Streptococcus pneumoniae'nin Viral Ko-Enfeksiyon Üzerine Kolonizatörden Patojene Geçişi İçin Bir Fare Modeli, Yaşın Şiddetlendirdiği Hastalıkları Özetler

Özet

Bu yazıda, viral enfeksiyon sırasında pnömokokların asemptomatik bir kolonizatörden hastalığa neden olan bir patojene geçişi için yeni bir fare modeli açıklanmaktadır. Bu model, hastalık progresyonunun farklı aşamalarında ve çeşitli konakçılarda polimikrobiyal ve konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Özet

Streptococcus pneumoniae (pnömokok), çoğu bireyde nazofarenksin asemptomatik bir kolonizatörüdür, ancak influenza A virüsü (IAV) enfeksiyonu üzerine pulmoner ve sistemik bir patojene ilerleyebilir. İleri yaş, konakçının sekonder pnömokok pnömonisine duyarlılığını arttırır ve kötüleşen hastalık sonuçları ile ilişkilidir. Bu süreçleri yönlendiren konakçı faktörler, kısmen asemptomatik kolonizasyondan ciddi klinik hastalığa geçişi yeniden üreten hayvan modellerinin eksikliği nedeniyle iyi tanımlanmamıştır.

Bu yazıda, viral enfeksiyon üzerine pnömokokların asemptomatik taşıyıcılıktan hastalığa geçişini yeniden yaratan yeni bir fare modeli anlatılmaktadır. Bu modelde, fareler ilk önce asemptomatik taşıyıcılığı sağlamak için biyofilm ile yetiştirilen pnömokoklar ile intranazal olarak aşılanır, ardından hem nazofarenks hem de akciğerlerin IAV enfeksiyonu izlenir. Bu, akciğerlere bakteriyel yayılım, akciğer iltihabı ve ölümcüllüğe ilerleyebilecek belirgin hastalık belirtileri ile sonuçlanır. Hastalığın derecesi bakteri suşu ve konakçı faktörlere bağlıdır.

Önemli olarak, bu model yaşlanmanın duyarlılığını yeniden üretir, çünkü genç farelere kıyasla, yaşlı fareler daha ciddi klinik hastalık gösterir ve hastalığa daha sık yenik düşer. Taşıma ve hastalığı farklı adımlara ayırarak ve hem patojenin hem de konakçının genetik varyantlarını analiz etme fırsatı sağlayarak, bu S. pneumoniae / IAV ko-enfeksiyon modeli, önemli bir patobiyontun konakçı ile etkileşimlerinin hastalık progresyonunun farklı aşamalarında ayrıntılı olarak incelenmesine izin verir. Bu model aynı zamanda duyarlı konakçılarda sekonder pnömokok pnömonisine karşı potansiyel terapötik hedefleri belirlemek için önemli bir araç olarak da hizmet edebilir.

Giriş

Streptococcus pneumoniae (pnömokok), çoğu sağlıklı bireyin nazofarenksinde asemptomatik olarak bulunan Gram-pozitif bakterilerdir ^1,2. Tamamen tanımlanmamış faktörler tarafından teşvik edilen pnömokoklar, nazofarenksin iyi huylu kolonizatörlerinden, diğer organlara yayılan patojenlere geçebilir ve bu da otitis media, pnömoni ve bakteriyemi³ dahil olmak üzere ciddi enfeksiyonlara neden olabilir. Pnömokok hastalığı prezentasyonu, kısmen, kapsüler polisakkaritlerin bileşimine dayanan serotip de dahil olmak üzere suşa özgü farklılıklara bağlıdır. Şimdiye kadar karakterize edilen 100'den fazla serotip vardır ve bazıları daha invaziv enfeksiyonlarla ilişkilidir ^4,5. Diğer bazı faktörler pnömokok hastalığı riskini arttırır. Böyle bir faktör, pnömokok pnömonisi riskinin IAV ^6,7 ile 100 kat arttığı viral enfeksiyondur. Tarihsel olarak, S. pneumoniae, influenza sonrası sekonder bakteriyel pnömoninin en yaygın nedenlerinden biridir ve daha kötü sonuçlarla ilişkilidir⁸. Bir diğer önemli risk faktörü ileri yaştır. Aslında, S. pneumoniae, 65 yaşın üzerindeki yaşlı bireylerde toplum kökenli bakteriyel pnömoninin önde gelen nedenidir ^9,10. Yaşlı bireyler, pnömoni ve influenzaya bağlı ölümlerin çoğunluğunu (% >75) oluşturmaktadır, bu da iki risk faktörünün - yaşlanma ve IAV enfeksiyonu - sinerjik olarak hastalık duyarlılığını kötüleştirdiğini göstermektedir^11,12,13,14. Bununla birlikte, viral enfeksiyonun pnömokokların asemptomatik kolonizatörden invaziv patojene geçişini tetiklediği mekanizmalar ve bunun konakçı faktörler tarafından nasıl şekillendirildiği tam olarak tanımlanmamıştır. Bu, büyük ölçüde, asemptomatik pnömokok kolonizasyonundan kritik klinik hastalığa geçişi özetleyen küçük bir hayvan modelinin yokluğundan kaynaklanmaktadır.

Ko-enfeksiyon çalışmaları klasik olarak, influenza enfeksiyonundan 7 gün sonra doğrudan akciğerlere pnömokoklarla aşılanmış farelerde modellenmiştir^15,16. Bu, sekonder bakteriyel pnömoniye duyarlılığı yeniden üretir ve antiviral bağışıklık tepkilerinin antibakteriyel savunmayı nasıl bozduğunu incelemek için idealdir¹⁷. Bununla birlikte, insanlarda yapılan uzunlamasına çalışmalar, bakterilerin asemptomatik biyofilmler oluşturabildiği nazofarenkste pnömokok taşıyıcılığının¹⁸, invaziv hastalıklarla eşit şekilde ilişkili olduğunu göstermiştir^19,20. Orta kulak, akciğer ve kan enfeksiyonlarından kaynaklanan bakteriyel izolatlar, nazofarenks^20'de bulunanlarla genetik olarak aynıdır. Bu nedenle, IAV enfeksiyonunu takiben asemptomatik taşıyıcılıktan invaziv hastalığa geçişi incelemek için, farelere intranazal olarak biyofilm ile yetiştirilen pnömokokların uygulandığı ve ardından nazofarenksin IAV enfeksiyonunun uygulandığı bir model oluşturulmuştur^21,22. Üst solunum yolunun viral enfeksiyonu, konakçı ortamda, pnömokokların biyofilmlerden dağılmasına ve alt solunum yollarına yayılmasına yol açan değişikliklere yol açmıştır²¹. Bu dağınık bakteriler, enfeksiyon için önemli olan virülans faktörlerinin ekspresyonunu yukarı regüle etmiş, onları kolonizatörlerden patojenlere dönüştürmüştür²¹. Bu gözlemler, virüs, konakçı ve bakteriler arasındaki karmaşık etkileşimi vurgulamakta ve viral enfeksiyon tarafından tetiklenen konakçıdaki değişikliklerin pnömokok davranışı üzerinde doğrudan bir etkiye sahip olduğunu ve bunun da bakteriyel enfeksiyonun seyrini değiştirdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu model insanlarda gözlenen ciddi hastalık belirtilerini özetlemekte başarısız olur, çünkü muhtemelen virüs burun boşluğu ile sınırlıdır ve viral enfeksiyonun konakçı bağışıklığı ve akciğer hasarı üzerindeki sistemik etkileri özetlenmemiştir.

Son zamanlarda, konakçı ve patojenler arasındaki karmaşık etkileşimi içeren, aynı zamanda insanlarda gözlenen hastalık şiddetini daha yakından taklit eden bir model oluşturduk²³. Bu modelde, fareler ilk önce asemptomatik taşıyıcılık oluşturmak için biyofilm ile yetiştirilen pnömokoklar ile intranazal olarak enfekte edilir, ardından hem nazofarenks hem de akciğerlerin IAV enfeksiyonu izlenir. Bu, akciğerlere bakteriyel yayılım, akciğer iltihabı ve genç farelerin bir kısmında ölümcüllüğe ilerleyen hastalıklarla sonuçlandı²³. Bu önceki çalışma, hem viral hem de bakteriyel enfeksiyonun konak savunmasını değiştirdiğini göstermiştir: viral enfeksiyon bakteriyel yayılımı teşvik etti ve önceki bakteriyel kolonizasyon, konağın pulmoner IAV seviyelerini kontrol etme yeteneğini bozdu²³. İmmün yanıtın incelenmesi, IAV enfeksiyonunun nötrofillerin antibakteriyel aktivitesini azalttığını, bakteriyel kolonizasyonun ise antiviral savunma için kritik olan tip I interferon yanıtını körelttiğini ortaya koymuştur²³. Daha da önemlisi, bu model yaşlanmanın duyarlılığını yeniden üretti. Genç farelerle karşılaştırıldığında, yaşlı fareler daha erken hastalık belirtileri gösterdi, daha ciddi klinik hastalık gösterdi ve enfeksiyona daha sık yenik düştü²³. Bu makalede sunulan çalışma, hastalığın derecesinin bakteriyel suşa da bağlı olduğunu göstermektedir, çünkü invaziv pnömokok suşları IAV enfeksiyonu üzerinde daha etkili yayılım gösterir, pulmoner inflamasyonun daha açık belirtilerini gösterir ve invaziv olmayan suşlara kıyasla daha hızlı hastalık oranlarına neden olur. Bu nedenle, bu S. pneumoniae / IAV ko-enfeksiyon modeli, hem patojen hem de konakçı faktörlerin ayrıntılı olarak incelenmesine izin verir ve hastalık progresyonunun farklı aşamalarında polimikrobiyal enfeksiyonlara karşı bağışıklık tepkilerini incelemek için çok uygundur.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerilere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm prosedürler Buffalo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Kimyasal olarak tanımlanmış ortamın (CDM) hazırlanması

