Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı

Özet

S1P, çeşitli fizyolojik etkilerini S1P reseptörleri (S1PR'ler) alt ailesi aracılığıyla uygular. Burada, S1PR'lerin yapılarını ve işlevlerini açıklamak için bir boru hattı açıklanmaktadır.

Özet

Lizofosfolipitler (LPL'ler), sfengozin 1-fosfat (S1P), lizofosfatidik asit vb. İçeren biyoaktif lipitlerdir. Hücre zarındaki sfengolipidlerin metabolik bir ürünü olan S1P, sfengozin 1-fosfat reseptörlerinin (S1PR'ler) aracılık ettiği sinyal yolları aracılığıyla çeşitli hücresel fizyolojik yanıtları düzenleyen en iyi karakterize LPL'lerden biridir. Bu, S1P-S1PR sinyal sisteminin, multipl skleroz (MS), otoimmün bozukluklar, kanser, inflamasyon ve hatta COVID-19 dahil olmak üzere bozukluklar için dikkate değer bir potansiyel terapötik hedef olduğunu göstermektedir. A sınıfı G-protein eşleşmiş reseptör (GPCR) ailesinin küçük bir alt kümesi olan S1PR'ler beş alt tipten oluşur: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 ve S1PR5. Bununla birlikte, ayrıntılı yapısal bilgi eksikliği, S1PR'leri hedef alan ilaç keşfini engellemektedir. Burada, S1P-S1PR kompleksinin yapısını çözmek için kriyo-elektron mikroskobu yöntemini uyguladık ve hücre bazlı fonksiyonel tahliller kullanarak aktivasyon, seçici ilaç tanıma ve G-protein eşleşmesi mekanizmasını aydınlattık. Diğer lizofosfolipid reseptörleri (LPLR'ler) ve GPCR'ler de bu strateji kullanılarak incelenebilir.

Giriş

Hücre zarındaki sfengolipidlerin metabolik bir ürünü olan Sfengosin-1-fosfat (S1P), lenfosit kaçakçılığı, vasküler gelişim, endotel bütünlüğü ve kalp atış hızı ^1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik aktiviteleri içeren her yerde bulunan bir lizofosfatidik sinyal molekülüdür. S1P, çeşitli fizyolojik etkilerini beş S1P reseptör alt tipi (S1PRs 1-5) aracılığıyla uygular; S1PR'ler çeşitli dokularda bulunur ve aşağı akış G proteinleri için benzersiz tercihler sergiler ^4,5. S1PR1 öncelikle daha sonra cAMP üretimini inhib....

Protokol

1. S1PRs-G protein kompleksinin saflaştırılması

1. İnsan S1PR'leri-G protein kompleksini saflaştırmak için, C-terminal kalıntıları 338-382'den yoksun olan S1PR1'in cDNA'larını, C-terminus'ta 345-398 ile kesilmiş vahşi tip S1PR3, S1PR5'i ve vahşi tip Gi1'i pFastBac1 vektörüne ve vahşi tip Gβ1 ve Gγ2'nin cDNA'larını pFastBacdual vektörüne (Malzeme Tablosu) klonlayın.
   NOT: S1PR'ler için tüm yapılar ayrıca haemagglutinin (HA) sinyal dizisini ve ardından N-terminusunda bir Flag epitop etiketi ve C-terminus'ta 10x onun etiketini içerir. Ayrıca, T4 lizozimini (T4L) çevirmek için sentetik bir DNA dizisi (Malzeme Tab....

Sonuçlar

S1PRs-Gi kompleksinin numunesini dondurmadan önce, saflaştırılmış numunenin boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile ayrılması ve jel filtrasyon kromatografisi ile analiz edilmesi gerekir. Şekil 2 , örnek olarak S1PR3-Gi kompleksini göstermektedir. Homojen GPCR-G protein kompleksinin tepe fraksiyonu genellikle boyut dışlama kromatografisinin ~ 10.5 mL'sinde bulunuyordu (Şekil 2A). S1PR3-Gi kompleksinin SDS sayfası analizi (Şe.......

Tartışmalar

Bu protokol, S1PR'lerin yapılarını kriyo-EM ile belirlemek ve Gi-aracılı cAMP inhibisyon testi ile S1PR'lerin aktivasyon gücünü ölçmek için birincil bir boru hattını açıklamaktadır. Bazı adımlar deneyin başarısı için çok önemlidir.

S1PRs-Gi kompleksini saflaştırmak için, virüsün kalitesine ve sf9 hücrelerinin sağlığına daha fazla dikkat edilmelidir. Reseptörün ekspresyonu, zayıf sf9 hücrelerinde önemli ölçüde azalır. Sf9 hü.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin-EDTA	GIBCO	Cat# 25300054
0.22 µM filter	Thermo Fisher Scientific	Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88533
6-well plate	Corning	Cat# 43016
96-well plate	Corning	Cat# 3917
Aprotinin	Sigma-Aldrich	Cat# 9087-70-1
Apyrase	NEB	Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10362100	For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine	Sigma-Aldrich	Cat# B6506
CHO-K1	ATCC	N/A
CHS	Sigma-Aldrich	Cat# C6512
CryoSPARC	Punjani, A., et al.,2017	https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli	Thermo Fisher Scientific	Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt	Sigma- Aldrich	Cat# 50227
DMSO	Sigma- Aldrich	Cat# D2438
EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium	Expression Systems	Cat#  96-001
Excel	microsoft	N/A
F12 medium	Invitrogen	Cat# 11765
FBS	Cell Box	Cat# SAG-01U-02
Flag resin	Sigma- Aldrich	Cat# A4596
Forskolin	APExBIO	Cat# B1421
Gctf	Zhang, 2016	https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN	Anatrace	Cat# GDN101
Gel filtration column	GE healthcare	Cat# 28990944
Gen5 3.11	BIO-TEK	N/A
Gentamicin	Solarbio	Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit	Promega	Cat# E1291	Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid	Promega	Cat# E2301	Sensor plasmid
Grace’s medium	GIBCO	Cat# 11595030
GraphPad Prism 8	Graphpad	N/A
HBSS	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88284
HEPES	Sigma- Aldrich	Cat# H4034
jetPRIME Reagent	Polyplus Transfection	Cat# 114-15	transfection reagent
Janamycin	Solarbio	Cat# K1030
LB medium	Invitrogen	Cat# 12780052
Leupeptin	Sigma-Aldrich	Cat# L2884
LMNG	Anatrace	Cat# NG310
MotionCor2	(Zheng et al., 2017)	https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab	Thermo Fisher Scientific	Cat# 1121822
PBS	Invitrogen	Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs	GenScript	N/A
pFastBac1-Gαi	GenScript	N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10	GenScript	N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2	GenScript	N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	Cat# K210003	For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit	NEB	Cat# E0554S	For the preparation of plasmids
Quantifoil	Quantifoil	Cat# 251448
RELION-3.1	(Zivanov et al., 2018)	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA	addgene	N/A
scFv16	Invitrogen	Cat# 703976
Sf9	Expression Systems	N/A
Siponimod	Selleck	Cat# S7179
sodium cholate	Sigma-Aldrich	Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader	BIO-TEK	N/A
Synthetic T4L DNA (sequence)	N/A	N/A	Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac
TCEP	Thermo Fisher Scientific	Cat# 77720
Tetracycline	Solarbio	Cat# T8180
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	N/A