JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Точная идентификация фибро-адипогенных клеток-предшественников (FAPs) и мышечных стволовых клеток (MuSC) имеет решающее значение для изучения их биологической функции в физиологических и патологических состояниях. Этот протокол содержит рекомендации по выделению, очистке и культивированию ФАПов и MUSC из мышц взрослых мышей.

Аннотация

Фибро-адипогенные клетки-предшественники (ФАП) представляют собой популяцию скелетных мышечных мезенхимальных стромальных клеток (МСК), способных дифференцироваться по фиброгенной, адипогенной, остеогенной или хондрогенной линии. Вместе с мышечными стволовыми клетками (MuSC) FAP играют решающую роль в гомеостазе мышц, восстановлении и регенерации, активно поддерживая и реконструируя внеклеточный матрикс (ECM). При патологических состояниях, таких как хронические повреждения и мышечные дистрофии, ФАП подвергаются аберрантной активации и дифференцируются в коллаген-продуцирующие фибробласты и адипоциты, что приводит к фиброзу и внутримышечной жировой инфильтрации. Таким образом, ФАП играют двойную роль в регенерации мышц, либо поддерживая оборот MuSC и способствуя восстановлению тканей, либо способствуя образованию фиброзных рубцов и внематочных жировых инфильтратов, которые ставят под угрозу целостность и функцию скелетной мышечной ткани. Правильная очистка ФАПов и MuSC является необходимым условием для понимания биологической роли этих клеток как в физиологических, так и в патологических состояниях. Здесь мы описываем стандартизированный метод одновременного выделения FAP и MuSC из мышц конечностей взрослых мышей с использованием флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Протокол подробно описывает механическую и ферментативную диссоциацию мононуклеарных клеток из целых мышц конечностей и травмированных передних (ТА) мышц большеберцовой кости. FAP и MuSC впоследствии изолируются с помощью полуавтоматического клеточного сортировщика для получения чистых клеточных популяций. Дополнительно описан оптимизированный метод культивирования покоящихся и активированных ФАПов и MUSC, либо отдельно, либо в условиях кокультуры.

Введение

Скелетная мышца является самой большой тканью в организме, на которую приходится ~ 40% веса взрослого человека, и отвечает за поддержание осанки, создание движения, регулирование базального энергетического обмена и температуры тела1. Скелетные мышцы являются очень динамичной тканью и обладают замечательной способностью адаптироваться к различным раздражителям, таким как механическое напряжение, метаболические изменения и ежедневные факторы окружающей среды. Кроме того, скелетная мышца регенерирует в ответ на острую травму, что приводит к полному восстановлению ее морфологии и функций2. Пластичность скелетных мышц в основном зависит от популяции резидентных мышечных стволовых клеток (MuSC), также называемых сателлитными клетками, которые расположены между плазматической мембраной миофибры и базальной пластинкой 2,3. В нормальных условиях MuSC находятся в мышечной нише в состоянии покоя, с несколькими делениями, чтобы компенсировать клеточный оборот и пополнить пул стволовых клеток4. В ответ на травму MuSC входят в клеточный цикл, размножаются и либо способствуют образованию новых мышечных волокон, либо возвращаются в нишу в процессе самообновления 2,3. В дополнение к MuSC, гомеостатическое поддержание и регенерация скелетных мышц полагаются на поддержку популяции мышечных резидентных клеток, называемых фибро-адипогенными предшественниками (FAPs)5,6,7. ФАП представляют собой мезенхимальные стромальные клетки, встроенные в мышечную соединительную ткань и способные дифференцироваться по фиброгенной, адипогенной, остеогенной или хондрогенной линии 5,8,9,10. FAP обеспечивают структурную поддержку MuSC, поскольку они являются источником белков внеклеточного матрикса в нише мышечных стволовых клеток. FAP также способствуют долгосрочному поддержанию скелетных мышц путем секреции цитокинов и факторов роста, которые обеспечивают трофическую поддержку миогенеза и роста мышц 6,11. При остром мышечном повреждении ФАП быстро размножаются, образуя переходную нишу, которая поддерживает структурную целостность регенерирующей мышцы и обеспечивает благоприятную среду для поддержания пролиферации и дифференцировки MUSC паракринным способом5. По мере продолжения регенерации ФАПы очищаются от регенеративной мышцы апоптозом, и их количество постепенно возвращается к базальному уровню12. Однако в условиях, благоприятствующих хроническому повреждению мышц, FAP перекрывают проапоптотическую сигнализацию и накапливаются в мышечной нише, где они дифференцируются в коллаген-продуцирующие фибробласты и адипоциты, что приводит к инфильтратам эктопического жира и образованию фиброзных рубцов12,13.