1. Stokları aşağıdaki gibi hazırlayın:
   1. Karıştırırken Tablo 1'de listelenen karışım I bileşiklerini 100 mL ultra saf suda çözün. −20 °C'de 200 μL alikotlarda saklayın.
   2. Karıştırırken Tablo 1'de listelenen karışım II bileşiklerini 20 mL 0.1 M NaOH'da çözün. −20 °C'de 100 μL alikotta saklayın.
   3. Karıştırırken Tablo 1'de listelenen karışım III bileşiklerini 1 mL ultra saf suda çözün. 4 °C'de 10 μL aliquots'ta saklayın.
   4. Karıştırırken Tablo 1'de listelenen karışım IV bileşiğini 1 mL ultra saf suda çözün. −20 °C'de 10 μL alikotta saklayın.
   5. Karıştırırken Tablo 2'de listelenen bileşikleri başlangıçta 15 mL ultra saf suda çözün. Birkaç damla 0,1 M NaOH ile pH'ı 7,0'a ayarlayın ve ultra saf su kullanarak son hacmi 20 mL'ye ayarlayın. −20 °C'de 1 mL alikotta saklayın.
   6. Karıştırma sırasında Tablo 3'te listelenen bileşikleri 90 mL ultra saf suda 50 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde çözün. PH'ı 0,1 M NaOH ile 7,0'a ayarlayın ve ardından ultra saf su kullanarak son ses seviyesini 100 mL'ye ayarlayın. −20 °C'de 5 mL alikotta saklayın.
2. Karıştırırken Tablo 4'teki bileşikleri 70 mL ultra saf suda çözerek marş stoğunu her seferinde taze yapın.
3. Taze başlangıç stoğuna aşağıdaki karışım stoklarını sırayla ekleyin: 200 μL Mix I stoğu (Tablo 1), 80 μL Mix II stoğu (Tablo 1), 10 μL Mix III stoğu (Tablo 1), 10 μL Mix IV stoğu (Tablo 2), 1 mL Vitamin stoğu (Tablo 3) ve 5 mL Amino Asit stoğu (Tablo 4).
4. Stoklar eklendikten sonra, behere 30 mL ultra saf su ekleyerek son hacmi 100 mL'ye ayarlayın.
5. CDM'yi Tablo 4'teki bileşiklerle destekleyin. İyice karıştırıldıktan sonra, filtre sterilize edin ve maksimum 2 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın.

2. S. pneumoniae biyofilminin yetiştirilmesi

1. RP-10 ortamını, 445 mL RPMI 1640'ı sırasıyla 10.000 U/mL ve 10.000 μg/mL'de 50 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ve 5 mL penisilin/streptomisin ile karıştırarak hazırlayın.
2. NCI-H292 (H292) mukoepidermoid karsinom hücre hattını büyütün. Satın alınan bir şişedeki hücreleri, T-25 doku kültürü ile muamele edilmiş bir şişede 5 mL RP-10 ortamına ekleyin. %100 birleşmeye ulaşmak için 37 °C/%5 CO_2'de 3-5 gün boyunca inkübe edin.
3. Akıcılığı değerlendirmek için 10x büyütme kullanarak hücreleri ışık mikroskobu altında kontrol edin.
   NOT: Tüm hücreler diğer hücrelerle temas halinde olduğunda ve aralarında boşluk olmadığında, istenen %100 akıcılığa ulaşılır.
4. Hücreleri 5 mL oda sıcaklığında PBS'de 2 kat yıkayın. Bir sonraki adımda EDTA'nın şelatlamasını önlemek için tamponun kalsiyumsuz olduğundan emin olun.
5. Şişeye 1 mL tripsin-EDTA ekleyin ve hücreler ayrılana kadar 5-10 dakika boyunca 37 ° C / % 5 CO_2'de inkübe edin. 4 mL RP-10 ortamı ile nötralize edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın ve 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
6. Doku kültürü ile muamele edilmiş 24 delikli bir plakaya kuyucuk başına 500 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Akıcı bir T-25 şişesinden, 2 × 10 6-4 × 10⁶ hücre / mL bekleyin.
7. Ertesi gün, adım 2.3'te olduğu gibi birleştiklerinden emin olmak için hücreleri ışık mikroskobu altında kontrol edin. Değilse, daha uzun süre inkübe edin.
8. H292 hücreleri 24 delikli plakada% 100 birleştiğinde, antibiyotik veya döküntü içeren hiçbir ortamın kalmadığından emin olmak için hücreleri 1 mL oda sıcaklığında PBS ile 3 kat hafifçe yıkayın.
9. Hücreleri yıkadıktan sonra, hücreleri sabitlemek için 250 μL / kuyucuk% 4 paraformaldehit ekleyin. Buz üzerinde 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
10. Hücre fiksasyonundan önceki gece, S. pneumoniae suşunu kan agar plakalarına çizin ve gece boyunca 37 ° C / % 5 CO_2'de inkübe edin.
    NOT: Burada sunulan veriler, işbirlikçi değişim yoluyla elde edilen aşağıdaki S. pneumoniae suşları ile ilgilidir: serotip 19F otitis media izolatı EF3030 24, klasik serotip 2 Avery suşu D39²⁵ ve serotip 4 bakteriyemi izolatı^{TIGR4 26}. Suşlar, Malzeme Tablosunda atıfta bulunulan genel koleksiyonlardan da temin edilebilir.
11. 20 mL CDM'ye 100 μL oksiraz (30 U/mL) ekleyerek CDM artı oksiraz (0,15 U/mL) hazırlayın.
    NOT: Oksiraz, sıvı kültürde S. pneumoniae'nin verimli büyümesini sağlamak için oksijeni ortadan kaldırmak için kullanılır²⁷.
12. 1 mL CDM + oksiraz ekleyerek bakterileri plakadan yıkayarak ve 1 mL'lik bir pipet ucunun kenarını kullanarak bakteri kolonilerini hafifçe kaldırarak, agar'ı kazımamaya dikkat ederek bakterileri plakadan taze CDM + oksiraza aşılayın. Alternatif olarak, bakterileri kaldırmak ve bunları 1 mL CDM + oksiraz içeren bir tüpe aşılamak için bir aşılama döngüsü kullanın.
13. CDM + oksirazdaki bakterileri 0.05'lik bir başlangıç OD_600'üne seyreltin.
14. Bakterileri, 0.2'lik bir OD_600'e ulaşılana kadar 37 ° C / % 5 CO 2'de duran gevşek kapaklı 50 mL'lik bir konik tüpte büyütün (bu_2-5 saat arasında herhangi bir yerde sürecektir). OD'nin 0,2'yi geçmediğinden emin olmak için OD_600'ü saatte bir kontrol edin.
15. OD 0.2'ye ulaştığında, bakteri kültürü tüpünü vorteks. Sabit H292 hücrelerine 0.5 mL bakteri tohumlayın ve kuyucuk başına 0.5 mL CDM + oksiraz ortamı ekleyin. Bakteri içermeyen kontrol kuyucuklarına 1 mL CDM + oksiraz ekleyin. Plakayı 34 °C/%5 CO_2'de 48 saat inkübe edin.
    NOT: 34 °C'de büyüme, nazofarenks^21'deki düşük sıcaklığı daha yakından taklit etmek için kullanılır.
16. İlk tohumlamayı takiben her 12 saatte bir, ortamın 0.5 mL'sini yavaşça çıkarın ve 0.5 mL taze CDM + oksiraz ile doldurun. Oluşturan biyofilmi bozmamaya dikkat edin. Biyofilm için plakanın altını kontrol edin ve biyofilmin büyümesi nedeniyle zaman geçtikçe artan bulanıklığa bakın. Kirlenmeyi kontrol etmek için, kontrol kuyularının temiz kaldığından emin olmak için kuyuları bakteri içermeyen kontrol edin.
17. Aşılamadan 48 saat sonra, süpernatantı çıkarın ve 1 mL PBS ile 2x çok nazikçe yıkayın. Biyofilmi kaldırmak için 1 mL taze CDM ve pipeti kuvvetlice yukarı ve aşağı doğru askıya alın. Her bakteri suşu için, bakterileri tüm kuyucuklardan 50 mL'lik bir konik tüpe toplayın. Sıkıca kapatılmış tüpü birkaç kez yukarı ve aşağı doğru hafifçe eğerek iyice karıştırın.
18. 50 mL konik tüpe,% 20 gliserol nihai konsantrasyonuna sahip bir bakteri süspansiyonu elde etmek için CDM'de eşit hacimlerde% 40 gliserol ekleyin. 1 mL'yi mikrosantrifüj tüplerine alın, kuru buzda flaş dondurun ve -80 ° C'de tasarruf edin.
19. Kullanmadan önce, buz üzerinde bir alikotu çözerek, tüpü 5 dakika boyunca 1.700 × g'da döndürerek, süpernatanı çıkararak, peleti 1 mL PBS'de yeniden askıya alarak ve seri seyreltmeleri kan agar plakaları²⁸ üzerine kaplayarak bakterileri numaralandırın.
20. Agar plakalarını gece boyunca 37 ° C / % 5 CO_2'de büyütün ve koloni oluşturan birimlerde (CFU) / mL'de bakteri konsantrasyonunu elde etmek için kolonileri ilgili seyreltmelerde sayın.
    NOT: İlk 24 saat içinde bakteri canlılığında bir düşüş olduğu için stoklardaki bakterilerin donmadan en az bir gün sonra veya daha sonra numaralandırılması önerilir. Saklanan dondurulmuş alikotlar, en fazla 2 ay boyunca farelerin sonraki enfeksiyonu için kullanılabilir.

