FACS-isolamento e coltura di progenitori fibro-adipogeni e cellule staminali muscolari da muscolo scheletrico di topo imperturbato e ferito

Riepilogo

L'identificazione precisa delle cellule progenitrici fibro-adipogeniche (FAP) e delle cellule staminali muscolari (MuSC) è fondamentale per studiare la loro funzione biologica in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo fornisce linee guida per l'isolamento, la purificazione e la coltura di FAP e MuSC da muscoli di topo adulti.

Abstract

Le cellule progenitrici fibro-adipogeniche (FAP) sono una popolazione di cellule stromali mesenchimali (MSC) residenti nel muscolo scheletrico in grado di differenziarsi lungo la linea fibrogenica, adipogena, osteogenica o condrogena. Insieme alle cellule staminali muscolari (MuSC), le FAP svolgono un ruolo fondamentale nell'omeostasi, nella riparazione e nella rigenerazione muscolare, mantenendo e rimodellando attivamente la matrice extracellulare (ECM). In condizioni patologiche, come danni cronici e distrofie muscolari, i FAP subiscono un'attivazione aberrante e si differenziano in fibroblasti e adipociti produttori di collagene, portando alla fibrosi e all'infiltrazione grassa intramuscolare. Pertanto, i FAP svolgono un duplice ruolo nella rigenerazione muscolare, sostenendo il turnover MuSC e promuovendo la riparazione dei tessuti o contribuendo alla formazione di cicatrici fibrotiche e infiltrati di grasso ectopico, che compromettono l'integrità e la funzione del tessuto muscolare scheletrico. Una corretta purificazione di FAP e MuSC è un prerequisito per comprendere il ruolo biologico di queste cellule sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Qui, descriviamo un metodo standardizzato per l'isolamento simultaneo di FAP e MuSC dai muscoli degli arti di topi adulti utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Il protocollo descrive in dettaglio la dissociazione meccanica ed enzimatica delle cellule mononucleate dai muscoli dell'intero arto e dai muscoli tibiali anteriori (TA) lesionati. FAP e MuSC vengono successivamente isolati utilizzando uno smistatore di cellule semi-automatico per ottenere popolazioni cellulari pure. Descriviamo inoltre un metodo ottimizzato per la coltura di FAP e MuSC quiescenti e attivati, da soli o in condizioni di cocultura.

Introduzione

Il muscolo scheletrico è il tessuto più grande del corpo, che rappresenta ~ 40% del peso umano adulto, ed è responsabile del mantenimento della postura, della generazione di movimento, della regolazione del metabolismo energetico basale e della temperatura corporea¹. Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente dinamico e possiede una notevole capacità di adattarsi a una varietà di stimoli, come stress meccanico, alterazioni metaboliche e fattori ambientali quotidiani. Inoltre, il muscolo scheletrico si rigenera in risposta a lesioni acute, portando al completo ripristino della sua morfologia e delle sue funzioni². La plasticità del muscolo scheletrico si basa principalmente su una popolazione di cellule staminali muscolari residenti (MuSC), chiamate anche cellule satelliti, che si trovano tra la membrana plasmatica della miofibra e la lamina basale ^2,3. In condizioni normali, i MuSC risiedono nella nicchia muscolare in uno stato quiescente, con solo poche divisioni per compensare il turnover cellulare e ricostituire il pool di cellule staminali⁴. In risposta alle lesioni, le MuSC entrano nel ciclo cellulare, proliferano e contribuiscono alla formazione di nuove fibre muscolari o ritornano nella nicchia in un processo di auto-rinnovamento ^2,3. Oltre ai MuSC, il mantenimento omeostatico e la rigenerazione del muscolo scheletrico si basano sul supporto di una popolazione di cellule muscolari residenti denominate progenitori fibro-adipogeni (FAP)^5,6,7. Le FAP sono cellule stromali mesenchimali incorporate nel tessuto connettivo muscolare e in grado di differenziarsi lungo la linea fibrogenica, adipogena, osteogenica o condrogena 5,8,9,10. I FAP forniscono supporto strutturale per i MuSC in quanto sono una fonte di proteine della matrice extracellulare nella nicchia delle cellule staminali muscolari. I FAP promuovono anche il mantenimento a lungo termine del muscolo scheletrico secernendo citochine e fattori di crescita che forniscono supporto trofico per la miogenesi e la crescita muscolare ^6,11. In caso di lesione muscolare acuta, i FAP proliferano rapidamente per produrre una nicchia transitoria che supporta l'integrità strutturale del muscolo rigenerante e fornisce un ambiente favorevole per sostenere la proliferazione e la differenziazione dei MuSC in modo paracrino⁵. Man mano che la rigenerazione procede, i FAP vengono eliminati dal muscolo rigenerativo mediante apoptosi e il loro numero ritorna gradualmente al livello basale¹². Tuttavia, in condizioni che favoriscono il danno muscolare cronico, i FAP annullano la segnalazione pro-apoptotica e si accumulano nella nicchia muscolare, dove si differenziano in fibroblasti e adipociti che producono collagene, portando a infiltrati di grasso ectopico e formazione di cicatrici fibrotiche^12,13.