Из-за их мультипотентности и регенеративных способностей FAP и MuSC были идентифицированы как перспективные мишени в регенеративной медицине для лечения заболеваний скелетных мышц. Поэтому для исследования их функции и терапевтического потенциала важно установить эффективные и воспроизводимые протоколы для выделения и культивирования ФАПов и MUSC.

Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) может идентифицировать различные клеточные популяции на основе морфологических характеристик, таких как размер и гранулярность, и позволяет выделять специфические клетки на основе использования антител, направленных против маркеров клеточной поверхности. У взрослых мышей MuSC экспрессируют молекулу адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM-1, также известную как CD106)14,15 и α7-интегрин15, в то время как FAP экспрессируют рецептор фактора роста тромбоцитов α (PDGFRα) и антиген стволовых клеток 1 (Sca1 или Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . В описанном здесь протоколе MuSC были идентифицированы как CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, в то время как FAP были идентифицированы как CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Альтернативно, мыши PDGFRαEGFP использовали для выделения FAP как CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-events18,19. Кроме того, мы сравнили перекрытие между флуоресцентным сигналом клеток PDGFRα-GFP+ с клетками, идентифицированными поверхностным маркером Sca1. Наш анализ показал, что все GFP-экспрессирующие клетки также были положительными для Sca1, что указывает на то, что любой подход может быть использован для идентификации и изоляции FAP. Наконец, окрашивание специфическими маркерными антителами подтвердило чистоту каждой клеточной популяции.

протокол

Все проведенные эксперименты на животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию (ACUC) Национального института артрита, опорно-двигательного аппарата и кожных заболеваний (NIAMS). Исследователи, выполняющие этот протокол, должны придерживаться своих местных руководящих принципов этики животных.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подробно описывает, как изолировать FAP и MuSC из задних конечностей и поврежденных передних мышц большеберцовой кости (TA) взрослых самцов и самок мышей (3-6 месяцев) и содержит рекомендации по кокультурированию FAP и MuSC. Обзор экспериментальной процедуры показан на рисунке 1. Все этапы этого протокола должны выполняться в стерильных условиях и при комнатной температуре (RT), если не указано иное.

1. Установка реагентов

  1. Моющая среда (WM): Приготовьте этот раствор, добавив 10% (об./об.) конскую сыворотку и 1x пенициллин/стрептомицин в клеточную среду F-10 Nutrient Mix Ham. WM можно приготовить заранее и хранить при температуре 4 °C.
  2. Буфер диссоциации мышц (MDB): Подготовьте этот буфер, растворив коллагеназу II в WM. При сборе целых мышц задних конечностей растворите 1000 Ед/мл коллагеназы II в 10 мл WM для каждой мыши (для подготовки в коническую трубку объемом 50 мл). При сборе та-мышц растворяют 800 ЕД/мл коллагеназы II в 7 мл WM для каждой мыши (для подготовки в коническую трубку объемом 15 мл). Для мышц ТА это поможет лучше визуализировать клеточные гранулы и получить более высокий выход ФАПов и MuSC. Подготовьте MDB свежим перед сбором мышц и держите его на льду до тех пор, пока это не понадобится.
  3. Запас раствора коллагеназы II: Приготовьте этот раствор, растворив коллагеназу II в стерильном 1x фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS) до конечной концентрации 1000 Ед/мл. Процедите раствор через шприцевой фильтр 0,45 мкм и аликвоту в запасы по 1 мл. Хранить раствор при температуре -20 °C.
  4. Запас раствора диспазы: приготовьте этот раствор, растворив Диспазу в стерильном 1x PBS до конечной концентрации 11 Ед/мл. Процедите раствор через шприцевой фильтр 0,45 мкм и аликвоту в запасы по 1 мл. Хранить раствор при температуре -20 °C.
  5. Приготовьте культуральную среду FAP, дополнив DMEM 10% (об./об.) фетальной бычьей сывороткой, 1x пенициллином/стрептомицином и 2,5 нг/мл FGF. Храните среду при температуре 4 °C.
  6. Приготовьте культуральную среду MuSC, дополняющую F10 с 10% (об/об)) конской сывороткой, 1x пенициллином/стрептомицином и 2,5 нг/мл FGF. Храните среду при температуре 4 °C.
  7. Приготовьте кокультурную среду, добавив DMEM с 10% (об./об.) фетальной бычьей сывороткой, 10% (об/об)) конской сывороткой, 1x пенициллином/стрептомицином и 2,5 нг/мл FGF. Храните среду при температуре 4 °C.