3. Biyofilm ile yetiştirilen S. pneumoniae ile farelerin intranazal aşılaması

1. Fareleri satın alın ve istediğiniz yaşta kullanın.
   NOT: Genç konakçıları modellemek için 3-4 aylık fareler tercih edilir ve 29 yaş >65 yaş yaşlı bireyleri modellemek için^21-24 aylık fareler kullanılabilir. Burada sunulan veriler C57BL/6 erkek farelere aittir.
2. Biyofilm tarafından yetiştirilen bakteriyel alikotları buz üzerinde çözün ve 5 dakika boyunca 1.700 × g'da döndürün. Peletleri bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın, peleti 1 mL PBS'de yeniden askıya alarak bakterileri yıkayın ve 5 dakika boyunca 1.700 × g'da tekrar döndürün. Süpernatantı çıkarın ve peleti istenen konsantrasyona ulaşmak için gereken hacimde yeniden askıya alın (intranazal aşılama için 5 × 10⁶ CFU / 10 μL'yi hedefleyin). Hazırlanan inokulumun 2.19. adımda olduğu gibi kan agar plakaları üzerine kaplanmasıyla uygulanan bakteri miktarlarını onaylayın.
3. Seyreltilmiş inokulumun 5 μL'sini her bir narise pipetleyerek fareleri intranazal olarak 5 ×^{10 6} CFU ile aşılayın. Fareleri sıkıca tuttuğunuzdan emin olun, hacim solunana kadar kafayı stabilize edin (tipik olarak hacmi nares'e pipetledikten sonraki saniyeler içinde). İnokulumun pulmoner aspirasyonunu önlemek için anestezi yokluğunda bu adımı uygulayın.

4. İnfluenza A virüsü (IAV) ile viral enfeksiyon

1. S. pneumoniae ile intranazal aşılamayı takiben 48 saatte, buz üzerinde ilgilenilen IAV suşunu çözün.
   NOT: Burada sunulan veriler, işbirlikçi değişim 30 yoluyla elde edilen influenza A virüsü A / PR / 8/³⁴ H1N1'in fareye uyarlanmış bir suşu ile ilgilidir.
2. Virüs çözüldükten sonra, PBS'deki virüsü istenen konsantrasyona seyreltin; intratrakeal enfeksiyon için 20 plak oluşturucu ünite (PFU)/50 μL ve intranazal enfeksiyon için 200 PFU/10 μL hedeflenmiştir. Alay ile enfekte olmuş ve yalnızca bakteri içeren gruplar için, fareleri aşılamak için PBS kullanın.
3. Oftalmik kayganlaştırıcıyı anesteziden önce farelerin gözlerine yerleştirin. Fareleri% 5 izofluran kullanarak uyuşturun ve sıkı bir ayak parmağı sıkışmasıyla anesteziyi onaylayın.
4. Hayvan uyuşturulduktan sonra, izofluran odasından çıkarın ve dili ağızdan çıkarmak ve sıvı hacmini trakeadan aşağı pipetlemek için künt cımbız kullanarak anestezi altındaki farelere derhal 50 μL (20 PFU) IAV intratrakeal olarak bulaştırın.
5. Fareleri ayrı bir kafese yerleştirin ve tamamen iyileşene kadar izleyin (sternal yatmayı koruyabilirler [göğsün üzerine dik durabilirler]).
6. İyileşmeyi takiben, adım 3.3'teki aşılama yöntemini kullanarak fareleri derhal intranazal olarak 10 μL (200 PFU) IAV ile aşılayın.
7. Aynı enfeksiyon grubuyla tek veya çift bakteriyel ve viral enfeksiyon geçirmiş ev fareleri ve onları diğer gruplardan ayırır.

5. Farelerin hastalık belirtileri açısından izlenmesi

1. Fareleri en az 10 gün boyunca günlük olarak izleyin ve aşağıdaki gibi hastalık belirtileri için körü körüne puan alın:
   1. Kilo kaybı için aşağıdaki gibi puan: 0 =% 5 veya daha az; 1 = %5-%10; 2 = %10-%15; 3 = %20 veya daha fazla. Kilo kaybı skoru 3 olduğunda CO₂ inhalasyonu kullanarak fareleri ötenazi yapın.
   2. Etkinlik için aşağıdaki gibi puan: 0 = normal/aktif; 1 = hareketli ancak biraz azalmış; 2 = azalmış; 3 = ciddi şekilde azalmış / uyuşuk (sadece dokunulduğunda hareket eder), 4 = koma / hareketsiz. Aktivite puanı 3 olduğunda fareleri ötenazi yapın.
   3. Duruş için aşağıdaki gibi puan: 0 = önsezi yok (normal); 1 = hafif kambur duruş; 2 = şiddetli önsezi. Duruş skoru 2'de olduğunda fareleri ötenazi yapın.
   4. Gözler için aşağıdaki gibi puan: 0 = normal; 1 = çıkıntılı; 1 = batık; 1 = kapalı; 1 = deşarj. Bu bir kombinasyon olabilir. Son göz skoru için toplamları ekleyin.
   5. Nefes almak için aşağıdaki gibi puan: 0 = Normal solunum; 1 = düzensiz veya değiştirilmiş (daha yüksek/daha düşük oran); 2 = emek harcandı (abartılı çaba veya nefes alma). Solunum skoru 2'de olduğunda fareleri ötenazi yapın.
2. Yukarıdaki kriterlere dayanarak, toplam sağlıklı (0) klinik skor için bireysel puanları aşırı hastaya (15) ekleyin. Toplam puanı 2'nin üzerinde gösteren herhangi bir farenin hasta olduğunu düşünün. Toplam puanı 9'un üzerinde veya her kriter için belirtilen puanları gösteren fareleri insancıl olarak ötenazi yapın ve hayatta kalma eğrisinde işaretleyin.

6. Bakteriyel numaralandırma için enfekte dokuların işlenmesi

1. IAV enfeksiyonunu takiben 48 saatte, fareleri ötenazi yapın.
2. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin. % 70 etanol kullanarak, kürkü temizlemek için farenin göğsüne ve karnına püskürtün. Forseps kullanarak, kürkü ve cildi farenin ortasına sıkıştırın ve bölgeyi karaciğerden göğsüne kadar açığa çıkarmak için kürkü diseksiyon makaslarında 4.5 ile kesin.
3. Kan alımı
   1. Diseksiyon makası kullanarak, karaciğeri açığa çıkarmak için periton boşluğuna yavaşça kesin. Forseps kullanarak, karaciğerin tepesindeki hepatik portal veni diyaframın yakınında açığa çıkarın. Diseksiyon makası kullanarak hepatik portal veni kesin. Kan periton boşluğunda birikmeye başladığında, bir mikropipet kullanarak 10 μL kan toplayın ve bakteri yükünü kaplamak için bir mikrosantrifüj tüpünde 90 μL antikoagülan çözeltisine (PBS'de 50 mM EDTA çözeltisi) yerleştirin.
   2. Kanın geri kalanını toplamak için bir P-1000 mikropipeti kullanın, bir kan toplama tüpüne yerleştirin ve serumu toplamak için 2 dakika boyunca 7.600 × g'da santrifüj yapın. İstenilen herhangi bir sitokin veya metabolitin daha sonraki analizi için serumu -80 ° C'de mikrosantrifüj tüplerinde saklayın.
4. Akciğer koleksiyonu
   1. Diseksiyon makası kullanarak, açıkta kalan göğüs kafesinin kenarlarını kesin ve kalbi açığa çıkarmak için kaburgaları yavaşça farenin başına doğru çekin. PBS ile önceden doldurulmuş 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı 25 G'lik bir iğneyi sağ ventriküle yerleştirin ve yavaşça karıştırmaya başlayın. Başarılı perfüzyonun bir göstergesi olarak akciğerlerin ağartılmasını arayın. Akciğer dokusunun kırılmasını önlemek için yavaşça yıkayın.
   2. Kalbi forseps ile kaldırın ve akciğerleri ve kalbi ayırmak için bir kesim yapın. Ayrıldıktan sonra, akciğerin tüm loblarını forseps ile toplayın ve kalan kanı çıkarmak için steril PBS içeren bir tabakta durulayın. Bir Petri kabında, akciğerleri küçük parçalara ayırın ve iyice karıştırın. Bakteriyel CFU veya viral PFU'nun belirlenmesi için akciğer karışımının yarısını çıkarın ve homojenizasyon için 0,5 mL PBS ile önceden doldurulmuş yuvarlak tabanlı 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
      NOT: Çeşitli değerlendirmeler için aynı akciğerin farklı loblarını almamak önemlidir. Bunun yerine, tüm loblar kıyılmalı, birlikte iyice karıştırılmalı ve farklı değerlendirmeler için eşit olarak ayrıştırılmalıdır.
   3. Akciğerin diğer yarısını akış sitometrisi için çıkarın (aşağıdaki bölüm 7) ve her bir kuyucuk 0.5 mL RP-10 ile önceden doldurulmuş doku kültürü ile muamele edilmemiş 24 delikli bir plakaya yerleştirin. İşleme girene kadar oda sıcaklığında bırakın.
5. Nazofarenks koleksiyonu
   1. Boyunda, kürkü kesmek için diseksiyon makasını kullanın ve ardından kası kesin ve trakeayı açığa çıkarın.
      NOT: Trakea, kas altında bulunan tüp benzeri bir yapıdır.
   2. Trakeanın altına, stabilize etmek için farenin çenesinden 1 cm mesafede küçük forsepsler yerleştirin. Diseksiyon makası kullanarak, trakeanın ön kısmında yavaşça 0.1 cm'lik bir yarık açın ve trakeayı tamamen kesmekten kaçının.
   3. 25 G iğneye bağlı 0,58 mm boru ile 0,5 mL PBS ile doldurulmuş 1 mL'lik bir şırınga hazırlayın. Tüpü nazofarenkse doğru yukarı doğru giden trakeaya sokarak burun yıkamayı toplayın. Burun boşluğuna direnç girildiği hissedildiğinde, buruna bir mikrosantrifüj tüpü yerleştirin ve burun lavajını toplamak için PBS'yi trakeadan yavaşça yıkayın.
   4. Fareyi yüzüstü bir konuma getirin. Farenin kafasını etanol ile püskürtün. Farenin kafa kemiğini ortaya çıkarmak için kürkü ve mistasyal pedi kesmek için diseksiyon makası kullanın.
   5. Diseksiyon makasını kullanarak, mandibulanın kenarlarını ve gözlerin arasını 1 cm kesin. Forseps kullanarak, burun boşluğunu ortaya çıkarmak için yüz kemiklerini yavaşça vücuttan çekin.
   6. Burun dokusunu nazikçe çıkarmak için forseps kullanın ve homojenizasyon için 0,5 mL PBS ile önceden doldurulmuş yuvarlak bir alt tüpe yerleştirin.
6. Toplanan dokuyu homojenize etmek için, önce homojenizatör probunu %70 etanol içine koyarak ve homojenizatörü %60 güçte 30 sn boyunca açarak temizleyin. Adımı steril suda 10 saniye tekrarlayın. Her dokuyu 1 dakika boyunca homojenize edin. Homojenizatör probunu her numune arasında steril suda ve her organ ile numune grubu arasında %70 etanol içeren taze bir tüpte temizleyin.
7. Bakteri sayılarının sayımı
   1. Tüm organlar toplandıktan ve homojenize edildikten sonra, kan agar plakaları üzerinde seri seyreltmeler yapın. Toplam CFU'yu hesaplamak için 10 μL kullanarak plaka kullanın ve her numune için mL cinsinden son hacmi not edin. Nazofarenks örneklerini, S. pneumoniae'nin büyümesini seçmek ve bu dokuyu kolonize eden diğer mikroorganizmaların büyümesini inhibe etmek için 3 μg / mL gentamisin ile desteklenmiş kan agar plakaları üzerine plakalayın. Gece boyunca 37 °C/%5 CO_2'de inkübe edin.
   2. Akciğer ve nazofarenks için bakteriyel CFU'yu numaralandırmak için, önce kan agar plakalarındaki kolonileri sayın. Ardından, mL başına miktarı ve toplam sayıyı hesaplamak için denklem (1) ve denklem (2) kullanın.
      mL başına miktar = 100 (1) × seyreltme faktörü × koloni sayısı
      Toplam sayı = mL başına miktar × numune başına toplam hacim (2)
      NOT: Denklem (1)'de, 10 μL kaplandığı için çarpmak için 100 kullanılır, bu da 1 mL'lik 100 katlı bir seyreltmedir. Denklem (2)'deki numune başına toplam hacim, organ başına 100 tespit sınırıyla sonuçlanan adım 6.7.1'den alınmıştır.
   3. Bakteriyel CFU'yu numaralandırmak için Bakteriyemi için, önce kan agar plakalarındaki kolonileri sayın. Ardından, mL kan başına miktarı belirlemek için denklem (3) kullanın.
      mL kan başına miktar = 100 × 10 × seyreltme faktörü × koloni sayısı (3)
      NOT: Denklem (3)'te, 100, 1 mL'lik 100 kat seyreltme olan 10 μL kaplanırken kullanılır ve 10, antikoagülanda kanın 1:10 seyreltilmesini gösterir. Bu, 1.000/mL'lik algılama sınırıyla sonuçlanır.