Grazie alla loro multipotenza e alle loro capacità rigenerative, FAP e MuSC sono stati identificati come potenziali bersagli nella medicina rigenerativa per il trattamento dei disturbi del muscolo scheletrico. Pertanto, per studiare la loro funzione e il potenziale terapeutico, è importante stabilire protocolli efficienti e riproducibili per l'isolamento e la coltura di FAP e MuSC.

La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) può identificare diverse popolazioni cellulari in base a caratteristiche morfologiche come dimensioni e granularità e consente l'isolamento cellulare specifico basato sull'uso di anticorpi diretti contro i marcatori della superficie cellulare. Nei topi adulti, i MuSC esprimono la molecola di adesione delle cellule vascolari 1 (VCAM-1, nota anche come CD106)14,15 e α7-integrina ¹⁵, mentre i FAP esprimono il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine α (PDGFRα) e l'antigene delle cellule staminali 1 (Sca1 o Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . Nel protocollo qui descritto, i MuSC sono stati identificati come CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, mentre i FAP sono stati identificati come CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. In alternativa, topi PDGFRαEGFP sono stati impiegati per isolare FAP come CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- eventi^18,19. Inoltre, abbiamo confrontato la sovrapposizione tra il segnale fluorescente delle cellule PDGFRα-GFP+ alle cellule identificate dal marcatore di superficie Sca1. La nostra analisi ha mostrato che tutte le cellule che esprimono GFP erano anche positive per Sca1, indicando che entrambi gli approcci possono essere impiegati per l'identificazione e l'isolamento delle FAP. Infine, la colorazione con anticorpi marcatori specifici ha confermato la purezza di ciascuna popolazione cellulare.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida istituzionali approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali (ACUC) dell'Istituto nazionale di artrite, muscoloscheletrico e malattie della pelle (NIAMS). Gli investigatori che eseguono questo protocollo devono aderire alle loro linee guida locali sull'etica animale.

NOTA: Questo protocollo descrive in dettaglio come isolare FAP e MuSC dagli arti posteriori e dai muscoli tibiali anteriori (TA) feriti di topi maschi e femmine adulti (3-6 mesi) e fornisce linee guida per la cocoltura di FAP e MuSC. Una panoramica della procedura sperimentale è mostrata nella Figura 1. Tutte le fasi di questo protocollo devono essere eseguite in condizioni sterili e a temperatura ambiente (RT) se non diversamente specificato.

1. Configurazione del reagente

1. Wash Medium (WM): Preparare questa soluzione aggiungendo il 10% (vol/vol) di siero di cavallo e 1x penicillina/streptomicina al mezzo cellulare F-10 Nutrient Mix di Ham. WM può essere preparato in anticipo e conservato a 4 °C.
2. Tampone di dissociazione muscolare (MDB): preparare questo tampone sciogliendo la collagenasi II in WM. Se si raccolgono muscoli interi degli arti posteriori, sciogliere 1000 U/mL di collagenasi II in 10 mL di WM per ciascun topo (da preparare in un tubo conico da 50 ml). Se si raccolgono muscoli TA, sciogliere 800 U/mL di collagenasi II in 7 mL di WM per ciascun topo (da preparare in un tubo conico da 15 ml). Per i muscoli TA, questo aiuterà a visualizzare meglio i pellet cellulari e ottenere una maggiore resa di FAP e MuSC. Preparare MDB fresco prima di raccogliere i muscoli e tenerlo in ghiaccio fino al momento del bisogno.
3. Stock di soluzione di collagenasi II: preparare questa soluzione sciogliendo la collagenasi II in soluzione salina sterile tamponata con fosfato 1x (PBS) fino ad una concentrazione finale di 1000 U/ml. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,45 μm e aliquote in 1 mL di stock. Conservare la soluzione a -20 °C.
4. Stock di soluzione di dispase: preparare questa soluzione sciogliendo Dispase in 1x PBS sterile fino ad una concentrazione finale di 11 U/mL. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,45 μm e aliquote in 1 mL di stock. Conservare la soluzione a -20 °C.
5. Preparare il terreno di coltura di FAP integrando DMEM con siero bovino fetale al 10% (vol / vol), 1x penicillina / streptomicina e 2,5 ng / mL FGF. Conservare il fluido a 4 °C.
6. Preparare il terreno di coltura di MuSC integrando F10 con siero di cavallo al 10% (vol / vol), 1x penicillina / streptomicina e 2,5 ng / mL FGF. Conservare il fluido a 4 °C.
7. Preparare il terreno di coltura integrando DMEM con siero bovino fetale al 10% (vol/vol), siero equino al 10% (vol/vol), 1x penicillina/streptomicina e 2,5 ng/mL FGF. Conservare il fluido a 4 °C.