2. Сбор мышц задних конечностей

  1. Добавьте 2-3 мл WM в блюдо размером 6 см (по одному блюду на мышь) и положите на лед.
  2. Выполняют эвтаназию путем асфиксии: помещают мышь в камеруСО2 и вводят 100%СО2. Используйте вывих шейки матки для подтверждения смерти.
  3. Поместите мышь лежа на спине на подушечку для рассечения и распылите на нее 70% (об/об)этанола, чтобы избежать загрязнения.
  4. Используйте щипцы, чтобы зажать центр кожи живота мыши и вырезать отверстие ~ 1 см по горизонтали. Захватите края раны и стол в мыши, потянув отверстие в противоположных направлениях, чтобы раскрыть мышцы под ним. Обнажите одну сторону задней конечности мыши в то время.
  5. Перед сбором мышц удалите межмышечный жир между подколенными сухожилиями и проксимальным концом квадрицепсов. Это улучшит изоляцию FAP и MuSC.
  6. Не повреждая ткань, используйте острые щипцы, чтобы сломать и отклеить фасцию, чтобы обнажить нижнюю часть ТА и разгибать мышцы digitorum longus (EDL). Запустите острый кончик щипцов под мышцами TA / EDL, чтобы отделить мышцы от большеберцовой кости.
  7. Отрежьте сухожилия, прикрепляющие TA/EDL к лодыжке, и, удерживая его щипцами, обрежьте мышцы ножницами вдоль продольной линии TA/EDL. Обрежьте сухожилия вокруг колена, чтобы отделить все мышцы TA / EDL. Поместите мышцы в 6 см блюдо, хранящееся на льду.
  8. Приступайте к изоляции икроножных и камбаловидных мышц, разрезая все сухожилия на лодыжке и отделяя мышцы от большеберцовой и малоберцовой костей. Обрежьте вокруг колена и переведите мышцы на блюдо длиной 6 см.
  9. Очистите фасцию вокруг квадрицепсов и отделите ее от бедренной кости, проведя острым кончиком щипцов между мышцей и костью. Отрежьте сухожилия вокруг колена и, удерживая квадрицепсы щипцами на дистальном конце, обрежьте остальную часть мышцы, разрезав вдоль бедренной кости. Поместите мышцы в блюдо размером 6 см.
  10. Отсоедините подколенные сухожилия и оставшиеся мышцы вокруг бедренной кости и перенесите их на 6 см. Соберите мышцы задних конечностей в 6 см блюдо, хранящееся на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повреждения кровеносных сосудов, когда это возможно, чтобы предотвратить образование сгустков крови, которые могут помешать изоляции вниз по течению. При возникновении кровотечения немедленно промокните иссеченный сосуд стерильной марлей, чтобы впитать кровь.
  11. Соберите TA, EDL, икроножную мышцу, камбалу, квадрицепс и подколенное сухожилие из контралатеральной конечности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При изоляции всех мышц задних конечностей не объединяйте двух или более мышей. При изоляции мышц ТА можно объединить до трех мышц ТА.