7. Akciğer örneklerinin akış sitometrisi için işlenmesi

1. Gerekli ortamı aşağıdaki gibi hazırlayın:
   1. RP-10'u adım 2.1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
   2. RP-10'u 2 mg/mL kollajenaz ve 30 μL/mL DNaz I ile karıştırarak sindirim tamponu hazırlayın.
   3. 8.29 g NH₄Cl, 1 g NaHCO₃ ve 0.038 g EDTA'yı 1 L_H2O içinde çözerek lizis tamponu hazırlayın.
   4. 450 mL HBSS'yi 50 mL ısı ile aktive FBS ve 5 g sodyum azid ile karıştırarak 10x FACS tamponu hazırlayın.
   5. 450 mL HBSS'de 50 mL 10x FACS tamponunu seyrelterek 1x FACS tamponu hazırlayın.
2. Akciğer örneklerini adım 6.4.3'ten alın ve 24 delikli bir plakaya yerleştirin. Her bir oyuğa 500 μL sindirim tamponu ekleyin. 37 ° C /% 5 CO_2'de 45 dakikadan 1 saate kadar inkübe edin.
3. Her numune için 50 mL konik tüpleri 5 mL RP-10 ile önceden doldurun. Kuluçka bittiğinde, 50 mL konik tüpün üstüne 100 μm'lik bir filtre yerleştirin ve 1 mL RP-10 ile ıslatın.
4. Bir P-1000 mikropipet kullanarak, sindirilmiş akciğerleri hareket ettirin ve filtreye yerleştirin. Organı ezmek için 3 mL'lik bir şırınganın pistonunu kullanın. Her seferinde 1 mL RP-10 ile 2 kat durulayın.
5. Numuneleri 5 dakika boyunca 4 °C ve 327 × g'da döndürün. Süpernatantı aspire edin ve peleti 1 mL lizis tamponunda yeniden askıya alın. Kırmızı kan hücrelerinin parçalanmasına izin vermek için 3 dakika bekletin. 5 mL RP-10 ile nötralize edin.
6. Numuneleri 5 dakika boyunca 4 °C ve 327 × g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin, peletleri 1 mL RP-10'da yeniden askıya alın ve numuneleri saymak için 10 μL alın.
7. Numuneleri 5 dakika boyunca 4 °C ve 327 × g'da döndürün. Süpernatantı aspire edin ve peleti RP-10'da 2 × 10 6-4 × 10⁶ hücre / mL'de yeniden askıya alın. Adım 7.9, Tablo 5 ve Tablo 6'da listelenen istenen hücre tipleri²³ için boyamak üzere 96 delikli bir plakaya her numuneden 60 μL ekleyin.
8. Plakayı 5 dakika boyunca 4 ° C ve 327 × g'da döndürün.
9. Bu arada, antikor ana karışımlarını, floresan eksi bir (FMO'lar) ve tek lekeli kontrolleri istenen antikorlarla hazırlayın. Polimorfonükleer lökositler (PMN'ler), makrofajlar, monositler, dendritik hücreler ve T hücreleri için boyama yapmak için, Tablo 5 ve Tablo 6'da listelenen antikorları ve son seyreltmeleri kullanın. Antikor karışımının toplam 100 μL/kuyucuk hacmini kullanın. Ana karışımın uygun hacmini ve gerekli bireysel antikorları belirlemek için tablolarda listelenen seyreltmeleri izleyin.
10. Spin tamamlandığında (adım 7.8), süpernatanı boşaltın, topakları antikor karışımlarının, FMO'ların veya tek lekeli kontrollerin 100 μL'sinde yeniden askıya alın ve karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
11. Kuyucuklara 150 μL FACS tamponu ekleyerek ve plakayı 4 ° C'de ve 327 × g'da 5 dakika boyunca döndürerek hücreleri 2 kat yıkayın.
12. Spin tamamlandığında, süpernatanı boşaltın, peletleri 100 μL sabitleme tamponunda yeniden askıya alın ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
13. Kuyucuklara 150 μL FACS tamponu ekleyerek ve plakayı 4 ° C'de ve 327 × g'da 5 dakika boyunca döndürerek hücreleri 2 kat yıkayın.
14. 200 μL FACS tamponu ile etiketli FACS tüpleri hazırlayın. Peletleri 150 μL FACS tamponunda tekrar askıya alın. Her numuneyi 100 μm'lik bir filtre kullanarak karşılık gelen FACS tüpüne ayrı ayrı filtreleyin. Buz üzerinde veya 4 °C'de tutun ve analize hazır olana kadar ışıktan koruyun.
15. Bir akış sitometresi kullanarak hücreleri analiz edin.