2. Raccolta dei muscoli degli arti posteriori

1. Aggiungere 2-3 ml di WM in un piatto da 6 cm (un piatto per mouse) e metterlo sul ghiaccio.
2. Eseguire l'eutanasia per asfissia: posizionare il topo in una camera di CO 2 e introdurre il 100% di CO₂. Utilizzare la dislocazione cervicale per confermare la morte.
3. Posizionare il topo supino su un tampone di dissezione e spruzzarlo con etanolo al 70% (vol/vol) per evitare la contaminazione.
4. Utilizzare una pinza per pizzicare il centro della pelle della pancia del topo e tagliare un'apertura di ~ 1 cm orizzontalmente. Afferrare i bordi della ferita e scrivania nel mouse tirando l'apertura in direzioni opposte per scoprire i muscoli sottostanti. Esporre un lato dell'arto posteriore del topo in quel momento.
5. Prima di raccogliere i muscoli, rimuovere il grasso intermuscolare tra i muscoli posteriori della coscia e l'estremità prossimale del quadricipite. Ciò migliorerà l'isolamento di FAP e MuSC.
6. Senza danneggiare il tessuto, utilizzare una pinza affilata per rompere e staccare la fascia per esporre i muscoli TA e estensore digitorum longus (EDL). Eseguire la punta affilata della pinza sotto i muscoli TA / EDL per staccare i muscoli dalla tibia.
7. Tagliare i tendini che attaccano il TA / EDL alla caviglia e, mentre lo si tiene con una pinza, tagliare i muscoli con le forbici lungo la linea longitudinale del TA / EDL. Tagliare i tendini intorno al ginocchio per staccare tutti i muscoli TA / EDL. Posizionare i muscoli in un piatto di 6 cm tenuto in ghiaccio.
8. Procedere a isolare i muscoli gastrocnemio e soleo tagliando tutti i tendini alla caviglia e staccando i muscoli dalla tibia e dal perone. Tagliare intorno al ginocchio e trasferire i muscoli sul piatto di 6 cm.
9. Staccare la fascia intorno al quadricipite e separarla dal femore facendo scorrere la punta affilata della pinza tra il muscolo e l'osso. Tagliare i tendini intorno al ginocchio e, tenendo i quadricipiti con una pinza all'estremità distale, tagliare il resto del muscolo tagliando lungo il femore. Posizionare i muscoli nel piatto da 6 cm.
10. Staccare i muscoli posteriori della coscia e i muscoli rimanenti intorno al femore e trasferirli nel piatto di 6 cm. Raccogliere i muscoli degli arti posteriori in un piatto di 6 cm tenuto sul ghiaccio.
    NOTA: Evitare di danneggiare i vasi sanguigni, quando possibile, per prevenire la formazione di grumi di sangue che potrebbero interferire con l'isolamento a valle. Se si verifica sanguinamento, tamponare immediatamente il recipiente asportato con una garza sterile per assorbire il sangue.
11. Raccogliere TA, EDL, gastrocnemio, soleo, quadricipite e muscoli posteriori della coscia dall'arto controlaterale.
    NOTA: Quando si isolano tutti i muscoli degli arti posteriori, non raggruppare due o più topi. Se si isolano i muscoli TA, è possibile raggruppare fino a tre muscoli TA.