3. Механическое и ферментативное переваривание мышц

  1. Аспирируйте WM из тарелки 6 см и добавьте 1-2 мл MDB, чтобы сохранить мышцы влажными.
  2. Тщательно измельчите мышцы до получения суспензионной пасты из хорошо измельченной ткани. Для этого используйте щипцы, чтобы удерживать один конец куска мышцы, затем используйте скальпель, чтобы разорвать и разрезать мышцу до тех пор, пока она не станет менее напряженной.
  3. Используя ножницы, продолжайте разрезать мышцу на мелкие кусочки в течение 1-2 мин. Повторяйте этот шаг для каждой группы мышц до получения хорошо измельченного мышечного осадка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важный шаг для максимизации выхода FAP и MuSC. Рекомендуется потратить 8-10 мин (4-5 мин, если изолируют только мышцы ТА) на этом этапе, чтобы обеспечить правильное измельчение мышц.
  4. Перенесите измельченные мышцы от каждой мыши к конической трубке, содержащей MDB.
  5. Запечатайте пробирки лабораторной пленкой и инкубируйте на водяной бане при температуре 37 °C с перемешиванием (75 об/мин) в течение 1 ч. Поместите трубы горизонтально вдоль траектории встряхивания и используйте грузы, чтобы держать трубы погруженными в воду.
  6. Разморозьте 1 мл коллагеназы II и 1 мл диспазы на мышь. Перед использованием раскрутите запас диспазы в качающемся роторе ковша при 10 000 х г в течение 1 мин при 4 °C. Используйте только супернатант.
  7. Если были собраны целые мышцы задних конечностей, действуйте следующим образом:
    1. Через 1 ч извлеките тюбик из шейкера и заполните его до 50 мл WM. Аккуратно переверните пару раз, чтобы обеспечить перемешивание.
    2. Центрифугируйте ячейки в качающемся роторе ковша при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Переложите 42 мл супернатанта в две новые трубки (~ 21 мл в каждой пробирке) и оставьте ~ 8 мл в исходной трубке.
      1. Заполните новые трубки, содержащие 21 мл супернатанта до 50 мл, WM. Центрифугируйте ячейки снова в качающемся роторе ковша при 350 х г в течение 8 мин при 4 °C. Аспирируйте все супернатанты и держите гранулы на льду.
    3. Добавьте 1 мл коллагеназы II и 1 мл диспазы в оригинальную трубку, содержащую ~8 мл MDB.
    4. Используя серологическую пипетку объемом 5 мл, повторно суспендируйте гранулу 10 раз без засорения. Выталкивайте раствор к стенке трубки, избегая образования пузырьков. Если засорение происходит во время повторного суспензии, прижмите кончик пипетки к дну трубки, чтобы механически нарушить мышечные куски. Перейдите к шагу 3.9.
  8. Если та-мышцы были собраны, действуйте следующим образом:
    1. Через 1 ч извлеките трубку из шейкера и заполните их до 15 мл WM. Осторожно переверните пару раз, чтобы обеспечить перемешивание.
    2. Центрифугируйте ячейки в качающемся роторе ковша при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Переложите 13 мл супернатанта в одну новую трубку объемом 15 мл и оставьте ~ 2 мл в исходной трубке.
      1. Заполните новую трубку, содержащую 13 мл супернатанта до 15 мл, WM. Центрифугируйте ячейки снова в качающемся роторе ковша при 350 х г в течение 8 мин при 4 °C. Аспирируйте все супернатанты и держите гранулу на льду.
    3. Используя наконечник пипетки объемом 1000 мкл, повторно суспендируйте гранулу в исходной трубке вверх и вниз без засорения.
    4. Добавьте 1 мл коллагеназы II и 1 мл запаса диспазы в оригинальную трубку, содержащую 2 мл MDB, и заполните до 10 мл WM. Перейдите к шагу 3.9.
  9. Запечатайте пробирки лабораторной пленкой и инкубируйте на водяной бане при температуре 37 °C с перемешиванием (75 об/мин) в течение 30 мин. Поместите трубки, как показано на шаге 3.5.

4. Генерация моноядерных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с мышцами ТА, собранными в конической трубке объемом 15 мл, переведите суспензию в коническую трубку объемом 50 мл, прежде чем переходить к этапу 4.1.

  1. Через 30 мин выньте тюбик из шейкера. Аспирировать и выталкивать мышечную суспензию через шприц объемом 10 мл с иглой 20 г успешно 10 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выталкивайте мышечную суспензию к стенке трубки, чтобы избежать пузырьков и пенообразования. Небольшие кусочки непереваренных сухожилий или хрящей могут засорять иглу во время первых раундов аспирации. Если происходит засорение, используйте стерильные щипцы, чтобы удалить засор с кончика иглы.
  2. Наполните каждый тюбик до 50 мл WM и осторожно переверните пару раз, чтобы обеспечить перемешивание.
  3. Центрифугируйте ячейки в качающемся роторе ковша при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в новую трубку (~42 мл) и оставьте ~8 мл в исходной пробирке.
    1. Заполните новую трубку, содержащую 42 мл супернатанта до 50 мл, WM. Центрифугируйте ячейки снова в качающемся роторе ковша при 350 х г в течение 8 мин при 4 °C. Аспирируйте все супернатанты и держите гранулу на льду.
  4. Поместите нейлоновый клеточный сетчик размером 40 мкм в исходную коническую трубку объемом 50 мл, содержащую 8 мл WM, и предварительно смочите клеточный сетчатый фильтр 1-2 мл WM.
  5. Удерживая 40-мкм нейлоновый клеточный сетчатый фильтр, используйте пипетку объемом 10 мл, чтобы аккуратно повторно суспендировать гранулу 5-10 раз. Отфильтруйте гранулы через клеточный сетчатый фильтр обратно в ту же трубку, чтобы свести к минимуму потери клеток.
  6. На этом этапе убедитесь, что на льду есть дополнительные трубки с гранулами клеток. Отфильтруйте эти гранулы обратно в исходную трубку, добавив 4-5 мл WM в каждую трубку, чтобы повторно суспендировать гранулы и перенести раствор в клеточный сетчатый фильтр, расположенный в исходной трубке. Допускается фильтрация под действием силы тяжести.
  7. После сбора всех гранул в оригинальную коническую трубку объемом 50 мл промыть клеточный ситечко еще 4-5 мл WM. Используйте пипетку объемом 1000 мкл, чтобы собрать всю жидкость с нижней стороны клеточного ситечка.
  8. Наполните каждый тюбик WM до 50 мл и осторожно переверните пару раз, чтобы обеспечить перемешивание.
  9. Центрифугируйте ячейки в качающемся роторе ковша при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Немедленно аспирировать весь супернатант после центрифугирования, не нарушая гранулу.
  10. Повторно суспендировать гранулу в 600 мкл WM и перенести ее в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл.