8. IAV'nin numaralandırılması için plak tahlili

1. Gerekli ortamı aşağıdaki gibi hazırlayın:
   1. 2.5 g sığır serum albümini (BSA) 40 mL DMEM içinde çözerek ve çözünene kadar 10-20 dakika boyunca 37 ° C'de karıştırarak enfeksiyon ortamını hazırlayın. 460 mL DMEM'e filtre uygulayın-sterilize edin.
   2. 1.2 mg mikrokristalin selülozu sıvı ortamında 50 mL_H2O. Otoklav içinde çözerek% 2.4 mikrokristalin selüloz hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
   3. 2.5 g BSA'yı 40 mL DMEM içinde çözerek ve 37°C'de 10-20 dakika karıştırarak %5 BSA DMEM hazırlayın. 50 mL'lik son hacim için kalan 10 mL DMEM'i ekleyin. Filtreleyin-sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
   4. 1 mL'lik %5'lik BSA DMEM'i 9 mL'lik 2x MEM ile karıştırarak 2x MEM/%0,5 BSA hazırlayın.
   5. 1:1 oranında %2,4 mikrokristalin selüloz ve 2x MEM/%0,5 BSA'yı 1 mg/mL TPCK (kimotripsin inhibitörü) tripsin ile karıştırarak düşük viskoziteli kaplama ortamı hazırlayın.
   6. 450 mL Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ile 50 mL ısı ile inaktive FBS'yi karıştırarak EMEM/%10 FBS'yi hazırlayın.
2. Madin-Darby köpek böbrek (MDCK) hücre hattını büyütün. Satın alınan bir şişedeki hücreleri, T-25 doku kültürü ile muamele edilmiş bir şişede 5 mL EMEM / % 10 FBS'ye ekleyin. Hücreler %100 birleşene kadar 37 °C/%5 CO_2'de 3-5 gün inkübe edin. Adım 2.3'teki gibi akıcılığı kontrol edin.
3. Kültür ortamını çıkarın ve atın ve 5 mL oda sıcaklığında PBS ile 2 kat durulayın. Şişeye 1 mL tripsin-EDTA ekleyin ve hücreler ayrılana kadar 10-15 dakika boyunca 37 °C / % 5 CO_2'de inkübe edin. Kaldırıldıktan sonra, 2 × 10⁵ hücre/mL'de bir hücre süspansiyonu elde etmek için 4mL EMEM / 10% FBS ile nötralize edin.
4. Plak tahliline başlamadan 1 gün önce, MDCK hücrelerini 12 kuyucuklu doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakada, kuyu başına 1 mL askıya alınmış hücre ekleyerek (2 × 10⁵ hücre / kuyuda) tohumlayın.
   NOT: Kullanmadan önce hücrelerin %100 akıcılığa ulaştığından emin olun ve akıcılığa ulaşmak için gerekirse daha uzun süre inkübe edin.
5. Standart olarak kullanmak için, adım 8.1.1'de listelenen enfeksiyon ortamında IAV stoğunun (bilinen bir titrenin) 10 kat seri seyreltmesini (10^{6-10 1}) yapın. Üçlü olarak test etmek için her seyreltmeden 1,2 mL yapın.
6. Organ buz üzerinde homojenleşir. 2.000 × g'lık bir masa üstü santrifüj üzerinde döndürün ve berrak süpernatanı toplayın.
7. Adım 8.5'i, ancak adım 8.6'daki örneklerdeki süpernatant ile yineleyin.
8. Ortamı hücrelerden aspire edin ve tüm FBS'yi çıkarmak için 1 mL PBS ile 2 kat yıkayın.
9. Her bir standart seyreltmeden 300 μL ekleyin veya seri olarak seyreltilmiş numuneyi, en yüksek seyreltmeden başlayarak en düşüğe kadar her bir kuyucuğun kenarına nazikçe ekleyin ve bunu üçlü olarak yapın.
10. Plakaları inkübatöre 37 ° C / 5% CO_2'de yerleştirin, plakayı her 10 dakikada bir toplam 50 dakika boyunca sallayın. Onları inkübatöre düz bir şekilde yerleştirdiğinizden ve istiflemediğinizden emin olun.
11. 50 dakika sonra, hücreleri 1 mL PBS ile 2x yıkayın.
12. En düşük seyreltmeli ve virüssüz kuyular hariç her bir kuyucuğa 2 mL düşük viskoziteli kaplama ortamı ekleyin; Bunlara enfeksiyon ortamı ve tripsin ekleyin.
13. Çıplak gözle görselleştirilebilen plaklar elde etmek için plakayı 2-4 gün boyunca 37 ° C / % 5 CO_2'de inkübatöre geri yerleştirin.
14. Her bir kuyucuğa yandan hızlı bir şekilde 2 mL PBS ekleyerek plakaları yıkayın ve yerleşmiş düşük viskoziteli kaplama ortamını askıya almak için hafifçe çalkalayın.
15. Ortamı yavaşça pipetleyerek kuyudaki tüm sıvı hacmini atın.
16. Yıkamayı her bir oyuğa 2 mL PBS ile bir kez daha tekrarlayın ve ardından tüm sıvı hacmini nazik pipetleme ile atın.
17. Plakları sabitlemek için, her bir oyuğa 500 μL% 4 paraformaldehit ekleyin, çalkalayın ve 30 dakika bekletin.
18. 1 mL PBS ile yavaşça aşağı doğru yıkayın; Ardından, sıvıyı yavaşça atın.
19. Hücre tek katmanını örtmek için her bir kuyucuğa 500 μL% 1 kristal menekşe (suda seyreltilmiş) ekleyin. 5 dakika boyunca inkübe edin.
20. 1 mL musluk suyu ile yıkayın. Kuyucuktaki tüm sıvıyı nazik pipetleme ile attığınızdan emin olun. Plakayı gece boyunca kuruması için bir bebek bezi pedi üzerine baş aşağı yerleştirin.
21. Plakları görsel olarak sayın ve görüntüleri mevcut herhangi bir görüntüleyiciye kaydedin.

Sonuçlar

Biyofilm ile yetiştirilen S. pneumoniae (Şekil 1A), anestezi yapılmamış farelere intranazal olarak verilen küçük bir 10 μL inokülum kullanılarak fareleri enfekte etmek için kullanıldı (Şekil 1B). Bu küçük hacimli inokulum, sistemik yayılımı önlerken (Şekil 2B, C, +sp grupları) nazofarenks (Şekil 2A, +sp grupları) ile sınırlı tutarlı pnömokok taşıyıcılığı ile sonuçlanır. İntranazal aşılamadan iki gün sonra, fareler, nazofarenks ve akciğerlere spesifik miktarların tutarlı bir şekilde verilmesini sağlamak için hem intranazal hem de intratrakeal olarak verilen murine uyarlanmış bir H1N1 influenza A virüsü A / PR / 8/³⁴ (IAV) ^22,30 ile enfekte edildi²³.

Burada, model, bakteriyemiye ilerleyen pnömoni ile sonuçlanan invaziv suşlar olan TIGR4 ve D39 ve bir otitis media suşu^olan EF3030 dahil olmak üzere farklı S. pneumoniae suşları ile intranazal olarak zorlanan farelerde viral enfeksiyonu takiben hastalığın seyrini karşılaştırmak için kullanılmıştır. S. pneumoniae/IAV ile birlikte enfekte olmuş farelerde hastalık prezentasyonu bakteriyel suşa bağlıydı (Şekil 2). Herhangi bir suş arasında nazofarenksin bakteri sayılarında anlamlı bir fark bulunmazken (Şekil 2A), S. pneumoniae TIGR4 ve D39, ancak EF3030 değil, IAV enfeksiyonundan 48 saat sonra akciğerlere yayılmıştır (Şekil 2B). S. pneumoniae TIGR4 ile intranazal olarak enfekte olmuş farelerin yüzde kırkı, akciğerlere bakteriyel yayılım gösterdi ve bunların yarısı, önceki bulgularla tutarlı olarak bakteriyemik hale geldi (Şekil^2C) 23.

S. pneumoniae D39 ile intranazal olarak enfekte olmuş fareler daha etkili yayılma göstermiştir, çünkü birlikte enfekte olmuş farelerin% 100'ünde akciğerlere yayılma gözlenmiştir (Şekil 2B). S. pneumoniae TIGR4'e benzer şekilde, bunların yarısı bakteriyemi yaşadı (Şekil 2C). Genel sağkalımın izlenmesinde, bakteri suşundan bağımsız olarak, birlikte enfekte olmuş farelerin hayatta kalma oranı, test edilen tüm suşlar için tek başına S. pneumoniae ile tek başına meydan okunan farelerden önemli ölçüde daha düşüktü (Şekil 2D). Tek başına IAV ile mücadele eden kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında, intranazal olarak S. pneumoniae TIGR4 ve D39 ile enfekte olmuş, ancak EF3030 ile enfekte olmayan fareler, hızlandırılmış hastalık oranları göstermiştir. IAV enfeksiyonu sonrası 2. günde, farelerin% 30'u (D39) ve% 20'si (TIGR4) yenik düşerken, sadece IAV'li kontrol grupları 5. güne kadar yenilmeye başlamadı (Şekil 2D). S. pneumoniae EF3030 ve IAV ile birlikte enfekte olan fareler, yalnızca IAV kontrollerine benzer şekilde semptomları geciktirmiştir (Şekil 2D). Bu bulgular, ko-enfeksiyon modelinin bakteriyel suşa bağımlı genç sağlıklı farelerde hastalığa neden olduğunu göstermektedir, bu da hastalığın ilerlemesinin her adımında gerekli olan bakteriyel faktörleri araştırmak için idealdir.

Bu model, farklı S. pneumoniae suşları ile intranazal olarak aşılanmış farelerde IAV enfeksiyonunu takiben akciğerlerde çeşitli bağışıklık hücrelerinin varlığını (Şekil 3'teki hücre tipleri ve geçit stratejisi) değerlendirmek için kullanılmıştır. IAV enfeksiyonunu takiben akciğerlere dağılan D39 ve TIGR4 bakteri suşları, nötrofiller (PMN'ler) ve monositler gibi dolaşımdan enflamatuar bağışıklık hücrelerinin akışında bazal çizginin üzerinde (enfekte olmayan) önemli bir artışa neden olurken, EF3030 bunu yapmadı (Şekil 4A-C). Tek başına IAV enfeksiyonu, NK hücreleri ve gama-delta T hücreleri gibi viral enfeksiyona karşı konak savunması için önemli olan bağışıklık hücrelerinin akışında taban çizgisinin üzerinde anlamlı bir artışa neden olmuştur (Şekil 4A-C). Bu antiviral yanıtlar, viral meydan okumadan önce intranazal olarak S. pneumoniae ile enfekte olmuş farelerde anlamlı derecede körelmiştir (Şekil 4A-C). Bu, S. pneumoniae taşıyıcısının tip I interferonların üretimini körelttiğini ve konağın akciğerlerdeki IAV yüklerini kontrol etme yeteneğini bozduğunu bulan sitokin yanıtlarını değerlendiren önceki çalışmalarla tutarlıdır²³. Bu bulgular, ko-enfeksiyon modelinin, mono ve polimikrobiyal enfeksiyonlarda bağışıklık tepkilerinin nasıl değiştiğini incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu model aynı zamanda S. pneumoniae TIGR4 ile intranazal olarak enfekte olmuş farelerde yaşlanmanın IAV enfeksiyonunu takiben hastalığın seyri üzerindeki etkisini değerlendirmek için de kullanılmıştır. Tek başına enfekte olmuş farelerde, viral titreler genç ve yaşlı kohortlar arasında değişmedi (Şekil 5A)²³. Önceki çalışmalarda^{olduğu gibi 23}, yaşlı fareler, daha yüksek klinik skorların gösterdiği gibi, genç meslektaşlarına kıyasla daha erken ve önemli ölçüde daha şiddetli hastalık belirtileri göstermiştir (Şekil 5B). Hastalık semptomlarıyla tutarlı olarak, S. pneumoniae ile aşılanan yaşlı fareler, IAV enfeksiyonundan sonraki 24 saat içinde daha hızlı ölmeye başladı ve hepsi hastalığa yenik düşerken, genç kontroller enfeksiyondan anlamlı derecede yüksek (% 33) bir oranda kurtuldu (Şekil 5C). Bu bulgular, ko-enfeksiyon modelinin savunmasız konakçılarda daha şiddetli hastalıkları tespit etmek için kullanılabileceğini ve ko-enfeksiyona direnç veya duyarlılık kazandıran konakçı faktörlerini araştırmak için ideal olduğunu göstermektedir.