3. Digestione muscolare meccanica ed enzimatica

1. Aspirare WM dal piatto da 6 cm e aggiungere 1-2 ml di MDB per mantenere i muscoli umidi.
2. Tritare accuratamente i muscoli fino ad ottenere una pasta di liquame di tessuto ben tritato. Per fare ciò, utilizzare una pinza per tenere un'estremità di un pezzo di muscolo, quindi utilizzare un bisturi per strappare e tagliare il muscolo fino a quando meno stretto.
3. Usando le forbici, continua a tagliare il muscolo in piccoli pezzi per 1-2 minuti. Ripetere questo passaggio per ogni gruppo di muscoli fino ad ottenere un fango muscolare ben tritato.
   NOTA: Questo è un passaggio molto critico per massimizzare la resa di FAP e MuSC. Si consiglia di trascorrere 8-10 minuti (4-5 minuti se si isolano solo i muscoli TA) in questo passaggio per garantire un corretto tritamento muscolare.
4. Trasferire i muscoli tritati da ciascun topo al tubo conico contenente MDB.
5. Sigillare i tubi con pellicola da laboratorio e incubare in bagnomaria a 37 °C con agitazione (75 rpm) per 1 h. Posizionare i tubi orizzontalmente lungo il percorso di agitazione e utilizzare i pesi per mantenere i tubi immersi nell'acqua.
6. Scongelare 1 mL di brodo di collagenasi II e 1 mL di stock di dispase per topo. Prima dell'uso, ruotare il brodo di dispase in un rotore a benna oscillante a 10.000 x g per 1 minuto a 4 °C. Usa solo il surnatante.
7. Se sono stati raccolti interi muscoli degli arti posteriori, procedere come segue:
   1. Dopo 1 ora, rimuovere il tubo dallo shaker e riempirlo a 50 ml con WM. Capovolgere delicatamente un paio di volte per garantire la miscelazione.
   2. Centrifugare le celle in un rotore a benna oscillante a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire 42 mL di surnatante in due nuove provette (~21 mL in ciascuna provetta) e lasciare ~8 mL nella provetta originale.
      1. Riempire le nuove provette contenenti 21 mL di surnatante fino a 50 mL con WM. Centrifugare nuovamente le celle in un rotore a benna oscillante a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Aspirare tutto il surnatante e mantenere il pellet sul ghiaccio.
   3. Aggiungere 1 mL di brodo di collagenasi II e 1 mL di stock di dispase nel tubo originale contenente ~8 mL di MDB.
   4. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml, risospendere il pellet 10 volte senza intasarlo. Espellere la soluzione verso la parete del tubo, evitando la formazione di bolle. Se si verifica un intasamento durante la risospensione, spingere la punta della pipetta contro il fondo del tubo per interrompere meccanicamente i pezzi muscolari. Procedere al passaggio 3.9.
8. Se i muscoli TA sono stati raccolti, procedere come segue:
   1. Dopo 1 ora, rimuovere il tubo dallo shaker e riempirli a 15 ml con WM. Capovolgere delicatamente un paio di volte per garantire la miscelazione.
   2. Centrifugare le celle in un rotore a benna oscillante a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire 13 mL di surnatante in un nuovo tubo da 15 mL e lasciare ~2 mL nel tubo originale.
      1. Riempire la nuova provetta contenente 13 mL di surnatante fino a 15 mL con WM. Centrifugare nuovamente le celle in un rotore a benna oscillante a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Aspirare tutto il surnatante e mantenere il pellet sul ghiaccio.
   3. Utilizzando una punta per pipetta da 1000 μL, risospendere il pellet nel tubo originale su e giù senza intasarsi.
   4. Aggiungere 1 mL di brodo di collagenasi II e 1 mL di brodo di dispase nel tubo originale contenente 2 mL di MDB e riempire fino a 10 mL con WM. Procedere al passaggio 3.9.
9. Sigillare i tubi con pellicola da laboratorio e incubare in bagnomaria a 37 °C con agitazione (75 rpm) per 30 min. Posizionare i tubi come al punto 3.5.

4. Generazione di cellule mononucleate

NOTA: Se si lavora con muscoli TA raccolti in un tubo conico da 15 ml, trasferire la sospensione in un tubo conico da 50 ml prima di procedere con il punto 4.1.

1. Dopo 30 minuti, rimuovere il tubo dall'agitatore. Aspirare ed espellere la sospensione muscolare attraverso una siringa da 10 mL con un ago da 20 G con successo 10 volte.
   NOTA: Espellere la sospensione muscolare verso la parete del tubo per evitare bolle e schiuma. Piccoli pezzi di tendini o cartilagini non digeriti potrebbero ostruire l'ago durante i primi cicli di aspirazione. Se si verifica l'intasamento, utilizzare una pinza sterile per rimuovere l'intasamento dalla punta dell'ago.
2. Riempire ogni tubo fino a 50 ml con WM e capovolgere delicatamente un paio di volte per garantire la miscelazione.
3. Centrifugare le celle in un rotore a benna oscillante a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta (~42 ml) e lasciare ~8 mL nel tubo originale.
   1. Riempire la nuova provetta contenente 42 mL di surnatante fino a 50 mL con WM. Centrifugare nuovamente le celle in un rotore a benna oscillante a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Aspirare tutto il surnatante e mantenere il pellet sul ghiaccio.
4. Posizionare un filtro cellulare in nylon da 40 μm nel tubo conico originale da 50 mL contenente 8 mL di WM e pre-bagnare il filtro cellulare con 1-2 mL di WM.
5. Mentre si tiene il filtro a celle di nylon da 40 μm, utilizzare una pipetta da 10 ml per risospendere delicatamente il pellet 5-10 volte. Filtrare i pellet attraverso il filtro cellulare nello stesso tubo per ridurre al minimo la perdita di cellule.
6. A questo punto, assicurarsi che ci siano tubi aggiuntivi con pellet di celle sul ghiaccio. Filtrare quei pellet nel tubo originale aggiungendo 4-5 ml di WM a ciascun tubo per risospendere i pellet e trasferire la soluzione al filtro cellulare posizionato nel tubo originale. Consentire il filtraggio per gravità.
7. Dopo aver raccolto tutti i pellet nel tubo conico originale da 50 ml, sciacquare il filtro cellulare con altri 4-5 ml di WM. Utilizzare una pipetta da 1000 μL per raccogliere tutto il liquido dalla parte inferiore del filtro cellulare.
8. Riempire ogni tubo con WM fino a 50 ml e capovolgere delicatamente un paio di volte per garantire la miscelazione.
9. Centrifugare le celle in un rotore a benna oscillante a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare immediatamente tutto il surnatante dopo la centrifugazione senza disturbare il pellet.
10. Risospendere il pellet in 600 μL di WM e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 2 ml.