5. Окрашивание антител для проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого эксперимента настройте следующие средства контроля: i) неиспорченный контроль, ii) контроль жизнеспособности для выбора популяции живых клеток, iii) контроль компенсации с одним окрашиванием для коррекции вторичных эффектов выбросов фторхрома и iv) контроль флуоресценции минус один (FMO) для установления границ затвора путем учета распространения вторичных эффектов. Полный список элементов управления окрашиванием приведен в таблице 1 .

  1. Для приготовления незапятнанного контроля переведите 10 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую 190 мкл WM. Повторно суспендируйте клеточную суспензию и фильтруйте через 5 мл полистирольной трубки с круглым дном с 35-мкм крышкой клеточного сетчатого фильтра. Позвольте суспензии фильтроваться под действием силы тяжести.
  2. Используйте пипетку объемом 200 мкл, чтобы собрать всю жидкость с нижней стороны клеточного ситечка. Запечатайте шляпкой и оставьте на льду, защищенном от света.
  3. Подготовьте жизнеспособность, FMO и одноокрашенные элементы управления: пометьте 10 2 мл микроцентрифужных пробирок и добавьте 190 мкл WM в каждую трубку и 10 мкл клеточной суспензии. Полный список элементов управления приведен в таблице 1 . Добавляют антитела в соответствующую трубку в зависимости от экспериментального контроля. Обратитесь к Таблице 1 для получения информации о комбинации и концентрации антител.
  4. Переместите остальную часть клеточной суспензии (500 мкл) в микроцентрифужную трубку (экспериментальную трубку) объемом 2 мл и добавьте следующие антитела: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pacific Blue, VCAM-1-биотин и α7-Integrin-PE. Обратитесь к Таблице 1 для получения информации о комбинации и концентрации антител.
  5. Аккуратно хорошо перемешайте каждую трубку, чтобы обеспечить равномерное распределение и инкубируйте клетки во вращающемся шейкере при 4 °C в течение 45 мин, защищенных от света.
  6. Через 45 мин заполните все микроцентрифужные трубки до 2 мл WM. Аккуратно переверните трубки пару раз, чтобы обеспечить полное перемешивание. Центрифугирование трубок в охлажденной центрифуге с неподвижным углом вращения при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу.
  7. Повторное суспендирование клеток во всех микроцентрифужных трубках в 300 мкл WM.
  8. Добавьте антитело к стрептавидину в соответствующие пробирки. Обратитесь к Таблице 1 для получения информации о комбинации и концентрации антител. Аккуратно перемешайте каждую трубку, чтобы обеспечить равномерное распределение и инкубируйте клетки во вращающемся шейкере при 4 °C в течение 20 мин, защищенных от света. Оставьте оставшиеся трубки на льду, защищенные от света.
  9. Через 20 мин заполните микроцентрифужные пробирки, содержащие антитело стрептавидина до 2 мл, WM. Осторожно переверните трубки несколько раз, чтобы обеспечить полное перемешивание. Центрифугирование трубок в охлажденной центрифуге с неподвижным углом вращения при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирировать супернатант полностью и повторно суспендировать клетки в 300 мкл WM.
  10. Предварительно смочите крышку сетчатого фильтра 35 мкм из 10 5 мл полистирольных трубок круглого дна с 200 мкл WM. Фильтрующие ячейки из контрольных трубок через соответствующие 5 мл полистирольных трубок с круглым дном. Используйте пипетку объемом 200 мкл, чтобы собрать всю жидкость с нижней стороны клеточного ситечка. Запечатайте колпачками, оставьте трубки на льду и защитите их от света.
  11. Повторно суспендируйте ячейки в экспериментальной трубке дополнительными 200 мкл WM в общей сложности 500 мкл WM. Предварительно смочите крышку клеточного сетчатого фильтра из 5 мл полистирольной трубки круглого дна с 200 мкл WM. Перенесите клеточную суспензию из экспериментальной трубки в 5 мл полистирольной трубки круглого дна и позвольте ей фильтровать под действием силы тяжести.
  12. Промыть микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую экспериментальный образец суспензии с 300 мкл WM, и пропустить ее через тот же колпачок сетчатого фильтра. Используйте пипетку объемом 200 мкл, чтобы собрать всю жидкость с нижней стороны клеточного ситечка. Запечатайте колпачком, оставьте трубки на льду и защитите их от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если происходит засорение крышки клеточного сетчатого фильтра размером 35 мкм, осторожно постучите по трубке на стенде, чтобы облегчить прохождение.
  13. Подготовьте и маркируйте коллекторные трубки для FAP и MuSC. При выделении клеток из целых мышц задних конечностей сортируют клетки в полипропиленовых трубках круглого дна объемом до 1 мл либо ФАПов, либо питательной среды MuSC, дополненной сывороткой 2x. При выделении клеток из та-мышц сортируют ФАП и MuSC в микроцентрифужных пробирках по 2 мл, содержащих до 400 мкл питательной среды, дополненной 2x сывороткой.

6. Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется компактный настольный исследовательский проточный цитометр, оснащенный соплом 100 мкм и имеющий трехлучевую конфигурацию (488 нм, 640 нм, 405 нм) с возможностью анализа до девяти различных фторхромов (11 параметров, включая прямой и боковой рассеяние). Фторхромы, используемые в этом протоколе, и связанные с ними полосовые фильтры детектора следующие: PE 586/42; ПЭ-Cy7 783/56; БТР 660/10; Тихоокеанский синий 448/45; 7-Аминоактиномицин D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. Ячейки сортируются при 4 °C и остаются на льду после сортировки. Перед эксплуатацией этого прибора убедитесь, что пользователь должным образом обучен специалистом по техническим приложениям.

  1. Настройка и проверка производительности сортировщика ячеек в соответствии со спецификациями производителя.
  2. Настройте иерархическую стратегию измерения для идентификации FAP и MuSC (рисунок 2).
    1. Изолируйте FAP на основе следующей схемы: i) область рассеяния прямых ячеек против области рассеяния боковых ячеек (FSC-A против SSC-A) для разделения ячеек против мусора, ii) высота рассеяния боковых ячеек против ширины рассеяния боковых ячеек (SSC-H против SSC-W) для различения синглетов от дублетов в диапазоне SSC, iii) высота рассеяния прямой ячейки против ширины рассеяния прямой ячейки (FSC-H против FSC-W) для различения синглетов от дублетов в диапазоне FSC, и iv) область 7-AAD и SSC-A для различения живых и мертвых клеток.
      1. При выделении ФАП методом на основе антител используйте следующую схему: v) область APC-CD45/CD31 против тихоокеанской области Blue-Ly-6A/E (Sca1) для исключения клеток CD31+ и CD45+ из дальнейшего анализа и vi) область PE-Cy7-VCAM-1 против области PE-α7-Integrin из популяции CD31-/CD45-/Sca1+ для различения FAPs. FAP идентифицируются как CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-события.
      2. При выделении ФАП эндогенным методом репортера GFP используют следующую схему: v) область APC-CD45/CD31 против области GFP-PDGFRα для исключения клеток CD31+ и CD45+ из дальнейшего анализа и выделения клеток GFP+. FAP идентифицируются как CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Интегрин-события.
    2. Изолируйте MuSC на основе следующей схемы: i) область рассеяния прямых ячеек против области рассеяния боковых ячеек (FSC-A против SSC-A) для разделения ячеек против мусора, ii) высота рассеяния боковых ячеек против ширины рассеяния боковых ячеек (SSC-H против SSC-W) для различения синглетов от дублетов в диапазоне SSC, iii) высота рассеяния прямой ячейки против ширины рассеяния прямых ячеек (FSC-H против FSC-W) для различения синглетов от дублетов в диапазоне FSC, iv) область 7-AAD против SSC-A для различения живых и мертвых клеток, v) область APC-CD45/CD31 против тихоокеанской области Blue-Ly-6A/E (Sca1) для исключения клеток CD31+ и CD45+ из дальнейшего анализа и vi) область PE-Cy7-VCAM-1 против области PE-α7-Integrin из популяции CD31-/CD45-/Sca1- для различения MuSC. MuSC идентифицируются как события CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+.
  3. Запустите незапятнанный контроль и контроль жизнеспособности, чтобы убедиться, что клеточная популяция правильно расположена на графике SSC-A против FSC-A и правильно включить живые одиночные клетки.
  4. Приобретите все элементы управления с одним окрашиванием и создайте матрицу компенсации побочных эффектов.
  5. Запустите все элементы управления FMO и определите точку отсечения между распространением фоновой флуоресценции и положительно окрашенной популяцией.
  6. Примерно за 5-10 мин до получения экспериментального образца добавляют краситель жизнеспособности 7-AAD и аккуратно перемешивают.
  7. После того, как все элементы управления будут обработаны, установите ворота сортировки в соответствии с элементами управления FMO; приобретать и сортировать экспериментальные образцы.
  8. После того, как все образцы были обработаны, очистите цитометр в соответствии со спецификацией производителя. Экспортируйте все данные .fcs для анализа.