Şekil 1: İmmün hücre akışı ve patojen yükünün değerlendirilmesi için ko-enfeksiyon ve organ işlemenin zaman çizelgesi. (A) Streptococcus pneumoniae, biyofilmlerde yetiştirilir. (B) Fareler, nazofarengeal taşıyıcılık oluşturmak için belirtilen biyofilm tarafından yetiştirilen S. pneumoniae suşunun 5 × 10⁶ CFU'su ile intranazal olarak aşılanır veya tedavi edilmeden bırakılır. Kırk sekiz saat sonra, fareler ya PBS ile taklit edilir ya da intranazal olarak 200 PFU influenza A virüsü PR8 ve intratrakeal olarak 20 PFU alırlar. Fareler klinik hastalık skorları ve sağkalım için zaman içinde izlenir. (C) IAV enfeksiyonundan sonraki 48 saatte, farklı organlarda bakteriyel CFU veya viral PFU veya akciğerlerdeki bağışıklık hücresi akışı değerlendirilir. Kısaltmalar: CFU = koloni oluşturan birimler; PFU = plak oluşturan birimler; IAV = influenza A virüsü PR8; IT = intratrakeal; NP = nazofaringeal. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: S. pneumoniae ile aşılanmış farelerin ikili intranazal/intratrakeal IAV enfeksiyonu, bakteriyel yayılmaya ve bakteriyel suşa bağlı hastalığa yol açar. Genç (10-12 haftalık) erkek C57BL/6 (B6) fareler Şekil 1'deki gibi enfekte oldu. (A) nazofarenks, (B) akciğerler ve (C) kandaki bakteri sayıları, IAV enfeksiyonundan 48 saat sonra belirlendi. (B,C) Yüzdeler, yayılma gösteren farelerin fraksiyonunu gösterir. (D) Sağkalım IAV enfeksiyonundan sonraki 10 gün boyunca izlendi. Grup başına (A,B) n = 5, (C) n = 11 ve (D) n = 6 fareden toplanan veriler gösterilir. Her daire bir fareye karşılık gelir ve kesikli çizgiler algılama sınırını gösterir. (A-C) *, Kruskal-Wallis testi ile belirlenen belirtilen gruplar arasında anlamlı bir fark (p < 0.05) olduğunu gösterir. (D) *, log-rank (Mantel-Cox) testi ile belirlenen bakteri suşu başına +sp ve Co-inf fareler arasında anlamlı bir fark (p < 0.05) olduğunu gösterir. Kısaltmalar: +sp = sadece belirtilen suşu kullanarak intranazal olarak bakterilerle enfekte olmuş fareler; Co-inf = IAV ile enfekte olmuş bakteriyel enfekte fareler; IAV = influenza A virüsü alan fareler; CFU = koloni oluşturan birimler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İmmün hücre geçit stratejisi. Akciğerler toplandı ve bağışıklık hücresi akışı akış sitometrisi ile belirlendi. Farklı hücre tiplerinin temsili geçit stratejisi gösterilmiştir. (A) CD45+, canlı tek hücreler (B) PMN'ler (Ly6G⁺, CD11b+), makrofajlar (Ly6G-, Ly6C-, F480+) ve monositler (Ly6G-, Ly6C+), (C) DC'ler (Ly6G-, CD11c+) ve NK hücreleri (NK1.1+, CD3-), (D) TCR^- γΔ ve CD8 (CD8+, TCRβ+) ve CD4 (CD4+, TCRβ⁺) yüzdeleri ve yüzdeleri ) T hücreleri belirlendi. Kısaltmalar: SSC-A = yan saçılma-tepe alanı; FSC-A = ileri saçılma-tepe alanı; FSC-H = ileri saçılma-tepe yüksekliği; SSC-W = yan dağılım-tepe genişliği; L/D = canlı/ölü; FMO = floresan eksi bir; NK = doğal katil; PMN = polimorfonükleer lökosit; DC = dendritik hücre; TCR = T hücre reseptörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Pulmoner immün yanıtlar bakteriyel suşa bağımlıdır. Genç (10-12 haftalık) C57BL/6 erkek fareler ya enfekte olmamış, belirtilen Streptococcus pneumoniae suşu (+sp) ile tek başına aşılanmış, IAV (IAV) ile tek başına mücadele etmiş ya da S. pneumoniae ve IAV (Co-inf) ile birlikte enfekte olmuştur. IAV enfeksiyonundan kırk sekiz saat sonra (Şekil 1'deki deneysel tasarıma bakınız), akciğerler toplandı ve bağışıklık hücresi akışı, Şekil 3'teki geçit stratejisini takip eden akış sitometrisi ile belirlendi. (A) CD45 kapısı içinde belirtilen her hücre tipinin ortalama yüzdeleri, ısı haritasındaki tüm tedavi grupları için görüntülenir. (B) Her fare grubu için tedaviler arasında önemli farklılıklar gösteren hücre tiplerinin temsili nokta grafikleri gösterilir. (C) Belirtilen bağışıklık hücresi tiplerinin yüzdeleri gösterilir. Her daire bir fareye karşılık gelir. (A,C) Grup başına n = 5 fareden toplanan veriler gösterilir. *, Co-inf ve enfekte olmamış arasında anlamlı bir fark (p < 0.05) gösterir; ^$, IAV ile enfekte olmamış arasında anlamlı bir değer olduğunu gösterir; #, tek başına Co-inf ve IAV arasında önemli bir fark olduğunu gösterir. Her hücre tipi için meydan okuma grupları arasındaki anlamlı farklılıklar ANOVA tarafından belirlendi ve ardından Tukey testi yapıldı. Kısaltmalar: NK = doğal katil; PMN = polimorfonükleer lökosit; DC = dendritik hücre; TCR = T hücre reseptörü; IAV = influenza A virüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Yaşlanma ve konakçının IAV/Streptococcus pneumoniae ko-enfeksiyonuna duyarlılığının artması. Genç (10-12 haftalık) ve yaşlı (21-22 aylık) C57BL/6 erkek fareler S. pneumoniae TIGR4 i.n. ve IAV i.n. ve i.t. (Şekil 1'de olduğu gibi) ile birlikte enfekte olmuş veya tek başına IAV ile tek başına mücadele etmiştir. (A) Viral titreler 48 saat sonra belirlendi. Yıldız işaretleri, Öğrencinin t-testi tarafından belirlenen istatistiksel anlamlılığı (p < 0.05) gösterir. Veriler, grup başına n = 4 fareden toplanır. (B) Klinik skor ve (C) sağkalım zaman içinde izlendi. (B) Grup başına n = 6 fareden toplanan ortalama ± SEM gösterilir. Yıldız işaretleri, Mann-Whitney testi tarafından belirlenen belirtilen zaman noktasında genç ve yaşlı fareler arasındaki istatistiksel anlamlılığı (p < 0.05) gösterir. (C) Veriler, grup başına n = 6 fareden toplanır. Yıldız işaretleri, log-rank (Mantel-Cox) testi ile belirlenen genç ve yaşlı fareler arasındaki istatistiksel anlamlılığı (p < 0.05) gösterir. Kısaltmalar: IAV = influenza A virüsü; i.n. = intranazal; i.t. = intratrakeal; SEM = ortalamanın standart hatası. Şekil 5A, Joma ve ^ark.23'ün izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

CDM için Mix I stok
Adenin	0.1 gr
D-Alanin	0.25 gr
CaCl2 Susuz	0.025 gr
Manganez Sülfat	0.03 gr
Siyanokobalamin	100 μL 10 mg/mL stok
Para-Aminobenzoik Asit	400 μL 5 mg/mL stok
Piridoksamin 2HCl	100 μL 10 mg/mL stok
CDM için Mix II hisse senedi
Arjantin	0.05 gr
Urasil	0.05 gr
CDM için Mix III hisse senedi
Ferrik Nitrat 9H2O	50 mg/mL
Ferrik Sülfat 7H2O	10 mg/mL
CDM için IV stoğu karıştırın
Beta-Nikotinamid adenin dinükleotid	25 mg/mL

Tablo 1: CDM için I, II, III ve IV stoklarını karıştırın. Kısaltma: CDM = kimyasal olarak tanımlanmış ortam.

CDM için Vitamin Karışımı Stoğu
Piridoksal Hidroklorür	0.8 gr
Tiamin Cl2	0.4 gr
Riboflavin	0.4 gr
Ca-pantotenat	0.4 gr
Biotin	0.04 gr
Folik Asit	0.4 gr
Niacinamide	0.4 gr

Tablo 2: CDM için Vitamin Karışımı Stoğu. Kısaltma: CDM = kimyasal olarak tanımlanmış ortam.