5. Colorazione anticorpale per citometria a flusso

NOTA: Per ogni esperimento, impostare i seguenti controlli: i) controllo non colorato, ii) controllo di vitalità per selezionare la popolazione di cellule vive, iii) controlli di compensazione a singola colorazione per correggere lo spillover dell'emissione di fluorocromo e iv) controlli di fluorescenza meno uno (FMO) per impostare i limiti di gating tenendo conto della diffusione dello spillover. Fare riferimento alla Tabella 1 per un elenco completo dei controlli di colorazione.

1. Per preparare il controllo non colorato, trasferire 10 μL della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente 190 μL di WM. Risospendere la sospensione cellulare e filtrare attraverso un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL con un tappo filtrante da 35 μm. Lasciare filtrare la sospensione per gravità.
2. Utilizzare una pipetta da 200 μL per raccogliere tutto il liquido dalla parte inferiore del filtro cellulare. Sigillare con un cappuccio e lasciarlo sul ghiaccio, al riparo dalla luce.
3. Preparare controlli di vitalità, FMO e singola colorazione: etichettare 10 provette da microcentrifuga da 2 ml e aggiungere 190 μL di WM in ciascuna provetta e 10 μL di sospensione cellulare. Fare riferimento alla Tabella 1 per un elenco completo dei controlli. Aggiungere anticorpi al tubo appropriato a seconda del controllo sperimentale. Fare riferimento alla Tabella 1 per informazioni riguardanti la combinazione e la concentrazione di anticorpi.
4. Trasferire il resto della sospensione cellulare (500 μL) in una provetta da microcentrifuga da 2 mL (provetta sperimentale) e aggiungere i seguenti anticorpi: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pacific Blue, VCAM-1-biotina e α7-integrina-PE. Fare riferimento alla Tabella 1 per informazioni riguardanti la combinazione e la concentrazione di anticorpi.
5. Mescolare delicatamente bene ogni tubo per garantire una distribuzione uniforme e incubare le cellule in uno shaker rotante a 4 °C per 45 minuti al riparo dalla luce.
6. Dopo 45 minuti, riempire tutti i tubi di microcentrifuga fino a 2 ml con WM. Capovolgere delicatamente i tubi un paio di volte per garantire una miscelazione completa. Centrifugare i tubi in una centrifuga refrigerata con rotore ad angolo fisso a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet.
7. Risospendere le cellule in tutte le provette di microcentrifuga in 300 μL di WM.
8. Aggiungere l'anticorpo streptavidina in tubi appropriati. Fare riferimento alla Tabella 1 per informazioni riguardanti la combinazione e la concentrazione di anticorpi. Mescolare delicatamente bene ogni tubo per garantire una distribuzione uniforme e incubare le cellule in uno shaker rotante a 4 °C per 20 minuti al riparo dalla luce. Lasciare i tubi rimanenti sul ghiaccio, al riparo dalla luce.
9. Dopo 20 minuti, riempire le provette di microcentrifuga contenenti anticorpi streptavidina a 2 ml con WM. Capovolgere delicatamente i tubi alcune volte per garantire una miscelazione completa. Centrifugare i tubi in una centrifuga refrigerata con rotore ad angolo fisso a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare completamente il surnatante e risospendere le cellule in 300 μL di WM.
10. Pre-bagnare il tappo del filtro cellulare da 35 μm di 10 tubi a fondo tondo in polistirene da 5 mL con 200 μL di WM. Filtrare le celle dai tubi di controllo attraverso gli appositi tubi a fondo tondo in polistirene da 5 ml. Utilizzare una pipetta da 200 μL per raccogliere tutto il liquido dalla parte inferiore del filtro cellulare. Sigillare con tappi, lasciare i tubi sul ghiaccio e proteggerli dalla luce.
11. Risospendere le celle nel tubo sperimentale con ulteriori 200 μL di WM per un totale di 500 μL di WM. Pre-bagnare un tappo del filtro cellulare di un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL con 200 μL di WM. Trasferire la sospensione cellulare dal tubo sperimentale nel tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL e lasciarlo filtrare per gravità.
12. Risciacquare la provetta da 2 mL di microcentrifuga contenente la sospensione del campione sperimentale con 300 μL di WM e farla passare attraverso lo stesso tappo del filtro. Utilizzare una pipetta da 200 μL per raccogliere tutto il liquido dalla parte inferiore del filtro cellulare. Sigillare con un cappuccio, lasciare i tubi sul ghiaccio e proteggerli dalla luce.
    NOTA: Se si verifica l'intasamento del tappo del filtro cellulare da 35 μm, picchiettare delicatamente il tubo sul banco per facilitare il flusso attraverso.
13. Preparare ed etichettare i tubi di raccolta per FAP e MuSC. Se si isolano le cellule da interi muscoli degli arti posteriori, ordinare le cellule in tubi a fondo tondo in polipropilene da 5 ml con un massimo di 1 ml di terreno di coltura FAP o MuSCs integrato con 2x siero. Se si isolano le cellule dai muscoli TA, ordinare FAP e MuSC in provette da microcentrifuga da 2 ml contenenti fino a 400 μL di terreno di coltura integrato con siero 2x.

6. Selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS)

NOTA: Questo protocollo utilizza un citometro a flusso di ricerca da banco compatto dotato di un ugello da 100 μm e caratterizzato da una configurazione a tre laser (488 nm, 640 nm, 405 nm) con la capacità di analizzare fino a nove diversi fluorocromi (11 parametri inclusi la dispersione diretta e laterale). I fluorocromi utilizzati in questo protocollo e i relativi filtri passa-banda del rivelatore sono i seguenti: PE 586/42; PE-Cy7 783/56; APC 660/10; Blu Pacifico 448/45; 7-amminoactinomicina D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. Le cellule vengono ordinate a 4 °C e rimangono sul ghiaccio seguendo l'ordinamento. Prima di utilizzare questo strumento, assicurarsi che l'utente sia adeguatamente formato da uno specialista di applicazioni tecniche.

1. Configurazione e controllo delle prestazioni dello smistatore di celle in base alle specifiche del produttore.
2. Impostare una strategia di gating gerarchica per identificare FAP e MuSC (Figura 2).
   1. Isolare i FAP in base al seguente schema: i) area di dispersione delle cellule dirette vs area di dispersione delle cellule laterali (FSC-A vs. SSC-A) per separare le celle rispetto ai detriti, ii) altezza di dispersione delle celle laterali vs larghezza di dispersione delle cellule laterali (SSC-H vs. SSC-W) per discriminare i singoletti dai doppietti nell'intervallo SSC, iii) altezza di dispersione della cella diretta vs larghezza di dispersione della cella diretta (FSC-H vs. FSC-W) per discriminare i singoletti dai doppietti nell'intervallo FSC, e iv) area 7-AAD vs SSC-A per distinguere le cellule vive da quelle morte.
      1. Se si isolano le FAP attraverso il metodo basato sugli anticorpi, utilizzare il seguente schema: v) area APC-CD45/CD31 vs area Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) per escludere le cellule CD31+ e CD45+ da ulteriori analisi e vi) area PE-Cy7-VCAM-1 vs area PE-α7-Integrina dalla popolazione CD31-/CD45-/Sca1+ per distinguere le FAP. I FAP sono identificati come eventi CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-.
      2. Se si isolano le FAP attraverso il metodo del reporter GFP endogeno, utilizzare il seguente schema: v) Area APC-CD45/CD31 vs area GFP-PDGFRα per escludere le cellule CD31+ e CD45+ da ulteriori analisi e isolare le cellule GFP+. I FAP sono identificati come eventi CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-.
   2. Isolare i MuSC in base al seguente schema: i) area di dispersione delle cellule dirette vs area di dispersione delle cellule laterali (FSC-A vs. SSC-A) per separare le celle rispetto ai detriti, ii) altezza di dispersione delle celle laterali vs larghezza di dispersione delle celle laterali (SSC-H vs. SSC-W) per discriminare i singoletti dai doppietti nell'intervallo SSC, iii) altezza di dispersione della cella diretta vs larghezza di dispersione della cella diretta (FSC-H vs. FSC-W) per discriminare i singoletti dai doppietti nell'intervallo FSC, iv) area 7-AAD vs SSC-A per distinguere le cellule vive da quelle morte, v) area APC-CD45/CD31 vs area Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) per escludere le cellule CD31+ e CD45+ da ulteriori analisi e vi) area PE-Cy7-VCAM-1 vs area PE-α7-Integrina dalla popolazione CD31-/CD45-/Sca1- per distinguere i MuSC. Le MuSC sono identificate come eventi CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+.
3. Eseguire il controllo non colorato e il controllo di vitalità per garantire che la popolazione cellulare sia posizionata correttamente nel grafico SSC-A vs FSC-A e per il gate corretto su singole celle vive.
4. Acquisisci tutti i controlli a singola macchia e genera la matrice di compensazione dello spillover.
5. Eseguire tutti i controlli FMO e determinare il punto di interruzione tra la diffusione della fluorescenza di fondo e la popolazione colorata positivamente.
6. Circa 5-10 minuti prima dell'acquisizione del campione sperimentale, aggiungere il colorante di vitalità 7-AAD e mescolare delicatamente.
7. Una volta che tutti i controlli sono stati elaborati, impostare le porte di smistamento in conformità con i controlli FMO; acquisire e ordinare i campioni sperimentali.
8. Dopo che tutti i campioni sono stati elaborati, pulire il citometro secondo le specifiche del produttore. Esportare tutti i dati .fcs per l'analisi.