7. Культура ФАПов и МУК

ПРИМЕЧАНИЕ: Отсортированные клетки следует культивировать сразу после сортировки, в соответствующей среде на коллагеновых пластинах, покрытых I.

  1. Центрифугируйте коллекторные трубки в роторе с фиксированным углом наклона при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  2. Аспирировать супернатант, не нарушая клеточную гранулу.
  3. Для культуры MuSC повторно суспендируют клетки в соответствующем объеме питательной среды MuSC и инкубируют их в стандартных условиях при 37 °C и 5% CO2.
    1. Пластинчатые свежеизолированные MuSC при плотности 20 000 клеток/см2 и активированные MuSC при плотности 15 000 клеток/см2.
    2. После покрытия клетки кажутся маленькими, сферическими и полупрозрачными. В течение 36 ч MuSC прилипают к поверхности пластины и медленно увеличивают свой размер в течение первых 48 ч.
    3. Заменяйте среду каждые 2 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MuSC очень чувствительны к плотности клеток. Чтобы сохранить MuSC в их распространяющемся состоянии, выращивайте их до тех пор, пока они не станут сливающимися на 60-70%. Передавая клетки в новый коллаген, я покрываю посудой или тарелками и добавляю новую свежую среду каждые 2 дня. Если MuSC хранить в одной тарелке или тарелке дольше 3-4 дней, они приобретут вытянутую форму и выровняются с соседними клетками до слияния.
  4. Для культуры FAP повторно суспендируют клетки в соответствующем объеме питательной среды MuSC и инкубируют их в стандартных условиях при 37 °C и 5% CO2.
    1. Пластинчатые FAP, выделенные из невозмущенных мышц при плотности 15 000 клеток /см2 , и FAP, выделенные из поврежденной мышцы при 9000 клеток /см2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После нанесения покрытия FAP полностью прилипают к поверхности пластины в течение 48 ч, в то время как активированные FAP прикрепляются к пластине в течение нескольких часов. Как только они прикрепляются, ФАПы приобретают свою характерную форму, с маленьким клеточным телом и удлиненными клеточными отростками, и они быстро размножаются.
    2. Заменяйте среду каждые 2 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FAP очень чувствительны к плотности клеток. Посев FAP при низкой плотности может привести к плохому росту клеток и гибели клеток. Напротив, покрытие FAP при высокой плотности посева повысит выживаемость клеток и улучшит их расширение. FAP, полученные из поврежденной мышцы, обычно требуют более низкой плотности клеток, чем неповрежденные мышцы, поскольку они уже активированы. Рекомендуется регулировать плотность покрытия FAP в зависимости от экспериментальных условий и источника образцов.
  5. Для кокультуры повторно суспендировать FAP и MuSC в среде кокультуры в соотношении 1:1 и инкубировать их в стандартных условиях при 37 °C и 5% CO2. Дайте клеткам прикрепиться в течение 48 часов и заменяйте среду каждые 2 дня.

8. Иммунофлуоресцентный анализ культивируемых ФАПов и MUSC

  1. Аспирируйте клеточную среду и выполните две или три промывки с 1x PBS.
  2. Зафиксируйте клетки 2% параформальдегидом (PFA) в 1x PBS в течение 15 мин при RT.
  3. Аспирировать 2% PFA и быстро промыть клетки два или три раза с 1x PBS.
  4. Выполните пермеабилизацию и блокировку клеток:
    1. Для иммуноокрашения свежеизолированных ФАП выполняют пермеабилизацию и блокирование клеток путем инкубации клеток с помощью 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST) + 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) + 5% Normal Donkey Serum (NDS) в течение 30 мин при RT.
    2. Для иммуноокрашения свежеизолированных MuSC выполняют пермеабилизацию и блокирование клеток путем инкубации клеток с PBST + 1% BSA + 5% Normal Goat Serum (NGS) в течение 30 мин при RT.
  5. Применяют первичные антитела:
    1. Для иммуноокрашения свежеизолированных ФАП применяют первичные антитела против ФДГФРΑ коз (1:300), разведенные в ПБСТ + 1% БСА + 5% НБД на ночь при 4 °C.
    2. Для иммуноокрашения свежеизолированных MuSC применяют мышиное анти-Pax7 первичное антитело (1:10), разведенное в PBST + 1% BSA + 5% NGS в течение 45 мин при RT.
  6. Промыть клетки два или три раза 1x PBS, чтобы удалить раствор первичного антитела.
  7. Применяют вторичные антитела:
    1. Для иммуноокраширования свежеизолированных ФАП применяют ослиное против козьего IgG (H+L) Alexa Fluor 488 вторичное антитело (1:500), разведенное в ПБСТ + 1% БСА в течение 1 ч при РТ.
    2. Для иммуноокрашения свежеизолированных MuSC применяют козье противомышечное вторичное антитело IgG1 Alexa Fluor 555 (1:500), разведенное в PBST + 1% BSA в течение 45 мин при RT.
  8. Промыть клетки два или три раза 1x PBS, чтобы удалить раствор первичного антитела.
  9. Выполняют ядерное контрокрасление путем инкубации клеток с DAPI в PBST (1:1000) в течение 5 мин при RT.
  10. Промыть ячейки три раза 1x PBS, чтобы удалить раствор DAPI.
    ВНИМАНИЕ: DAPI токсичен и опасен; обращаться с ним осторожно и утилизировать в бутылку с опасными отходами.
  11. Храните ячейки при температуре 4 °C защищенными от света.