CDM için Amino Asit Stoğu
L-Alanin	0.480 gr
L-Arginin	0.250 gr
L-Asparajin	0.700 gr
L-Aspartik Asit	0.600 gr
L-Sistein	1.000 gr
L-Sistin	0.100 gr
L-Glutamik Asit	0.200 gr
L-Glutamin	0.780 gr
L-Glisin	0.350 gr
L-Histidin	0.300 gr
L-İzolösin	0.430 gr
L-Lösin	0.950 gr
L-Lizin	0.880 gr
L-Metiyonin	0.250 gr
L-Fenilalanin	0.550 gr
L-Prolin	1.350 gr
L-Serin	0.680 gr
L-Treonin	0.450 gr
L-Triptofan	0.100 gr
L-Valin	0.650 gr

Tablo 3: CDM için Amino Asit Stoğu. Kısaltma: CDM = kimyasal olarak tanımlanmış ortam.

CDM için Başlangıç Stoğu
Dekstroz	1.0 gr
Magnezyum Sülfat-7-Hidrat	0.070 gr
Potasyum Fosfat Dibazik	0.02 gr
Potasyum Fosfat Monobazik	0.1 gr
Sodyum Asetat Susuz	0.45 gr
Sodyum Bikarbonat	0.25 gr
Sodyum Fosfat Dibazik	0.735 gr
Sodyum Fosfat Monobazik	0.32 gr
CDM için Son Ekler
Kolin Klorür	0.1 gr
L-Sistein HCl	0.075 gr
Sodyum Bikarbonat	0.25 gr

Tablo 4: CDM için başlangıç stoğu ve son takviyeler. Kısaltma: CDM = kimyasal olarak tanımlanmış ortam.

Antikor/Florofor	Klon	Seyreltme Faktörü
UV uyarımı için L/D	YOK	0.38888889
Ly6G AF 488	1A8	0.25
CD11b APC	M1/70	0.25
CD11c PE	N418	0.18055556
Mouse Fc Bloğu	2.4G2	0.11111111
F4/80 PE Cy7	BM8	0.18055556
Ly6C BV605	AL-21	0.25
CD103 BV 421 Serisi	M290	0.18055556
CD45 APC-eF-780	30-F11	0.18055556

Tablo 5: Antikor paneli 1.

Antikor/Florofor	Klon	Seyreltme Faktörü
UV uyarımı için L/D	YOK	0.388888889
TCR-β APC Cy7	H57-597	0.180555556
CD4 V450 (Pasifik Mavisi)	RM4-5	0.25
CD8 BV650	53-6.7	0.180555556
Mouse Fc Bloğu	2.4G2	0.111111111
CD45 PE	30-F11	0.180555556
CD3 AF488	145-2C11	0.180555556
TCR- γΔ APC	GL-3 Serisi	0.180555556
NK1.1 AF 700 Serisi	PK136	0.180555556

Tablo 6: Antikor paneli 2.

Tartışmalar

Mevcut S. pneumoniae / IAV ko-enfeksiyon deneysel çalışmalarının çoğu, IAV ile önceden enfekte olmuş farelerin akciğerlerine bakteriyel iletime dayanmaktadır. Bu modeller, konakçıyı sekonder bakteriyel enfeksiyona duyarlı hale getiren pulmoner ortamdaki ve sistemik immün yanıttaki değişikliklerin belirlenmesine yardımcı olmuştur 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Bununla birlikte, bu modeller S. pneumoniae'nin asemptomatik bir kolonizatörden ciddi akciğer ve sistemik enfeksiyonlara neden olabilen bir patojene geçişini taklit edememiştir. Ayrıca, bu modeller üst solunum yollarında enfeksiyona duyarlılığa katkıda bulunan konakçı faktörlerini ve konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için uygun değildir. İAv enfeksiyonundan sonra pnömokokların nazofarenksten akciğere hareketi için önceki bir model, nazofarenksin bakteriyel enfeksiyonuna ve ardından viral enfeksiyona dayanıyordu. Bununla birlikte, insan hastalarda gözlenen ciddi hastalık belirtilerini yeniden üretemedi²¹. Burada tarif edilen modifiye murin enfeksiyonu modeli, S. pneumoniae'nin asemptomatik taşıyıcılıktan ciddi klinik hastalığa neden olan bir patojene geçişini özetlemektedir.

Bu modelin kritik bir adımı, nazofarenkste S. pneumoniae enfeksiyonunun kurulmasıdır. Streptococcus pneumoniae, biyofilmler oluşturur ve nazofarenksi farklı verimliliklerde kolonize eder^21,38. Tutarlı enfeksiyon oluşturmak için, şimdiye kadar test edilen biyofilm ile yetiştirilen bakteri suşlarının en az 5 × 10⁶ CFU'su gereklidir²³. Herhangi bir yeni bakteri suşunun viral enfeksiyondan önce nazofarenksin stabil enfeksiyonu için test edilmesi önerilir. Viral ko-enfeksiyon için, önceki çalışmalar, bakterilerin nazofarenksten dağılması için IAV ile intranazal enfeksiyonun gerekli olduğunu bulmuştur^21,22,23. Önceki çalışmalarda, intranazal doğum için 500 PFU IAV kullanılırken, bu çalışmada nazofarenksteki bakteri sayılarını artırmak için 200 PFU yeterliydi. IAV enfeksiyonu üst solunum yolları ile sınırlı değildir ve akciğerlere yayılabilir^39,40, bu da pulmoner ortamı bakteriyel enfeksiyon için daha izin verici hale getirmenin anahtarıdır^15,16,41. IAV'nin akciğerlere verilmesi, intranazal doğum veya anestezi uygulanan farelerin intratrakeal yerleştirilmesi ile sağlanabilir. BALB / cByJ fareleri ile yapılan önceki çalışmalar, intranazal doğumun viral pnömoni ile sonuçlandığını bulmuştur²¹; Bununla birlikte, intranazal aşılamayı takiben inokulumun akciğerlere erişimi C57BL / 6 farelerde daha sınırlıdır. C57BL/6 farelerde, virüs^23'ün tutarlı bir şekilde verilmesi için intratrakeal kurulum gereklidir. Bu modelde, önceki bakteriyel kolonizasyon, viral enfeksiyon sonrası hastalık semptomlarının ortaya çıkışını hızlandırmaktadır²³. Viral enfeksiyonun kendisi kinetik potansiyel varyasyon ile hastalık semptomlarına neden olabileceğinden, önce test edilen herhangi bir yeni viral suş için bir dizi dozun test edilmesi ve birlikte enfekte konakçılarda hızlandırılmış kinetiği ortaya çıkaran bir doz seçilmesi önerilir.

Akciğerler, bu modelde hastalık değerlendirmesi için başka bir kritik okuma sağlar. Patojen yükünün ve bağışıklık hücresi akışının değerlendirilmesi için, aynı fareden bir akciğer kullanılabilir. Bununla birlikte, enfeksiyon ve inflamasyon şiddeti loblar arasında farklılık gösterebileceğinden, çeşitli değerlendirmeler için aynı akciğerin farklı loblarının alınmaması önerilir. Aksine, tüm loblar küçük parçalara ayrılabilir, birlikte iyice karıştırılabilir ve daha sonra farklı değerlendirmeler için eşit olarak ayrıştırılabilir. Benzer şekilde, nazofarenks, bakteriyel CFU veya viral PFU ve immün yanıtın sayımı için kullanılabilir. Bununla birlikte, yıkamalardan ve dokulardan elde edilen hücre sayısı, aynı gruptaki farelerden alınan örnekleri bir araya getirmeden akış sitometrisi yapmak için çok düşüktür. Alternatif olarak, nazofarenksteki inflamasyon histolojik olarak değerlendirilebilir²³.

Bu modelin kritik bir özelliği, hastalarda görülen klinik hastalığı özetlemesidir. İnsanlarda, IAV enfeksiyonunu takiben sekonder pnömokok pnömonisi sıklıkla öksürük, nefes darlığı, ateş ve hastaneye yatışlara, solunum yetmezliğine ve hatta ölüme yol açabilecek kas ağrıları dahil olmak üzere belirgin hastalık belirtileri ile sonuçlanır 8,15,42,43. Bu model, insanlarda gözlenen ciddi klinik hastalık belirtilerini, fareler tarafından görüntülenen nefes almada zorluk (solunum skoruna yansıyan) ve genel halsizlik (duruş ve hareket skorlarına yansıyan) ve bazı sağlıklı genç kontrollerde ölüm açısından özetlemektedir. Birlikte enfekte olmuş farelerde şiddetlenen hastalık semptomları muhtemelen hem akciğerlere bakteriyel yayılımın hem de pnömokok taşıyıcısı²³ olan farelerde bozulmuş viral klirensin bir sonucudur. Modelin bir sınırlaması, klinik hastalık insidansının ve nazofarenksten bakteriyel yayılımın fareler arasında değişmesi ve bakteriyel suş, konakçı yaş ve genotip^21,22,23'ten etkilenmesidir. Bunu yansıtarak, invaziv suşlar için, lokalize enfeksiyondan (saptanabilir bakteriyemi olmadan) ölüme ilerleme 24 saat içinde gerçekleşebilir. Bu nedenle, sistemik yayılımın gerçek bir değerlendirmesi için, bakteriyemi daha kısa aralıklarla (her 6-12 saatte bir) takip edilmelidir. Benzer şekilde, hastalık skoru, özellikle ko-enfeksiyondan sonraki ilk 72 saat içinde hızla değişebilir. Bu nedenle, hastalık semptomlarını yakından izlemek için, IAV enfeksiyonundan sonraki 1-3 gün boyunca fareleri günde üç kez izlemeniz önerilir.