7. Cultura dei FAP e dei MuSC

NOTA: Le cellule selezionate devono essere coltivate immediatamente dopo la selezione, in un mezzo appropriato su piastre rivestite di collagene I.

1. Centrifugare i tubi di raccolta in un rotore ad angolo fisso a 250 x g per 5 minuti a 4 °C.
2. Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
3. Per la coltura di MuSC, risospendere le cellule in un volume appropriato di terreno di coltura MuSC e incubarle in condizioni standard a 37 °C e 5% di CO₂.
   1. Placcare MuSC appena isolati a una densità di 20.000 cellule/cm 2 e MuSC attivati ad una densità di 15.000 cellule/cm².
   2. Dopo la placcatura, le cellule appaiono piccole, sferiche e traslucide. Entro 36 ore, i MuSC aderiscono alla superficie della piastra e aumentano lentamente le loro dimensioni per le prime 48 ore.
   3. Sostituire il mezzo ogni 2 giorni.
      NOTA: I MuSC sono molto sensibili alla densità cellulare. Per mantenere i MuSC nel loro stato proliferante, coltivarli fino a quando non sono confluenti al 60% -70%. Passare le cellule in nuovi piatti o piatti rivestiti di collagene I e aggiungere nuovo terreno fresco ogni 2 giorni. Se i MuSC vengono tenuti nello stesso piatto o piatto per più di 3-4 giorni, acquisiranno una forma allungata e si allineeranno con le cellule vicine fino a fondersi insieme.
4. Per la coltura di FAP, risospendere le cellule in un volume appropriato di terreno di coltura MuSC e incubarle in condizioni standard a 37 °C e 5% di CO₂.
   1. Placcare i FAP isolati dal muscolo imperturbato ad una densità di 15.000 cellule/cm 2 e i FAP isolati dal muscolo leso a 9.000 cellule/cm².
      NOTA: Dopo la placcatura, i FAP aderiscono completamente alla superficie della piastra entro 48 ore, mentre i FAP attivati si attaccano alla piastra entro poche ore. Una volta attaccati, i FAP acquisiscono la loro forma caratteristica, con un corpo a piccole cellule e processi cellulari allungati, e proliferano rapidamente.
   2. Sostituire il mezzo ogni 2 giorni.
      NOTA: I FAP sono molto sensibili alla densità cellulare. La semina di FAP a basse densità può portare a una scarsa crescita cellulare e alla morte cellulare. Al contrario, la placcatura di FAP ad alta densità di semina aumenterà la sopravvivenza cellulare e migliorerà la loro espansione. Le FAP derivanti dal muscolo danneggiato di solito richiedono una densità cellulare inferiore rispetto al muscolo non danneggiato, poiché sono già attivate. Si raccomanda di regolare la densità di placcatura FAP in base alle proprie condizioni sperimentali e alla fonte dei campioni.
5. Per la cocultura, risospendere FAP e MuSC nel mezzo di cocoltura con un rapporto di 1:1 e incubare quelli in condizioni standard a 37 °C e 5% di CO₂. Lasciare che le cellule si attacchino per 48 ore e sostituire il mezzo ogni 2 giorni.

