkey SerumFisher ScientificNC9624464
Normal Goat SerumThermoFisher Scientific31872
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) AntibodyBioLegend108120
Paraformaldehyde, 16%Fisher ScientificNCC0528893
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)Developmental Study Hybridoma BankN/A
PE/Cyanine7 StreptavidinBioLegend405206
Student Vannas Spring ScissorsFine Science Tools Inc91500-09
Student Dumont #5 ForcepsFine Science Tools Inc91150-20
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

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