Özetle, bu model S. pneumoniae'nin nazofarenksin asemptomatik bir kolonizöründen, IAV enfeksiyonu üzerine pulmoner ve sistemik hastalığa neden olabilen bir patojene hareketini çoğaltır. Bu modelde IAV, nazofarenksteki bakteriyel davranışı değiştirerek, akciğere bakteriyel yayılımı artırarak ve antibakteriyel bağışıklığı değiştirerek S. pneumoniae'nin geçişini tetikler²³. Benzer şekilde, bakteriyel taşıyıcılık antiviral immün yanıtları köreltir ve akciğerlerden IAV klirensini bozar²³. Bu, bu modeli, tek ve polimikrobiyal enfeksiyonlarda bağışıklık yanıtlarındaki değişiklikleri ayrıştırmak için ideal kılar. Ek olarak, ko-enfeksiyonu takiben hastalığın seyri, kısmen, nazofarenkste bulunan pnömokokların suşuna bağlıdır. Bu nedenle, model S. pneumoniae'nin patojenik geçişine karşı asemptomatik kolonizasyon için gerekli bakteriyel faktörlerin diseksiyonu için uygundur. Son olarak, bu model yaşlanmanın ko-enfeksiyonlara duyarlılığını yeniden üretir ve bu burada test edilmemiş olmasına rağmen, konakçı arka planının hastalık seyri üzerindeki etkisini değerlendirmek için kolayca kullanılabilir. Sonuç olarak, taşıma ve hastalığın farklı adımlara ayrılması, hem patojenlerin hem de konakçının genetik varyantlarını analiz etme fırsatı sunarak, önemli bir patobiyonun konakçı ile etkileşimlerinin hastalık progresyonunun farklı aşamalarında ayrıntılı olarak incelenmesine olanak tanır. İleriye dönük olarak, bu model savunmasız konakçılar için tedavi seçeneklerini uyarlamak için kullanılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Aminobenzoic acid	Fisher	AAA1267318	Mix I stock
96-well round bottom plates	Greiner Bio-One	650101
100 µm Filters	Fisher	07-201-432
Adenine	Fisher	AC147440250	Mix I stock
Avicel	Fisher	501785325	Microcyrstalline cellulose
BD Cytofix Fixation Buffer	Fisher	BDB554655	Fixation Buffer
BD Fortessa			Flow cytometer
BD Intramedic Polyethylene Tubing	Fisher	427410	Tubing for nasal lavage
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL)	Fisher	14-823-30
BD Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure	Fisher	02-675-185	Blood collection tubes
Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide	Fisher	AAJ6233703	Mix IV stock
Biotin	Fisher	AC230090010	Vitamin stock
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	#000644	Mice used in this study
Calcium Chloride Anhydrous	Fisher Chemical	C77-500	Mix I stock
CD103 BV 421	BD Bioscience	BDB562771	Clone: M290 DF 1:200
CD11b APC	Invitrogen	50-112-9622	Clone: M1/70, DF 1:300
CD11c PE	BD Bioscience	BDB565592	Clone: N418 DF 1:200
CD3 AF 488	BD Bioscience	OB153030	Clone: 145-2C11 DF 1:200
CD4 V450	BD Horizon	BDB560470	Clone: RM4.5 DF 1:300
CD45 APC eF-780	BD Bioscience	50-112-9642	Clone: 30-F11 DF 1:200
CD45 PE	Invitrogen	50-103-70	Clone: 30-F11 DF 1:200
CD8α BV 650	BD Horizon	BDB563234	Clone: 53-6.7 DF 1:200
Choline chloride	Fisher	AC110290500	Final supplement to CDM
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems	Fisher	09-761-107	Filter sterilzation apparatus
Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks	Fisher	10-126-9
Corning Costar Clear Multiple Well Plates	Fisher	07-201-590
Corning DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate	Fisher	MT10017CM
Cyanocobalamin	Fisher	AC405925000	Mix I stock
D39	National Collection of Type Culture (NCTC)	NCTC 7466	Streptococcus pneumoniae strain
D-Alanine	Fisher	AAA1023114	Mix I stock
D-Calcium pantothenate	Fisher	AC243301000	Vitamin stock
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Starter stock
Dnase	Worthington Biochemical	LS002147
Eagles Minimum Essential Medium	ATCC	30-2003
EDTA	VWR	BDH4616-500G
EF3030	Center for Disease Control and Prevention	Available via the isolate bank request	Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name
F480 PE Cy7	BD Bioscience	50-112-9713	Clone: BMB DF 1:200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher	14-432-22	50 mL round bottom tube
Falcon Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher	14-959-11B	15 mL round bottom tube
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL)	Fisher	14-959-5	FACS tubes
FBS	Thermofisher	10437-028
Ferric Nitrate Nonahydrate	Fisher	I110-100	Mix III stock
Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors	Fisher	08-951-5	Instruments used for harvest
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops	Fisher	22-363-602	Inoculating loops
Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps	Fisher	13-812-38	Forceps for harvest
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL	Fisher	05-408-137	Micocentrifuge tubes
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (10 mL)	Fisher	14-955-459
Folic Acid	Fisher	AC216630500	Vitamin stock
Gibco RPMI 1640 (ATCC)	Fisher	A1049101
Gibco DPBS, no calcium, no magnesium	Fisher	14190250
Gibco HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Fisher	14025134
Gibco MEM (Temin's modification) (2x), no phenol red	Fisher	11-935-046
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Fisher	15-140-122
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4%	Fisher	15-250-061
Gibco Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Fisher	25-200-056
Glycerol (Certified ACS)	Fisher	G33-4
Glycine	Fisher	AA3643530	Amino acid stock
Guanine	Fisher	AAA1202414	Mix II stock
Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads	Fisher	50-112-9040
Iron (II) sulfate heptahydrate	Fisher	AAA1517836	Mix III stock
L-Alanine	Fisher	AAJ6027918	Amino acid stock
L-Arginine	Fisher	AAA1573814	Amino acid stock
L-Asparagine	Fisher	AAB2147322	Amino acid stock
L-Aspartic acid	Fisher	AAA1352022	Amino acid stock
L-Cysteine	Fisher	AAA1043518	Amino acid stock
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Fisher	AAA1038914	Final supplement to CDM
L-Cystine	Fisher	AAA1376218	Amino acid stock
L-Glutamic acid	Fisher	AC156211000	Amino acid stock
L-Glutamine	Fisher	O2956-100	Amino acid stock
L-Histidine	Fisher	AC166150250	Amino acid stock
LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Invitrogen	50-112-1524	Clone: N/A DF 1:500
L-Isoleucine	Fisher	AC166170250	Amino acid stock
L-Leucine	Fisher	BP385-100	Amino acid stock
L-Lysine	Fisher	AAJ6222514	Amino acid stock
L-Methionine	Fisher	AAA1031822	Amino acid stock
Low endotoxin BSA	Sigma Aldrich	A1470-10G
L-Phenylalanine	Fisher	AAA1323814	Amino acid stock
L-Proline	Fisher	AAA1019922	Amino acid stock
L-Serine	Fisher	AC132660250	Amino acid stock
L-Threonine	Fisher	AC138930250	Amino acid stock
L-Tryptophan	Fisher	AAA1023014	Amino acid stock
L-Valine	Fisher	AAA1272014	Amino acid stock
Ly6C BV 605	BD Bioscience	BDB563011	Clone: AL-21 DF 1:300
Ly6G AF 488	Biolegend	NC1102120	Clone: IA8, DF 1:300
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CCL-34	MDCK cell line for PFU analuysis
Magnesium Sulfate 7-Hydrate	Fisher	60-019-68	CDM starter stock
Manganese Sulfate	Fisher	M113-500	Mix I stock
MilQ water			Ultra-pure water
Mouse Fc Block	BD Bioscience	BDB553142	Clone: 2.4G2 DF 1:100
MWI VETERINARY PURALUBE VET OINTMENT	Fisher	NC1886507	Eye lubricant for infection
NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line	ATCC	CRL-1848	H292 lung epithelial cell line for biofilm growth
Niacinamide	Fisher	18-604-792	Vitamin stock
NK 1.1 AF 700	BD Bioscience	50-112-4692	Clone: PK136 DF 1:200
Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk	Fisher	50-200-5299	To remove oxygen from liquid cultures
Paraformaldehyde 4% in PBS	Thermoscientific	J19932-K2
Pivetal Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-8440	Isoflurane for anesthesia during infection
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Chemical	P288-500	Starter stock
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Chemical	P285-500	Starter stock
Pyridoxal hydrochloride	Fisher	AC352710250	Vitamin stock
Pyridoxamine dihydrochloride	Fisher	AAJ6267906	Mix I stock
Riboflavin	Fisher	AC132350250	Vitamin stock
Sodium Acetate	VWR	0530-500G	Starter stock
Sodium Azide	Fisher Bioreagents	BP922I-500	For FACS buffer
Sodium Bicarbonate	Fisher Chemical	S233-500	Starter stock and final supplement to CDM
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Chemical	S374-500	Starter stock
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher Chemical	S369-500	Starter stock
TCR APC	BD Bioscience	50-112-8889	Clone: GL-3 DF 1:200
TCRβ APC-Cy7	BD Pharmigen	BDB560656	Clone: H57-597 DF 1:200
Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin	Fisher	R01227	Blood agar plates with the antibiotic gentamicin
Thermo Scientific Trypsin, TPCK Treated	Fisher	PI20233
Thiamine hydrochloride	Fisher	AC148991000	Vitamin stock
TIGR4	ATCC	BAA-334	Streptococcus pneumoniae strain
Uracil	Fisher	AC157300250	Mix II stock
Worthington Biochemical Corporation Collagenase, Type 2, 1 g	Fisher	NC9693955