8. Analisi di immunofluorescenza di FAP e MuSCs in coltura

1. Aspirare il mezzo cellulare ed eseguire due o tre lavaggi con 1x PBS.
2. Fissare le cellule con paraformaldeide (PFA) al 2% in 1x PBS per 15 minuti a RT.
3. Aspirare il 2% di PFA e lavare rapidamente le cellule due o tre volte con 1x PBS.
4. Eseguire la permeabilizzazione e il blocco cellulare:
   1. Per l'immunocolorazione di FAP appena isolati, eseguire la permeabilizzazione e il blocco cellulare incubando cellule con 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST) + 1% albumina sierica bovina (BSA) + 5% siero d'asina normale (NDS) per 30 minuti a RT.
   2. Per l'immunocolorazione di MuSC appena isolate, eseguire la permeabilizzazione e il blocco cellulare incubando cellule con PBST + 1% BSA + 5% siero di capra normale (NGS) per 30 minuti a RT.
5. Applicare anticorpi primari:
   1. Per l'immunocolorazione di FAP appena isolate, applicare l'anticorpo primario anti PDGFRα di capra (1:300) diluito in PBST + 1% BSA + 5% NDS durante la notte a 4 °C.
   2. Per l'immunocolorazione di MuSC appena isolati, applicare l'anticorpo primario anti-Pax7 del topo (1:10) diluito in PBST + 1% BSA + 5% NGS per 45 minuti a RT.
6. Lavare le cellule due o tre volte con 1x PBS per rimuovere la soluzione anticorpale primaria.
7. Applicare anticorpi secondari:
   1. Per l'immunocolorazione di FAP appena isolati, applicare l'anticorpo secondario Alexa Fluor 488 anticorpo secondario IgG (H + L) Alexa Fluor 488 (1:500) diluito in PBST + 1% BSA per 1 ora a RT.
   2. Per l'immunocolorazione di MuSC appena isolate, applicare l'anticorpo secondario IgG 1 Alexa Fluor 555 (1:500) diluito in PBST +₁ % BSA per 45 minuti a RT.
8. Lavare le cellule due o tre volte con 1x PBS per rimuovere la soluzione anticorpale primaria.
9. Eseguire la controcolorazione nucleare incubando cellule con DAPI in PBST (1:1000) per 5 minuti a RT.
10. Lavare le celle tre volte con 1x PBS per rimuovere la soluzione DAPI.
    ATTENZIONE: DAPI è tossico e pericoloso; maneggiarlo con cura e smaltirlo nella bottiglia dei rifiuti pericolosi.
11. Conservare le celle a 4 °C al riparo dalla luce.

Risultati

Questo protocollo consente l'isolamento di circa un milione di FAP e fino a 350.000 MuSC dagli arti posteriori illesi di topi adulti wild-type (3-6 mesi), corrispondente a una resa dell'8% per le FAP e del 3% per le MuSC degli eventi totali. Quando si selezionano le cellule dal TA danneggiato 7 giorni dopo l'infortunio, vengono raggruppati da due a tre muscoli TA per ottenere fino a 300.000 FAP e 120.000 MuSC, che corrispondono a una resa rispettivamente dell'11% e del 4%. I valori di purezza post-ordinamento sono genera...

Discussione

Stabilire protocolli efficienti e riproducibili per l'identificazione e l'isolamento di popolazioni di cellule staminali adulte pure è il primo e più critico passo verso la comprensione della loro funzione. Le FAP e le MuSC isolate possono essere utilizzate per condurre analisi multiomiche in esperimenti di trapianto come potenziale trattamento per le malattie muscolari o possono essere geneticamente modificate per la modellizzazione della malattia nella terapia con cellule staminali.

Il pr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	Falcon	352235
20 G BD Needle 1 in. single use, sterile	BD Biosciences	305175
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)	The University of British Columbia	53-0010-01
APC anti-mouse CD31 Antibody	BioLegend	102510
APC anti-mouse CD45 Antibody	BioLegend	103112
BD FACSMelody Cell Sorter	BD Biosciences
BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL	BD Biosciences	309604
Biotin anti-mouse CD106 Antibody	BioLegend	105703
C57BL/6J  mouse (Female and Male)	The Jackson Laboratory	000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse	The Jackson Laboratory	007669
Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356400
Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356500
Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate	Corning	356408
DAPI Solution (1 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	62248
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile	VWR	414004-265
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11055
Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile	Corning	352340
Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile	Corning	353002
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL	VWR	352196
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL	Corning	352070
Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning	VWR	60819-728
Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning	VWR	21008-948
Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)	Promega	G5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, powder	ThermoFisher Scientific	17101015
Gibco Dispase, powder	ThermoFisher Scientific	17105041
Gibco DMEM, high glucose, HEPES	ThermoFisher Scientific	12430054
Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States	ThermoFisher Scientific	16000044
Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix	ThermoFisher Scientific	11550043
Gibco Horse Serum, New Zealand origin	ThermoFisher Scientific	16050122
Gibco PBS, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Gibco PBS (10x), pH 7.4	ThermoFisher Scientific	70011044
Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	ThermoFisher Scientific	10378016
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21127
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools Inc	14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)	ThermoFisher Scientific	A1310
Mouse PDGF R alpha Antibody	R&D Systems	AF1062
Normal Donkey Serum	Fisher Scientific	NC9624464
Normal Goat Serum	ThermoFisher Scientific	31872
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody	BioLegend	108120
Paraformaldehyde, 16%	Fisher Scientific	NCC0528893
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)	Developmental Study Hybridoma Bank	N/A
PE/Cyanine7 Streptavidin	BioLegend	405206
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools Inc	91500-09
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools Inc	91150-20
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787