Результаты

Этот протокол позволяет выделить около одного миллиона FAP и до 350 000 MuSC из неповрежденных задних конечностей взрослых мышей дикого типа (3-6 месяцев), что соответствует выходу 8% для FAP и 3% для MuSC от общего числа событий. При сортировке клеток из поврежденных ТА через 7 дней после травмы две-т?...

Обсуждение

Создание эффективных и воспроизводимых протоколов для идентификации и изоляции чистых популяций взрослых стволовых клеток является первым и наиболее важным шагом на пути к пониманию их функции. Изолированные FAP и MuSC могут быть использованы для проведения мультиомического анализа в э...

Раскрытие информации

Никакой.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Тома Чунга (Гонконгский университет науки и технологии) за советы по изоляции MuSC. Эта работа финансировалась NIAMS-IRP через гранты NIH AR041126 и AR041164.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL Polypropylene Round-Bottom TubeFalcon352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapFalcon352235
20 G BD Needle 1 in. single use, sterileBD Biosciences 305175
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b)The University of British Columbia53-0010-01
APC anti-mouse CD31 AntibodyBioLegend102510
APC anti-mouse CD45 AntibodyBioLegend103112
BD FACSMelody Cell SorterBD Biosciences 
BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mLBD Biosciences 309604
Biotin anti-mouse CD106 AntibodyBioLegend105703
C57BL/6J  mouse (Female and Male)The Jackson Laboratory000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouseThe Jackson Laboratory007669
Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell PlateCorning356400
Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell PlateCorning356500
Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell PlateCorning356408
DAPI Solution (1 mg/mL)ThermoFisher Scientific62248
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, SterileVWR414004-265
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11055
Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, SterileCorning352340
Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, SterileCorning353002
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mLVWR352196
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mLCorning352070
Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, CorningVWR60819-728
Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap CorningVWR21008-948
Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic)PromegaG5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, powderThermoFisher Scientific17101015
Gibco Dispase, powderThermoFisher Scientific17105041
Gibco DMEM, high glucose, HEPESThermoFisher Scientific12430054
Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United StatesThermoFisher Scientific16000044
Gibco Ham's F-10 Nutrient MixThermoFisher Scientific11550043
Gibco Horse Serum, New Zealand originThermoFisher Scientific16050122
Gibco PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010023
Gibco PBS (10x), pH 7.4ThermoFisher Scientific70011044
Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)ThermoFisher Scientific10378016
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA-21127
Hardened Fine ScissorsFine Science Tools Inc14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)ThermoFisher ScientificA1310
Mouse PDGF R alpha AntibodyR&D SystemsAF1062
Normal Donkey SerumFisher ScientificNC9624464
Normal Goat SerumThermoFisher Scientific31872
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) AntibodyBioLegend108120
Paraformaldehyde, 16%Fisher ScientificNCC0528893
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)Developmental Study Hybridoma BankN/A
PE/Cyanine7 StreptavidinBioLegend405206
Student Vannas Spring ScissorsFine Science Tools Inc91500-09
Student Dumont #5 ForcepsFine Science Tools Inc91150-20
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

Ссылки

  1. Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
  2. Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
  3. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
  4. Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
  5. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
  6. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  7. Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
  8. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  9. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  10. Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
  11. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
  12. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  13. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
  14. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  15. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
  16. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
  17. Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
  18. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  19. Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
  20. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
  21. Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
  22. García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  23. Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
  24. Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  25. Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

184MuSCFACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены