Ein Mausmodell für den Übergang von Streptococcus pneumoniae vom Kolonisator zum Krankheitserreger nach viraler Koinfektion rekapituliert altersbedingte Erkrankung

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt ein neuartiges Mausmodell für den Übergang von Pneumokokken von einem asymptomatischen Kolonisator zu einem krankheitsverursachenden Erreger während einer Virusinfektion. Dieses Modell kann leicht angepasst werden, um polymikrobielle und Wirt-Pathogen-Interaktionen während der verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs und über verschiedene Wirte hinweg zu untersuchen.

Zusammenfassung

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) ist bei den meisten Menschen ein asymptomatischer Kolonisator des Nasen-Rachen-Raumes, kann sich aber bei einer Infektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV) zu einem pulmonalen und systemischen Erreger entwickeln. Das fortgeschrittene Alter erhöht die Anfälligkeit des Wirts für sekundäre Pneumokokken-Pneumonien und ist mit einer Verschlechterung des Krankheitsverlaufs verbunden. Die Wirtsfaktoren, die diese Prozesse antreiben, sind nicht gut definiert, was zum Teil auf einen Mangel an Tiermodellen zurückzuführen ist, die den Übergang von einer asymptomatischen Kolonisierung zu einer schweren klinischen Erkrankung reproduzieren.

Diese Arbeit beschreibt ein neuartiges Mausmodell, das den Übergang von Pneumokokken von der asymptomatischen Übertragung zur Krankheit nach einer Virusinfektion nachbildet. In diesem Modell werden Mäuse zunächst intranasal mit im Biofilm gezüchteten Pneumokokken beimpft, um eine asymptomatische Übertragung zu erreichen, gefolgt von einer IAV-Infektion sowohl des Nasen-Rachenraums als auch der Lunge. Dies führt zu einer bakteriellen Ausbreitung in die Lunge, einer Lungenentzündung und offensichtlichen Krankheitsanzeichen, die bis zur Letalität führen können. Der Grad der Erkrankung ist abhängig vom Bakterienstamm und den Wirtsfaktoren.

Wichtig ist, dass dieses Modell die Anfälligkeit des Alterns reproduziert, denn im Vergleich zu jungen Mäusen zeigen alte Mäuse schwerere klinische Erkrankungen und erliegen häufiger der Krankheit. Durch die Aufteilung von Übertragung und Krankheit in verschiedene Schritte und die Möglichkeit, die genetischen Varianten sowohl des Erregers als auch des Wirts zu analysieren, ermöglicht dieses S. pneumoniae/IAV-Koinfektionsmodell die detaillierte Untersuchung der Interaktionen eines wichtigen Pathobolds mit dem Wirt in verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs. Dieses Modell kann auch als wichtiges Werkzeug zur Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele gegen sekundäre Pneumokokken-Pneumonien bei empfänglichen Wirten dienen.

Einleitung

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind grampositive Bakterien, die sich asymptomatisch im Nasen-Rachen-Raum der meisten gesunden Personen befinden ^1,2. Begünstigt durch Faktoren, die nicht vollständig definiert sind, können Pneumokokken von gutartigen Kolonisatoren des Nasen-Rachen-Raums zu Krankheitserregern übergehen, die sich auf andere Organe ausbreiten und zu schweren Infektionen führen, einschließlich Mittelohrentzündung, Lungenentzündung und Bakteriämie³. Das Erscheinungsbild einer Pneumokokkenerkrankung hängt zum Teil von stammspezifischen Unterschieden ab, einschließlich des Serotyps, der auf der Zusammensetzung der Kapselpolysaccharide basiert. Bisher wurden über 100 Serotypen charakterisiert, von denen einige mit invasiveren Infektionen assoziiert sind ^4,5. Mehrere andere Faktoren erhöhen das Risiko einer Pneumokokken-Erkrankung. Ein solcher Faktor ist die Virusinfektion, bei der das Risiko einer Pneumokokken-Pneumonie durch IAV um das 100-fache erhöht ist ^6,7. Historisch gesehen ist S. pneumoniae eine der häufigsten Ursachen für sekundäre bakterielle Pneumonien nach Influenza und wird mit schlechteren Ergebnissen in Verbindung gebracht⁸. Ein weiterer großer Risikofaktor ist das fortgeschrittene Alter. Tatsächlich ist S. pneumoniae die Hauptursache für ambulant erworbene bakterielle Pneumonien bei älteren Menschen über 65 Jahren ^9,10. Ältere Menschen machen die Mehrheit (>75%) der Todesfälle aufgrund von Lungenentzündung und Influenza aus, was darauf hindeutet, dass die beiden Risikofaktoren - Alterung und IAV-Infektion - die Krankheitsanfälligkeit synergistisch verschlechtern^11,12,13,14. Die Mechanismen, durch die eine Virusinfektion den Übergang von Pneumokokken von asymptomatischen Kolonisatoren zu invasiven Erregern bewirkt, und wie dies durch Wirtsfaktoren beeinflusst wird, sind jedoch noch wenig geklärt. Dies ist vor allem auf das Fehlen eines Kleintiermodells zurückzuführen, das den Übergang von der asymptomatischen Pneumokokken-Besiedlung zur kritischen klinischen Erkrankung rekapituliert.

Koinfektionsstudien wurden klassischerweise an Mäusen durchgeführt, die 7 Tage nach einer Influenzainfektion mit Pneumokokken direkt in die Lunge inokuliert wurden^15,16. Dies reproduziert die Anfälligkeit für sekundäre bakterielle Pneumonien und ist ideal, um zu untersuchen, wie antivirale Immunantworten die antibakterielle Abwehr beeinträchtigen¹⁷. Längsschnittstudien am Menschen haben jedoch gezeigt, dass der Pneumokokken-Transport im Nasopharynx, wo die Bakterien asymptomatische Biofilme bilden können¹⁸, einheitlich mit invasiven Erkrankungen assoziiert ist^19,20. Bakterielle Isolate aus Infektionen des Mittelohrs, der Lunge und des Blutes sind genetisch identisch mit denen, die im Nasen-Rachen-Raum vorkommen²⁰. Um den Übergang von einer asymptomatischen Trägerkrankheit zu einer invasiven Erkrankung nach einer IAV-Infektion zu untersuchen, wurde daher ein Modell etabliert, in dem Mäusen intranasal Biofilm-gewachsene Pneumokokken verabreicht wurden, gefolgt von einer IAV-Infektion des Nasopharynx^21,22. Eine Virusinfektion der oberen Atemwege führte zu Veränderungen in der Wirtsumgebung, die zur Ausbreitung von Pneumokokken aus Biofilmen und deren Ausbreitung in die unteren Atemwege führten²¹. Diese dispergierten Bakterien wiesen eine hochregulierte Expression von Virulenzfaktoren auf, die für die Infektion wichtig sind, und wandelten sie von Kolonisatoren in Krankheitserreger um²¹. Diese Beobachtungen verdeutlichen die komplexe Interaktion zwischen Virus, Wirt und Bakterien und zeigen, dass die durch eine Virusinfektion ausgelösten Veränderungen des Wirts einen direkten Einfluss auf das Verhalten der Pneumokokken haben, was wiederum den Verlauf der bakteriellen Infektion verändert. Dieses Modell ist jedoch nicht in der Lage, die beim Menschen beobachteten schweren Krankheitszeichen zu rekapitulieren, wahrscheinlich weil das Virus auf die Nasenhöhle beschränkt ist und die systemischen Auswirkungen einer Virusinfektion auf die Immunität des Wirts und die Lungenschädigung nicht rekapituliert werden.

Wir haben kürzlich ein Modell entwickelt, das die komplexe Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserregern berücksichtigt, aber auch die beim Menschen beobachtete Schwere der Krankheit genauer nachahmt²³. In diesem Modell werden Mäuse zunächst intranasal mit im Biofilm gewachsenen Pneumokokken infiziert, um eine asymptomatische Übertragung zu erreichen, gefolgt von einer IAV-Infektion sowohl des Nasen-Rachenraums als auch der Lunge. Dies führte zu einer bakteriellen Ausbreitung in die Lunge, einer Lungenentzündung und einer Erkrankung, die bei einem Bruchteil der jungen Mäuse tödlich endete²³. Diese frühere Studie zeigte, dass sowohl eine virale als auch eine bakterielle Infektion die Abwehr des Wirts veränderten: Die Virusinfektion förderte die bakterielle Verbreitung, und eine vorherige bakterielle Besiedlung beeinträchtigte die Fähigkeit des Wirts, den pulmonalen IAV-Spiegel zu kontrollieren²³. Die Untersuchung der Immunantwort zeigte, dass eine IAV-Infektion die antibakterielle Aktivität der neutrophilen Granulozyten verringerte, während die bakterielle Besiedlung die für die antivirale Abwehr entscheidende Typ-I-Interferonantwort abstumpfte²³. Wichtig ist, dass dieses Modell die Anfälligkeit des Alterns reproduziert. Im Vergleich zu jungen Mäusen zeigten alte Mäuse früher Krankheitsanzeichen, zeigten schwerere klinische Erkrankungen und erlagen häufiger einer Infektion²³. Die in diesem Manuskript vorgestellte Arbeit zeigt, dass der Ausmaß der Erkrankung auch vom Bakterienstamm abhängt, da invasive Pneumokokkenstämme eine effizientere Ausbreitung bei IAV-Infektion zeigen, offenkundigere Anzeichen einer Lungenentzündung zeigen und im Vergleich zu nicht-invasiven Stämmen zu beschleunigten Krankheitsraten führen. Somit erlaubt dieses S. pneumoniae/IAV-Koinfektionsmodell die detaillierte Untersuchung sowohl von Erreger- als auch von Wirtsfaktoren und eignet sich gut für die Untersuchung von Immunantworten auf polymikrobielle Infektionen in den verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University at Buffalo genehmigt.

1. Herstellung chemisch definierter Medien (CDM)

1. Bereiten Sie die Bestände wie folgt vor:
   1. Die in Tabelle 1 aufgeführten Mischungs-I-Verbindungen werden unter Rühren in 100 ml Reinstwasser gelöst. In 200-μl-Aliquoten bei −20 °C lagern.
   2. Die in Tabelle 1 aufgeführten Mischung-II-Verbindungen werden in 20 ml 0,1 M NaOH unter Rühren gelöst. In 100-μl-Aliquoten bei −20 °C lagern.
   3. Die in Tabelle 1 aufgeführten Mischungs-III-Verbindungen werden unter Rühren in 1 ml Reinstwasser gelöst. In 10-μl-Aliquoten bei 4 °C lagern.
   4. Lösen Sie die in Tabelle 1 aufgeführte Mischung IV-Verbindung unter Rühren in 1 ml Reinstwasser auf. In 10-μl-Aliquoten bei −20 °C lagern.
   5. Die in Tabelle 2 aufgeführten Verbindungen werden zunächst unter Rühren in 15 ml Reinstwasser gelöst. Stellen Sie den pH-Wert mit ein paar Tropfen 0,1 M NaOH auf 7,0 ein und stellen Sie das Endvolumen mit Reinstwasser auf 20 ml ein. In 1-ml-Aliquoten bei −20 °C lagern.
   6. Die in Tabelle 3 aufgeführten Verbindungen werden in 90 ml Reinstwasser auf einer Heizplatte bei 50 °C unter Rühren gelöst. Stellen Sie den pH-Wert mit 0,1 M NaOH auf 7,0 ein und stellen Sie dann das Endvolumen mit Reinstwasser auf 100 ml ein. In 5-ml-Aliquoten bei −20 °C lagern.
2. Stellen Sie die Starterbrühe jedes Mal frisch her, indem Sie die Verbindungen in Tabelle 4 in 70 ml Reinstwasser unter Rühren auflösen.
3. Fügen Sie dem frischen Startervorrat der Reihe nach die folgenden Mischvorräte hinzu: 200 μl Mix I-Vorrat (Tabelle 1), 80 μl Mix II-Vorrat (Tabelle 1), 10 μl Mix III-Vorrat (Tabelle 1), 10 μl Mix IV-Vorrat (Tabelle 2), 1 ml Vitaminvorrat (Tabelle 3) und 5 ml Aminosäurevorrat (Tabelle 4).
4. Sobald die Brühen hinzugefügt wurden, stellen Sie das Endvolumen auf 100 ml ein, indem Sie 30 ml Reinstwasser in das Becherglas geben.
5. Ergänzen Sie das CDM mit Verbindungen aus Tabelle 4. Nach gründlichem Mischen filtrieren-sterilisieren und bei 4 °C maximal 2 Wochen lagern.

2. Züchtung des Biofilms von S. pneumoniae

1. Bereiten Sie RP-10-Medium vor, indem Sie 445 ml RPMI 1640 mit 50 ml hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FBS) und 5 ml Penicillin/Streptomycin bei 10.000 U/ml bzw. 10.000 μg/ml mischen.
2. Züchten Sie die NCI-H292 (H292) Mukoepidermoidkarzinom-Zelllinie. Geben Sie die Zellen aus einem gekauften Fläschchen in 5 ml RP-10-Medium in einen T-25-Gewebekulturkolben. Bei 37 °C/5% CO₂ für 3-5 Tage inkubieren, um eine 100%ige Konfluenz zu erreichen.
3. Überprüfen Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop mit 10-facher Vergrößerung, um die Konfluenz zu beurteilen.
   HINWEIS: Wenn alle Zellen mit anderen Zellen in Kontakt stehen und keine Lücken dazwischen vorhanden sind, ist die gewünschte 100%ige Konfluenz erreicht.
4. Waschen Sie die Zellen 2x in 5 ml PBS bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass der Puffer kalziumfrei ist, um eine Chelatbildung des EDTA im folgenden Schritt zu vermeiden.
5. 1 ml Trypsin-EDTA in den Kolben geben und bei 37 °C/5% CO₂ 5-10 min inkubieren, bis sich die Zellen lösen. Neutralisieren Sie mit 4 ml RP-10-Medium. Vorsichtig mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und in ein konisches 50-ml-Röhrchen umfüllen.
6. Geben Sie 500 μl der Zellsuspension pro Well in eine mit Gewebekulturen behandelte 24-Well-Platte. Von einem konfluenten T-25-Kolben erwarten Sie 2 × 10 6-4 × 10⁶ Zellen/ml.
7. Kontrollieren Sie die Zellen am nächsten Tag unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass sie konfluent sind, wie in Schritt 2.3 beschrieben. Wenn dies nicht der Fall ist, brüten Sie länger.
8. Sobald die H292-Zellen in der 24-Well-Platte zu 100 % konfluent sind, waschen Sie die Zellen vorsichtig 3x mit 1 ml PBS bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass kein Medium mit Antibiotika oder Schmutz zurückbleibt.
9. Fügen Sie nach dem Waschen der Zellen 250 μL/Well 4% Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen zu fixieren. Entweder 1 h auf Eis oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
10. In der Nacht vor der Zellfixierung wird der interessierende S. pneumoniae-Stamm auf Blutagarplatten gestreift und über Nacht bei 37 °C/5 % CO₂ inkubiert.
    HINWEIS: Die hier vorgestellten Daten beziehen sich auf die folgenden S. pneumoniae-Stämme, die durch kollaborativen Austausch gewonnen wurden: Serotyp 19F Otitis media Isolat EF3030 24, klassischer Serotyp 2 Avery-Stamm D39²⁵ und Serotyp 4 Bakteriämieisolat^{TIGR4 26}. Die Stämme sind auch in öffentlichen Sammlungen erhältlich, auf die in der Materialtabelle verwiesen wird.
11. Bereiten Sie CDM plus Oxyrase (0,15 U/ml) zu, indem Sie 100 μl Oxyrase (30 U/ml) zu 20 ml CDM hinzufügen.
    HINWEIS: Oxyrase wird verwendet, um Sauerstoff zu eliminieren, um das effiziente Wachstum von S. pneumoniae in Flüssigkultur²⁷ zu ermöglichen.
12. Beimpfen Sie die Bakterien von der Platte in frisches CDM + Oxyrase, indem Sie die Bakterien von der Platte waschen, indem Sie 1 ml CDM + Oxyrase hinzufügen und die Bakterienkolonien vorsichtig mit der Seite einer 1-ml-Pipettenspitze anheben, wobei Sie darauf achten, dass der Agar nicht abgekratzt wird. Alternativ können Sie eine Impfschleife verwenden, um die Bakterien anzuheben und sie in ein Röhrchen mit 1 ml CDM + Oxyrase zu impfen.
13. Verdünnen Sie die Bakterien in CDM + Oxyrase auf einen Start-OD₆₀₀ von 0,05.
14. Die Bakterien werden in einem locker verschlossenen konischen 50-ml-Röhrchen bei 37 °C/5 % CO 2 gezüchtet, bis ein OD₆₀₀ von 0,2 erreicht ist (dies dauert zwischen₂ und 5 Stunden). Überprüfen Sie den Außendurchmesser₆₀₀ stündlich, um sicherzustellen, dass der Außendurchmesser 0,2 nicht überschreitet.
15. Sobald der OD 0,2 erreicht hat, wird das Bakterienkulturröhrchen vortexiert. Säen Sie 0,5 ml der Bakterien auf die fixierten H292-Zellen und fügen Sie weitere 0,5 ml CDM + Oxyrasemedium pro Vertiefung hinzu. Geben Sie 1 ml CDM + Oxyrase in die Kontrollvertiefungen ohne Bakterien. Die Platte wird 48 h lang bei 34 °C/5 % CO₂ inkubiert.
    HINWEIS: Das Wachstum bei 34 °C wird verwendet, um die niedrigere Temperatur im Nasopharynx besser nachzuahmen²¹.
16. Entfernen Sie alle 12 Stunden nach der ersten Aussaat vorsichtig 0,5 ml des Mediums und füllen Sie es mit 0,5 ml frischem CDM + Oxyrase auf. Achten Sie darauf, den sich bildenden Biofilm nicht zu stören. Überprüfen Sie die Unterseite der Platte auf Biofilm und achten Sie darauf, dass die Trübung im Laufe der Zeit aufgrund des Wachstums des Biofilms zunimmt. Um die Vertiefungen auf Verunreinigungen zu kontrollieren, überprüfen Sie die Vertiefungen ohne Bakterien, um sicherzustellen, dass die Vertiefungen frei bleiben.
17. 48 h nach der Impfung den Überstand entfernen und 2x sehr schonend mit 1 ml PBS waschen. In 1 ml frischem CDM resuspendieren und kräftig auf und ab pipettieren, um den Biofilm anzuheben. Für jeden Bakterienstamm werden die Bakterien aus allen Vertiefungen in einem konischen 50-ml-Röhrchen zusammengefasst. Mischen Sie gut, indem Sie das fest verschlossene Röhrchen mehrmals vorsichtig auf und ab kippen.
18. In das konische 50-ml-Röhrchen werden 40 % Glycerin in CDM in gleichen Mengen gegeben, um eine bakterielle Suspension mit einer Endkonzentration von 20 % Glycerin zu erhalten. 1 ml in Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren, auf Trockeneis schockgefrieren und bei −80 °C aufbewahren.
19. Zählen Sie die Bakterien vor der Verwendung auf, indem Sie ein Aliquot auf Eis auftauen, das Röhrchen 5 Minuten lang bei 1.700 × g drehen, den Überstand entfernen, das Pellet in 1 ml PBS resuspendieren und serielle Verdünnungen auf Blutagarplatten²⁸ plattieren.
20. Die Agarplatten werden über Nacht bei 37 °C/5 % CO₂ gezüchtet und die Kolonien bei entsprechenden Verdünnungen gezählt, um die Bakterienkonzentration in koloniebildenden Einheiten (KBE)/ml zu erhalten.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Bakterien in den Beständen mindestens einen Tag nach dem Einfrieren oder später zu zählen, da die Lebensfähigkeit der Bakterien innerhalb der ersten 24 Stunden abnimmt. Die eingelagerten gefrorenen Aliquots können für eine anschließende Infektion von Mäusen für maximal 2 Monate verwendet werden.

3. Intranasale Inokulation von Mäusen mit Biofilm-gezüchteten S. pneumoniae

1. Kaufen Sie Mäuse und verwenden Sie sie im gewünschten Alter.
   HINWEIS: Mäuse im Alter von 3-4 Monaten werden bevorzugt, um junge Wirte zu modellieren, und Mäuse im Alter von 21-24 Monaten können verwendet werden, um ältere Individuen >65 Jahren im Alter von²⁹ Jahren zu modellieren. Die hier vorgestellten Daten beziehen sich auf männliche C57BL/6-Mäuse.
2. Tauen Sie die im Biofilm gewachsenen bakteriellen Aliquots auf Eis auf und schleudern Sie sie 5 Minuten lang bei 1.700 × g . Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu beschädigen, waschen Sie die Bakterien, indem Sie das Pellet in 1 ml PBS resuspendieren, und schleudern Sie ihn erneut 5 Minuten lang bei 1.700 × g . Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in dem Volumen, das erforderlich ist, um die gewünschte Konzentration zu erreichen (5 × 10⁶ KBE/10 μl für die intranasale Inokulation anstreben). Bestätigen Sie die verabreichten Bakterienmengen, indem Sie das vorbereitete Inokulum wie in Schritt 2.19 beschrieben auf Blutagarplatten plattieren.
3. Die Mäuse werden intranasal mit 5 × 10⁶ KBE beimpft, indem 5 μl des verdünnten Inokulums in jede Naris pipettiert werden. Achten Sie darauf, die Mäuse fest zu halten und den Kopf zu stabilisieren, bis das Volumen eingeatmet ist (normalerweise innerhalb von Sekunden nach dem Pipettieren des Volumens in die Nasenlöcher). Führen Sie diesen Schritt ohne Anästhesie durch, um eine pulmonale Aspiration des Inokulums zu verhindern.

4. Virusinfektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV)

1. 48 h nach intranasaler Inokulation mit S. pneumoniae wird der interessierende IAV-Stamm auf Eis aufgetaut.
   HINWEIS: Die hier vorgestellten Daten beziehen sich auf einen an die Maus angepassten Stamm des Influenza-A-Virus A/PR/8/34 H1N1, der durch kollaborativen Austausch³⁰ gewonnen wurde.
2. Sobald das Virus aufgetaut ist, verdünnen Sie das Virus in PBS auf die gewünschte Konzentration. Streben Sie 20 plaquebildende Einheiten (PFU)/50 μl für intratracheale Infektionen und 200 PFU/10 μl für intranasale Infektionen an. Verwenden Sie für Gruppen mit Scheininfektionen und reinen Bakterien PBS, um die Mäuse zu impfen.
3. Tragen Sie vor der Narkose ophthalmisches Gleitmittel auf die Augen der Mäuse auf. Betäuben Sie die Mäuse mit 5% Isofluran und bestätigen Sie die Anästhesie durch eine feste Zehenklemme.
4. Sobald das Tier betäubt ist, entfernen Sie es aus der Isoflurankammer und infizieren Sie die anästhesierten Mäuse sofort intratracheal mit 50 μl (20 PFU) IAV, wobei Sie eine stumpfe Pinzette verwenden, um die Zunge aus dem Maul zu ziehen und das Flüssigkeitsvolumen in die Luftröhre zu pipettieren.
5. Setzen Sie die Mäuse in einen separaten Käfig und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig erholt haben (sie sind in der Lage, die Brustbeinlage beizubehalten [in der Lage, aufrecht auf der Brust zu liegen]).
6. Nach der Genesung werden die Mäuse sofort intranasal mit 10 μL (200 PFU) IAV unter Verwendung der Inokulationsmethode in Schritt 3.3 inokuliert.
7. Hausmäuse, die eine einzelne oder doppelte bakterielle und virale Infektion mit derselben Infektionsgruppe durchgemacht haben, trennen sie von den anderen Gruppen.

5. Überwachung der Mäuse auf Krankheitssymptome

1. Überwachen Sie die Mäuse täglich für mindestens 10 Tage und bewerten Sie blind auf Anzeichen von Krankheit wie folgt:
   1. Bewerten Sie die Gewichtsabnahme wie folgt: 0 = 5 % oder weniger; 1 = 5%-10%; 2 = 10%-15%; 3 = 20 % oder mehr. Euthanasieren Sie die Mäuse durch CO_{2 -} Inhalation, wenn der Gewichtsverlust bei 3 liegt.
   2. Bewerten Sie die Aktivität wie folgt: 0 = normal/aktiv; 1 = bewegt, aber leicht vermindert; 2 = vermindert; 3 = stark vermindert/lethargisch (bewegt sich nur bei Berührung), 4 = Koma/unbeweglich. Schläfern Sie die Mäuse ein, wenn der Aktivitätswert bei 3 liegt.
   3. Bewerten Sie die Körperhaltung wie folgt: 0 = keine Ahnung (normal); 1 = leicht gebeugte Haltung; 2 = starke Vermutung. Euthanasieren Sie die Mäuse, wenn der Haltungswert bei 2 liegt.
   4. Für die Augen wie folgt bewerten: 0 = normal; 1 = hervorstehend; 1 = versunken; 1 = geschlossen; 1 = Entladung. Es kann eine Kombination sein. Addieren Sie die Summen für den endgültigen Augenwert.
   5. Bewerten Sie die Atmung wie folgt: 0 = Normale Atmung; 1 = unregelmäßig oder verändert (höhere/niedrigere Rate); 2 = angestrengt (übertriebene Anstrengung oder Keuchen). Euthanasieren Sie die Mäuse, wenn der Atemwert bei 2 liegt.
2. Addieren Sie auf der Grundlage der oben genannten Kriterien die Einzelwerte für einen klinischen Gesamtwert von gesund (0) bis extrem krank (15). Betrachten Sie jede Maus, die eine Gesamtpunktzahl über 2 anzeigt, als krank. Lassen Sie alle Mäuse, die eine Gesamtpunktzahl über 9 oder die angegebenen Werte für jedes Kriterium aufweisen, auf humane Weise einschläfern und markieren Sie sie auf der Überlebenskurve.

6. Aufbereitung von infiziertem Gewebe zur Bakterienzählung

1. 48 Stunden nach der IAV-Infektion werden die Mäuse eingeschläfert.
2. Legen Sie die Maus in Rückenlage. Besprühen Sie mit 70% Ethanol die Brust und den Bauch der Maus, um das Fell zu reinigen. Kneifen Sie das Fell und die Haut mit einer Pinzette in der Mitte der Maus zusammen und schneiden Sie das Fell mit einer 4,5-Zoll-Sezierschere ab, um den Bereich von der Leber bis zur Brust freizulegen.
3. Blutentnahme
   1. Schneiden Sie mit einer Sezierschere vorsichtig in die Bauchhöhle, um die Leber freizulegen. Legen Sie mit einer Pinzette die Leberpfortader an der Oberseite der Leber in der Nähe des Zwerchfells frei. Trennen Sie die Leberpfortader mit der Präparierschere. Sobald sich das Blut in der Peritonealhöhle ansammelt, werden 10 μl Blut mit einer Mikropipette entnommen und in 90 μl gerinnungshemmende Lösung (50 mM EDTA-Lösung in PBS) in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, um die Bakterienbelastung zu untersuchen.
   2. Verwenden Sie eine P-1000-Mikropipette, um den Rest des Blutes zu sammeln, geben Sie es in ein Blutentnahmeröhrchen und zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 7.600 × g , um das Serum zu gewinnen. Bewahren Sie die Seren in Mikrozentrifugenröhrchen bei −80 °C auf, um anschließend ein gewünschtes Zytokin oder einen gewünschten Metaboliten zu analysieren.
4. Lungenentnahme
   1. Machen Sie mit einer Sezierschere einen Schnitt an den Seiten des freiliegenden Brustkorbs und ziehen Sie die Rippen vorsichtig nach oben in Richtung des Kopfes der Maus, um das Herz freizulegen. Führen Sie eine 25-G-Nadel, die an einer 10-ml-Spritze befestigt ist, die mit PBS vorgefüllt ist, in die rechte Herzkammer ein und beginnen Sie langsam mit der Perfurizierung. Achten Sie auf eine Bleiche der Lunge als Indikator für eine erfolgreiche Durchblutung. Spülen Sie langsam, um einen Bruch des Lungengewebes zu vermeiden.
   2. Heben Sie das Herz mit der Pinzette an und machen Sie einen Schnitt, um Lunge und Herz zu trennen. Nehmen Sie nach der Trennung alle Lungenlappen mit der Pinzette auf und spülen Sie sie in einer Schale mit sterilem PBS aus, um das restliche Blut zu entfernen. In einer Petrischale die Lunge in kleine Stücke schneiden und gut vermischen. Entfernen Sie die Hälfte der Lungenmischung zur Bestimmung der bakteriellen KBE oder des viralen PFU und legen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen mit rundem Boden, das zur Homogenisierung mit 0,5 ml PBS vorgefüllt ist.
      HINWEIS: Es ist wichtig, nicht verschiedene Lappen desselben Lungenflügels für die verschiedenen Untersuchungen zu nehmen. Stattdessen sollten alle Lappen zerkleinert, gut miteinander vermischt und für die verschiedenen Bewertungen gleichmäßig analysiert werden.
   3. Entfernen Sie die andere Hälfte der Lunge für die Durchflusszytometrie (Abschnitt 7 unten) und legen Sie sie in eine mit Nichtgewebekulturen behandelte 24-Well-Platte, wobei jede Vertiefung mit 0,5 ml RP-10 vorgefüllt ist. Bis zur Verarbeitung bei Raumtemperatur stehen lassen.
5. Nasopharynx-Kollektion
   1. Schneiden Sie am Hals mit der Sezierschere das Fell ab, schneiden Sie dann den Muskel ab und legen Sie die Luftröhre frei.
      HINWEIS: Die Luftröhre ist eine röhrenartige Struktur, die sich unter dem Muskel befindet.
   2. Platzieren Sie eine kleine Pinzette unter der Luftröhre in einem Abstand von 1 cm vom Kiefer der Maus, um sie zu stabilisieren. Machen Sie mit einer Sezierschere vorsichtig einen 0,1 cm großen Schlitz auf dem vorderen Teil der Luftröhre, um zu vermeiden, dass die Luftröhre vollständig durchtrennt wird.
   3. Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze vor, die mit 0,5 ml PBS gefüllt ist, mit einem 0,58-mm-Schlauch, der an einer 25-g-Nadel befestigt ist. Sammeln Sie die Nasenspülung, indem Sie den Schlauch in die Luftröhre einführen, die nach oben in Richtung Nasopharynx führt. Sobald ein Widerstand in die Nasenhöhle eindringt, platzieren Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen an der Nase und spülen Sie das PBS langsam durch die Luftröhre, um die Nasenspülung aufzufangen.
   4. Platzieren Sie die Maus in Bauchlage. Besprühen Sie den Kopf der Maus mit Ethanol. Verwenden Sie eine Sezierschere, um das Fell zu schneiden, und ein Mystacial-Pad, um den Kopfknochen der Maus freizulegen.
   5. Machen Sie mit der Präparierschere einen 1 cm langen Schnitt an den Seiten des Unterkiefers und zwischen den Augen. Ziehen Sie die Gesichtsknochen mit einer Pinzette langsam vom Körper weg, um die Nasenhöhle freizulegen.
   6. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Nasengewebe vorsichtig zu entfernen, und legen Sie es zur Homogenisierung in ein rundes Bodenröhrchen, das mit 0,5 ml PBS vorgefüllt ist.
6. Um das gesammelte Gewebe zu homogenisieren, reinigen Sie zunächst die Homogenisatorsonde, indem Sie sie in 70 % Ethanol einlegen und den Homogenisator 30 s lang mit 60 % Leistung einschalten. Wiederholen Sie den Schritt in sterilem Wasser für 10 s. Homogenisieren Sie jedes Gewebe für 1 min. Reinigen Sie die Homogenisatorsonde zwischen jeder Probe in sterilem Wasser und in einem frischen Röhrchen mit 70%igem Ethanol zwischen jedem Organ und jeder Probengruppe.
7. Zählung der Bakterienzahlen
   1. Sobald alle Organe entnommen und homogenisiert wurden, werden serielle Verdünnungen auf Blutagarplatten aufgetragen. Um die Gesamtkbe zu berechnen, verwenden Sie 10 μl zum Plattieren und notieren Sie das endgültige Volumen in ml für jede Probe. Die Nasopharynxproben werden auf Blutagarplatten plattiert, die mit 3 μg/ml Gentamicin angereichert sind, um das Wachstum von S. pneumoniae zu selektieren und gleichzeitig das Wachstum anderer Mikroorganismen zu hemmen, die dieses Gewebe besiedeln. Über Nacht bei 37 °C/5 % CO₂ inkubieren.
   2. Um die bakterielle KBE für Lunge und Nasopharynx zu zählen, zählen Sie zunächst die Kolonien auf den Blutagarplatten. Verwenden Sie dann Gleichung (1) und Gleichung (2), um die Menge pro ml und die Gesamtzahl zu berechnen.
      Menge pro ml = Anzahl der Kolonien × Verdünnungsfaktor × 100 (1)
      Gesamtzahl = Menge pro ml × Gesamtvolumen pro Probe (2)
      Anmerkungen: In Gleichung (1) wird 100 zur Multiplikation verwendet, da 10 μL plattiert sind, was einer 100-fachen Verdünnung von 1 ml entspricht. Das Gesamtvolumen pro Probe in Gleichung (2) stammt aus Schritt 6.7.1, woraus sich die Nachweisgrenze von 100 pro Organ ergibt.
   3. Um die bakterielle KBE bei Bakteriämie zu zählen, zählen Sie zunächst die Kolonien auf den Blutagarplatten. Verwenden Sie dann Gleichung (3), um die Menge pro ml Blut zu bestimmen.
      Menge pro ml Blut = Anzahl der Kolonien × Verdünnungsfaktor × 100 × 10 (3)
      ANMERKUNG: In Gleichung (3) wird 100 verwendet, wenn 10 μL plattiert wird, was einer 100-fachen Verdünnung von 1 ml entspricht, und 10 bedeutet eine 1:10-Verdünnung des Blutes in Antikoagulans. Daraus ergibt sich die Nachweisgrenze von 1.000/ml.

7. Aufbereitung der Lungenproben für die Durchflusszytometrie

1. Bereiten Sie die erforderlichen Medien wie folgt vor:
   1. Bereiten Sie RP-10 wie in Schritt 2.1 beschrieben vor.
   2. Bereiten Sie den Verdauungspuffer vor, indem Sie RP-10 mit 2 mg/ml Kollagenase und 30 μl/ml DNase I mischen.
   3. Herstellen von Lysepuffer durch Auflösen von 8,29 g_NH4Cl, 1 g NaHCO3 und 0,038 g EDTA in 1 L_H2O.
   4. Bereiten Sie 10x FACS-Puffer vor, indem Sie 450 ml HBSS mit 50 ml hitzeinaktiviertem FBS und 5 g Natriumazid mischen.
   5. Bereiten Sie 1x FACS-Puffer vor, indem Sie 50 ml 10x FACS-Puffer in 450 ml HBSS verdünnen.
2. Die Lungenproben aus Schritt 6.4.3 werden entnommen und in eine 24-Well-Platte gegeben. Geben Sie 500 μl Aufschlusspuffer in jede Vertiefung. 45 min bis 1 h bei 37 °C/5% CO₂ inkubieren.
3. Füllen Sie konische 50-ml-Röhrchen für jede Probe mit 5 ml RP-10 vor. Wenn die Inkubation beendet ist, platzieren Sie einen 100-μm-Filter oben auf dem konischen 50-ml-Röhrchen und benetzen Sie es mit 1 ml RP-10.
4. Bewegen Sie die verdaute Lunge mit einer P-1000-Mikropipette und legen Sie sie auf den Filter. Verwenden Sie den Kolben einer 3-ml-Spritze, um das Organ zu zerdrücken. Spülen Sie jedes Mal 2x mit 1 ml RP-10.
5. Schleudern Sie die Proben bei 4 °C und 327 × g für 5 min. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Lysepuffer. 3 Minuten einwirken lassen, damit die roten Blutkörperchen lysiert werden können. Mit 5 ml RP-10 neutralisieren.
6. Schleudern Sie die Proben bei 4 °C und 327 × g für 5 min. Saugen Sie den Überstand an, resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml RP-10 und entnehmen Sie 10 μl zum Zählen der Proben.
7. Schleudern Sie die Proben bei 4 °C und 327 × g für 5 min. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in RP-10 bei 2 × 10^6-4 × 10⁶ Zellen/ml. Von jeder Probe werden 60 μl in eine 96-Well-Platte gegeben, um die gewünschten Zelltypen²³ zu färben, die in Schritt 7.9, Tabelle 5 und Tabelle 6 aufgeführt sind.
8. Den Teller bei 4 °C und 327 × g 5 min schleudern.
9. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Antikörper-Mastermixe, die fluoreszierenden minus eins (FMOs) und die Einzelfärbungskontrollen mit den gewünschten Antikörpern vor. Für die Färbung von polymorphkernigen Leukozyten (PMNs), Makrophagen, Monozyten, dendritischen Zellen und T-Zellen werden die in Tabelle 5 und Tabelle 6 aufgeführten Antikörper und Endverdünnungen verwendet. Verwenden Sie ein Gesamtvolumen von 100 μl/Well der Antikörpermischung. Befolgen Sie die in den Tabellen aufgeführten Verdünnungen, um das geeignete Volumen des Mastermixes und die einzelnen erforderlichen Antikörper zu bestimmen.
10. Wenn der Schleudergang beendet ist (Schritt 7.8), wird der Überstand umgefüllt, die Pellets in 100 μl der Antikörpermischungen, FMOs oder Einzelfärbungskontrollen resuspendiert und 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis inkubiert.
11. Waschen Sie die Zellen 2x, indem Sie 150 μl FACS-Puffer in die Vertiefungen geben und die Platte 5 Minuten lang bei 4 °C und 327 × g schleudern.
12. Wenn der Schleudergang beendet ist, wird der Überstand umgefüllt, die Pellets in 100 μl Fixierungspuffer resuspendiert und 20 Minuten auf Eis inkubiert.
13. Waschen Sie die Zellen 2x, indem Sie 150 μl FACS-Puffer in die Vertiefungen geben und die Platte 5 Minuten lang bei 4 °C und 327 × g schleudern.
14. Bereiten Sie markierte FACS-Röhrchen mit 200 μl FACS-Puffer vor. Resuspendieren Sie die Pellets in 150 μl FACS-Puffer. Filtern Sie jede Probe einzeln mit einem 100-μm-Filter in das entsprechende FACS-Röhrchen. Auf Eis oder bei 4 °C aufbewahren und bis zur Analyse vor Licht schützen.
15. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer.

8. Plaque-Assay zur Zählung von IAV

1. Bereiten Sie die erforderlichen Medien wie folgt vor:
   1. Bereiten Sie das Infektionsmedium vor, indem Sie 2,5 g Kälberserumalbumin (BSA) in 40 ml DMEM unter Rühren bei 37 °C für 10-20 Minuten auflösen, bis es sich aufgelöst hat. Filter-Sterilisation in 460 ml DMEM.
   2. Bereiten Sie 2,4 % mikrokristalline Cellulose vor, indem Sie 1,2 mg mikrokristalline Cellulose in 50 ml_H2Oauflösen. Autoklavieren Sie es auf der Flüssigkeitseinstellung und lagern Sie es bei Raumtemperatur.
   3. Bereiten Sie 5 % BSA DMEM zu, indem Sie 2,5 g BSA in 40 ml DMEM unter Rühren bei 37 °C für 10-20 Minuten auflösen. Fügen Sie die restlichen 10 ml DMEM hinzu, um ein Endvolumen von 50 ml zu erhalten. Filtersterilisieren und bei 4 °C lagern.
   4. Bereiten Sie 2x MEM/0,5 % BSA vor, indem Sie 1 ml 5 % BSA DMEM mit 9 ml 2x MEM mischen.
   5. Herstellen eines niedrigviskosen Overlay-Mediums durch Mischen eines 1:1-Verhältnisses von 2,4 % mikrokristalliner Cellulose und 2x MEM/0,5 % BSA mit 1 mg/ml TPCK (Inhibitor von Chymotrypsin) Trypsin.
   6. Bereiten Sie EMEM/10 % FBS zu, indem Sie 450 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) mit 50 ml hitzeinaktiviertem FBS mischen.
2. Züchten Sie die Madin-Darby-Zelllinie der Hundeniere (MDCK). Geben Sie die Zellen aus einem gekauften Fläschchen in 5 ml EMEM/10 % FBS in einen mit T-25-Gewebekulturen behandelten Kolben. 3-5 Tage bei 37 °C/5% CO₂ inkubieren, bis die Zellen 100% Konfluenz erreicht haben. Prüfen Sie, ob die Konfluenz wie in Schritt 2.3 beschrieben ist.
3. Entfernen und entsorgen Sie das Nährmedium und spülen Sie es 2x mit 5 ml PBS bei Raumtemperatur aus. 1 ml Trypsin-EDTA in den Kolben geben und bei 37 °C/ 5% CO₂ für 10-15 min inkubieren, bis sich die Zellen lösen. Nach dem Anheben mit 4 ml EMEM/10 % FBS neutralisieren, um eine Zellsuspension bei 2 × 10⁵ Zellen/ml zu erhalten.
4. Die MDCK-Zellen werden 1 Tag vor Beginn des Plaque-Assays in eine mit 12-Well-Gewebekulturen behandelte Platte eingestreut, indem 1 ml resuspendierte Zellen pro Well (bei 2 × 10^{5 Zellen} /Well) hinzugefügt werden.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen vor der Verwendung eine Konfluenz von 100 % erreichen, und inkubieren Sie bei Bedarf länger, um die Konfluenz zu erreichen.
5. Für die Verwendung als Standard sind 10-fache Reihenverdünnungen (10^6-10 1) des IAV-Stammes (eines bekannten Titers) in dem in Schritt 8.1.1 aufgeführten Infektionsmedium vorzunehmen. Stellen Sie 1,2 ml jeder Verdünnung her, um sie in dreifacher Ausführung zu testen.
6. Tauen Sie die Organhomogenate auf Eis auf. Drehen Sie auf einer Tischzentrifuge mit 2.000 × g herunter und sammeln Sie den klaren Überstand auf.
7. Wiederholen Sie Schritt 8.5, jedoch mit dem Überstand aus den Proben in Schritt 8.6.
8. Saugen Sie das Medium aus den Zellen ab und waschen Sie es 2x mit 1 ml PBS, um alle FBS zu entfernen.
9. Geben Sie 300 μl jeder Standardverdünnung oder seriell verdünnten Probe vorsichtig an der Seite jeder Vertiefung hinzu, beginnend bei der höchsten bis zur niedrigsten Verdünnung, und tun Sie dies in dreifacher Ausfertigung.
10. Legen Sie die Platten bei 37 °C/5 % CO₂ in den Inkubator und schütteln Sie die Platte alle 10 Minuten für insgesamt 50 Minuten. Achten Sie darauf, sie flach in den Inkubator zu legen und nicht zu stapeln.
11. Nach den 50 Minuten waschen Sie die Zellen 2x mit 1 ml PBS.
12. Geben Sie 2 ml des niedrigviskosen Overlay-Mediums in jede Vertiefung, mit Ausnahme der Vertiefungen mit der geringsten Verdünnung und der Vertiefungen ohne Viren. Fügen Sie dazu Infektionsmedium und Trypsin hinzu.
13. Legen Sie die Platte für 2-4 Tage bei 37 °C/5% CO₂ wieder in den Inkubator, um Plaques zu erhalten, die mit bloßem Auge sichtbar sind.
14. Waschen Sie die Platten, indem Sie 2 ml PBS schnell von der Seite in jede Vertiefung geben und vorsichtig schütteln, um das abgesetzte, niedrigviskose Overlay-Medium zu suspendieren.
15. Entsorgen Sie das gesamte Flüssigkeitsvolumen in der Vertiefung, indem Sie das Medium vorsichtig abpipettieren.
16. Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal mit 2 ml PBS in jeder Vertiefung und verwerfen Sie dann das gesamte Flüssigkeitsvolumen durch sanftes Pipettieren.
17. Um die Plaques zu fixieren, geben Sie 500 μl 4%iges Paraformaldehyd in jede Vertiefung, schütteln Sie es und lassen Sie es 30 Minuten ruhen.
18. Waschen Sie die Seite langsam mit 1 ml PBS herunter; Entsorgen Sie dann vorsichtig die Flüssigkeit.
19. Geben Sie 500 μl 1% Kristallviolett (in Wasser verdünnt) in jede Vertiefung, um die Zellmonoschicht zu bedecken. 5 min inkubieren.
20. Mit 1 ml Leitungswasser waschen. Achten Sie darauf, die gesamte Flüssigkeit in der Vertiefung durch vorsichtiges Pipettieren zu verwerfen. Legen Sie die Platte kopfüber auf eine Windelunterlage, um sie über Nacht zu trocknen.
21. Zählen Sie die Plaketten visuell und speichern Sie die Bilder auf einem beliebigen verfügbaren Imager.

Ergebnisse

Biofilm-gezüchtete S. pneumoniae (Abbildung 1A) wurden verwendet, um Mäuse zu infizieren (Abbildung 1B) mit einem kleinen 10-μl-Inokulum, das intranasal an nicht betäubte Mäuse verabreicht wurde. Dieses kleinvolumige Inokulum führt zu einer konsistenten Pneumokokken-Übertragung, die auf den Nasopharynx beschränkt ist (Abbildung 2A, +sp-Gruppen) und gleichzeitig eine systemische Ausbreitung vermeidet (Abbildung 2B, C, +sp-Gruppen). Zwei Tage nach der intranasalen Inokulation wurden die Mäuse mit einem murin-adaptierten H1N1-Influenza-A-Virus A/PR/8/34 (IAV)^22,30 infiziert, das sowohl intranasal als auch intratracheal verabreicht wurde, um eine konsistente Abgabe spezifischer Mengen an den Nasopharynx und die Lunge zu erreichen ²³.

Hier wurde das Modell verwendet, um den Krankheitsverlauf nach einer Virusinfektion bei Mäusen zu vergleichen, die intranasal mit verschiedenen Stämmen von S. pneumoniae konfrontiert wurden, darunter TIGR4 und D39, invasive Stämme, die zu einer Lungenentzündung führen, die zu einer Bakteriämie fortschreitet, und EF3030, ein Mittelohrentzündungsstamm 21,24,25,26,31. Das Krankheitsbild bei S. pneumoniae/IAV-koinfizierten Mäusen war abhängig vom Bakterienstamm (Abbildung 2). Während es keinen signifikanten Unterschied in der Bakterienzahl des Nasopharynx (Abbildung 2A) zwischen den Stämmen gab, verbreiteten sich S. pneumoniae TIGR4 und D39, aber nicht EF3030, 48 Stunden nach der IAV-Infektion in die Lunge (Abbildung 2B). Vierzig Prozent der Mäuse, die intranasal mit S. pneumoniae TIGR4 infiziert waren, zeigten eine bakterielle Ausbreitung in die Lunge, und von diesen wurde die Hälfte bakteriämisch (Abbildung 2C), was mit früheren Befunden übereinstimmt²³.

Mäuse, die intranasal mit S. pneumoniae D39 infiziert waren, zeigten eine effizientere Verbreitung, da bei 100% der koinfizierten Mäuse eine Ausbreitung in die Lunge beobachtet wurde (Abbildung 2B). Ähnlich wie bei S. pneumoniae TIGR4 erlitt die Hälfte von ihnen eine Bakteriämie (Abbildung 2C). Bei der Verfolgung des Gesamtüberlebens, unabhängig vom Bakterienstamm, war die Überlebensrate der koinfizierten Mäuse für alle getesteten Stämme signifikant niedriger als die der Mäuse, die einzeln mit S. pneumoniae allein konfrontiert wurden (Abbildung 2D). Im Vergleich zu den Kontrollmäusen, die nur mit IAV infiziert waren, zeigten die Mäuse, die intranasal mit S. pneumoniae TIGR4 und D39, aber nicht mit EF3030 infiziert waren, beschleunigte Krankheitsraten. Am Tag 2 nach der IAV-Infektion waren 30 % (D39) und 20 % (TIGR4) der Mäuse erlegen, während die reinen IAV-Kontrollgruppen erst am 5. Tag nach der Provokation zu erliegen begannen (Abbildung 2D). Die Mäuse, die gleichzeitig mit S. pneumoniae EF3030 und IAV infiziert waren, zeigten verzögerte Symptome, die eher den reinen IAV-Kontrollen ähnelten (Abbildung 2D). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Koinfektionsmodell bei jungen, gesunden Mäusen zu einer Erkrankung führt, die vom Bakterienstamm abhängig ist, was es ideal für die Erforschung der bakteriellen Faktoren macht, die in jedem Schritt des Krankheitsverlaufs erforderlich sind.

Dieses Modell wurde verwendet, um das Vorhandensein verschiedener Immunzellen in der Lunge (Zelltypen und Gating-Strategie in Abbildung 3) nach einer IAV-Infektion bei Mäusen zu untersuchen, die intranasal mit verschiedenen Stämmen von S. pneumoniae inokuliert wurden. Die Bakterienstämme D39 und TIGR4, die sich nach einer IAV-Infektion in die Lunge ausbreiteten, führten zu einem signifikanten Anstieg des Einstroms von entzündlichen Immunzellen aus dem Blutkreislauf, wie z. B. Neutrophile (PMNs) und Monozyten, gegenüber dem Ausgangswert (nicht infiziert), während dies bei EF3030 nicht der Fall war (Abbildung 4A-C). Allein die IAV-Infektion führte zu einem signifikanten Anstieg des Einstroms von Immunzellen, die für die Wirtsabwehr gegen Virusinfektionen wichtig sind, wie z. B. NK-Zellen und gamma-delta T-Zellen (Abbildung 4A-C). Diese antiviralen Antworten waren bei Mäusen, die intranasal mit S. pneumoniae infiziert waren, vor der viralen Herausforderung signifikant abgeschwächt (Abbildung 4A-C). Dies steht im Einklang mit früheren Studien zur Bewertung von Zytokinantworten, die ergaben, dass der Transport von S. pneumoniae die Produktion von Typ-I-Interferonen abstumpft und die Fähigkeit des Wirts beeinträchtigt, die IAV-Belastung in der Lunge zu kontrollieren²³. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Koinfektionsmodell verwendet werden kann, um zu untersuchen, wie sich die Immunantwort bei mono- und polymikrobiellen Infektionen verändert.

Dieses Modell wurde auch verwendet, um den Einfluss des Alterns auf den Krankheitsverlauf nach IAV-Infektion bei Mäusen zu untersuchen, die intranasal mit S. pneumoniae TIGR4 infiziert waren. Bei einfach infizierten Mäusen variierten die Virustiter nicht zwischen der jungen und der älteren Kohorte (Abbildung 5A)²³. Wie in früheren Studien²³ zeigten alte Mäuse im Vergleich zu ihren jungen Artgenossen frühere und signifikant schwerere Krankheitsanzeichen, wie die höheren klinischen Werte zeigen (Abbildung 5B). In Übereinstimmung mit den Krankheitssymptomen begannen alte Mäuse, die mit S. pneumoniae geimpft wurden, innerhalb von 24 Stunden nach der IAV-Infektion schneller zu sterben, und alle erlagen der Krankheit, während die jungen Kontrollen die Infektion mit einer signifikant höheren Rate (33%) überlebten (Abbildung 5C). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Koinfektionsmodell verwendet werden kann, um schwerere Erkrankungen in anfälligen Wirten zu erkennen, was es ideal für die Erforschung von Wirtsfaktoren macht, die Resistenz oder Anfälligkeit für Koinfektionen verleihen.

Abbildung 1: Zeitleiste der Koinfektion und Organprozessierung zur Beurteilung des Immunzelleinstroms und der Erregerlast . (A) Streptococcus pneumoniae werden in Biofilmen gezüchtet. (B) Mäuse werden intranasal mit 5 × 10⁶ KBE des indizierten Biofilm-gezüchteten S. pneumoniae-Stammes inokuliert, um eine nasopharyngeale Trägerschaft zu etablieren, oder unbehandelt gelassen. Achtundvierzig Stunden später werden die Mäuse entweder mit PBS vorbehandelt oder erhalten intranasal 200 PFU des Influenza-A-Virus PR8 und intratracheal 20 PFU. Mäuse werden im Laufe der Zeit auf klinische Krankheitswerte und Überleben überwacht. (C) 48 h nach der IAV-Infektion werden bakterielle KBE oder virale PFU in den verschiedenen Organen oder der Einstrom von Immunzellen in die Lunge beurteilt. Abkürzungen: KBE = koloniebildende Einheiten; PFU = plaquebildende Einheiten; IAV = Influenza-A-Virus PR8; IT = intratracheal; NP = nasopharyngeal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Eine duale intranasale/intratracheale IAV-Infektion von S. pneumoniae-inokulierten Mäusen führt zu bakterieller Ausbreitung und Erkrankung, die vom Bakterienstamm abhängig ist. Junge (10-12 Wochen alte) männliche C57BL/6 (B6) Mäuse wurden wie in Abbildung 1 infiziert. Die Bakterienzahlen in (A) Nasopharynx, (B) Lunge und (C) Blut wurden alle 48 h nach IAV-Infektion bestimmt. (B,C) Prozentsätze bezeichnen den Anteil der Mäuse, die eine Ausbreitung aufwiesen. (D) Das Überleben wurde 10 Tage nach der IAV-Infektion überwacht. Es werden gepoolte Daten von (A,B) n = 5, (C) n = 11 und (D) n = 6 Mäusen pro Gruppe angezeigt. Jeder Kreis entspricht einer Maus, und die gestrichelten Linien zeigen die Nachweisgrenze an. (A-C) *, zeigt einen signifikanten Unterschied (p < 0,05) zwischen den angegebenen Gruppen an, der durch den Kruskal-Wallis-Test bestimmt wurde. (D) *, zeigt einen signifikanten Unterschied (p < 0,05) zwischen +sp- und Co-inf-Mäusen pro Bakterienstamm an, der durch den Log-Rank-Test (Mantel-Cox) bestimmt wird. Abkürzungen: +sp = Mäuse, die intranasal nur mit dem angegebenen Stamm mit Bakterien infiziert wurden; Co-inf = bakteriell infizierte Mäuse, die mit IAV infiziert waren; IAV = Mäuse, die das Influenza-A-Virus erhalten haben; KBE = koloniebildende Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Gating-Strategie von Immunzellen. Die Lunge wurde entnommen und der Einstrom von Immunzellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die repräsentative Gating-Strategie der verschiedenen Zelltypen wird gezeigt. (A) CD45+, lebende Einzelzellen wurden angesteuert und die prozentualen Anteile von (B) PMNs (Ly6G+, CD11b+), Makrophagen (Ly6G-, Ly6C-, F480+) und Monozyten (Ly6G-, Ly6C+), (C) DCs (Ly6G-, CD11c+) und NK-Zellen (NK1.1+, CD3^-), (D) TCR- γΔ und CD8 (CD8+, TCRβ+) und CD4 (CD4+, ^TCRβ+ ) T-Zellen bestimmt wurden. Abkürzungen: SSC-A = side scatter-peak area; FSC-A = Vorwärts-Streu-Peak-Fläche; FSC-H = Vorwärtsstreu-Peak-Höhe; SSC-W = Breite der seitlichen Streuspitze; L/D = lebend/tot; FMO = fluoreszierend minus eins; NK = natürlicher Killer; PMN = polymorphkernige Leukozyten; DC = dendritische Zelle; TCR = T-Zell-Rezeptor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Pulmonale Immunantworten sind vom Bakterienstamm abhängig. Junge (10-12 Wochen alte) männliche C57BL/6-Mäuse wurden entweder nicht infiziert, einfach mit dem indizierten Streptococcus pneumoniae-Stamm (+sp) inokuliert, einfach mit IAV (IAV) herausgefordert oder mit S. pneumoniae und IAV (Co-inf) koinfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der IAV-Infektion (siehe Versuchsplanung in Abbildung 1) wurde die Lunge entnommen und der Immunzelleinstrom wurde durch Durchflusszytometrie gemäß der Gating-Strategie in Abbildung 3 bestimmt. (A) Die durchschnittlichen Prozentsätze jedes angegebenen Zelltyps innerhalb des CD45-Gates werden für alle Behandlungsgruppen auf der Heatmap angezeigt. (B) Für jede Mausgruppe werden repräsentative Punktdiagramme von Zelltypen gezeigt, die signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen aufwiesen. (C) Die Prozentsätze der angegebenen Immunzelltypen werden angezeigt. Jeder Kreis entspricht einer Maus. (A,C) Es werden gepoolte Daten von n = 5 Mäusen pro Gruppe angezeigt. *, zeigt einen signifikanten Unterschied (p < 0,05) zwischen Co-inf und nicht infiziert an; ^$, gibt einen signifikanten Wert zwischen IAV und nicht infiziert an; #, zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Co-inf und IAV allein an. Signifikante Unterschiede zwischen den Challenge-Gruppen für jeden Zelltyp wurden durch ANOVA und anschließend durch den Tukey-Test bestimmt. Abkürzungen: NK = Natural Killer; PMN = polymorphkernige Leukozyten; DC = dendritische Zelle; TCR = T-Zell-Rezeptor; IAV = Influenza-A-Virus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Alterung und erhöhte Empfänglichkeit des Wirts für eine Koinfektion mit IAV/Streptococcus pneumoniae . Junge (10-12 Wochen) und ältere (21-22 Monate) männliche C57BL/6-Mäuse wurden mit S. pneumoniae, TIGR4 i.n. und IAV i.n. und i.t. (wie in Abbildung 1) koinfiziert oder einzeln mit IAV allein herausgefordert. (A) Die Virustiter wurden 48 h später bestimmt. Sternchen zeigen die statistische Signifikanz (p < 0,05) an, die durch den t-Test des Schülers bestimmt wird. Die Daten werden von n = 4 Mäusen pro Gruppe gepoolt. (B) Der klinische Score und (C) das Überleben wurden über die Zeit überwacht. (B) Der Mittelwert ± SEM, gepoolt aus n = 6 Mäusen pro Gruppe, wird gezeigt. Sternchen zeigen die statistische Signifikanz (p < 0,05) zwischen den jungen und alten Mäusen zum angegebenen Zeitpunkt an, die durch den Mann-Whitney-Test bestimmt wurde. (C) Die Daten werden von n = 6 Mäusen pro Gruppe gepoolt. Sternchen zeigen die statistische Signifikanz (p < 0,05) zwischen den jungen und alten Mäusen an, die durch den Log-Rank-Test (Mantel-Cox) bestimmt wird. Abkürzungen: IAV = Influenza-A-Virus; i.n. = intranasal; i.t. = intratracheal; SEM = Standardfehler des Mittelwerts. Abbildung 5A wird mit Genehmigung von Joma et ^al.23 abgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Mix I Bestand für CDM
Adenin	0,1 g
D-Alanin	0,25 g
CaCl2 wasserfrei	0,025 g
Mangansulfat	0,03 g
Cyanocobalamin	100 μl von 10 mg/ml Vorrat
Para-Aminobenzoesäure	400 μl von 5 mg/ml Vorrat
Pyridoxamin 2HCl	100 μl von 10 mg/ml Vorrat
Mix II Bestand für CDM
Guanin	0,05 g
Uracil	0,05 g
Mix III Schaft für CDM
Eisen(III)-nitrat 9H2O	50 mg/ml
Eisen(III)-sulfat 7H2O	10 mg/ml
Mix IV-Bestand für CDM
Beta-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid	25 mg/ml

Tabelle 1: Mix I-, II-, III- und IV-Bestände für CDM. Abkürzung: CDM = chemisch definierte Medien.

Vitamin-Mix-Brühe für CDM
Pyridoxalhydrochlorid	0,8 g
Thiamin Cl2	0,4 g
Riboflavin	0,4 g
Ca-Pantothenat	0,4 g
Biotin	0,04 g
Folsäure	0,4 g
Niacinamid	0,4 g

Tabelle 2: Vitamin-Mix-Bestand für CDM. Abkürzung: CDM = chemisch definierte Medien.

Aminosäurestock für CDM
L-Alanin	0,480 g
L-Arginin	0,250 g
L-Asparagin	0,700 g
L-Asparaginsäure	0,600 g
L-Cystein	1.000 g
L-Cystin	0,100 g
L-Glutaminsäure	0,200 g
L-Glutamin	0,780 g
L-Glycin	0.350 g
L-Histidin	0.300 g
L-Isoleucin	0,430 g
L-Leucin	0,950 g
L-Lysin	0,880 g
L-Methionin	0,250 g
L-Phenylalanin	0,550 g
L-Prolin	1.350 g
L-Serin	0,680 g
L-Threonin	0,450 g
L-Tryptophan	0,100 g
L-Valin	0,650 g

Tabelle 3: Aminosäurestock für CDM. Abkürzung: CDM = chemisch definierte Medien.

Starter Stock für CDM
Dextrose	1,0 g
Magnesiumsulfat-7-Hydrat	0,070 g
Kaliumphosphat dibasisch	0,02 g
Kaliumphosphat monobasisch	0,1 g
Natriumacetat wasserfrei	0,45 g
Natriumbicarbonat	0,25 g
Natriumphosphat dibasisch	0,735 g
Natriumphosphat monobasisch	0,32 g
Abschließende Ergänzungen für CDM
Cholinchlorid	0,1 g
L-Cystein HCl	0,075 g
Natriumbicarbonat	0,25 g

Tabelle 4: Vorrat und Endnachträge für CDM. Abkürzung: CDM = chemisch definierte Medien.

Antikörper/Fluorophor	Klonen	Verdünnungsfaktor
L/D für UV-Anregung	N/A	0.38888889
Ly6G AF 488	1A8	0.25
CD11b Schützenpanzer	M1/70	0.25
CD11c PE	N418	0.18055556
Maus-Fc-Block	2.4G2	0.11111111
F4/80 PE Cy7	BM8	0.18055556
Ly6C BV605	AL-21	0.25
CD103 BV 421	M290	0.18055556
CD45 APC-eF-780	30-F11	0.18055556

Tabelle 5: Antikörper-Panel 1.

Antikörper/Fluorophor	Klonen	Verdünnungsfaktor
L/D für UV-Anregung	N/A	0.388888889
TCR-β Schützenpanzer Cy7	H57-597	0.180555556
CD4 V450 (Pazifisch Blau)	RM4-5	0.25
CD8 BV650	53-6.7	0.180555556
Maus-Fc-Block	2.4G2	0.111111111
CD45 PE	30-F11	0.180555556
CD3 AF488	145-2C11	0.180555556
TCR- γΔ APC	GL-3	0.180555556
NK1.1 AF 700	PK136	0.180555556

Tabelle 6: Antikörper-Panel 2.

Diskussion

Die meisten der existierenden experimentellen Studien zu S. pneumoniae/IAV-Koinfektionen beruhen auf der bakteriellen Abgabe in die Lunge von Mäusen, die bereits mit IAV infiziert waren. Diese Modelle haben dazu beigetragen, Veränderungen im Lungenmilieu und in der systemischen Immunantwort zu identifizieren, die den Wirt anfällig für sekundäre bakterielle Infektionen machen 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Diese Modelle haben es jedoch nicht geschafft, den Übergang von S. pneumoniae von einem asymptomatischen Kolonisator zu einem Erreger nachzuahmen, der schwere Lungen- und systemische Infektionen verursachen kann. Darüber hinaus sind diese Modelle nicht geeignet, um die Wirtsfaktoren und Wirt-Pathogen-Interaktionen in den oberen Atemwegen zu untersuchen, die zur Anfälligkeit für Infektionen beitragen. Ein früheres Modell für die Bewegung von Pneumokokken vom Nasopharynx in die Lunge nach einer IAV-Infektion beruhte auf einer bakteriellen Infektion des Nasopharynx gefolgt von einer Virusinfektion. Die bei menschlichen Patienten beobachteten schweren Krankheitssymptome konnten jedoch nicht reproduziert^{werden 21}. Das hier beschriebene modifizierte murine Infektionsmodell rekapituliert den Übergang von S. pneumoniae von einer asymptomatischen Übertragung zu einem Erreger, der eine schwere klinische Erkrankung verursacht.

Ein wichtiger Schritt dieses Modells ist die Etablierung einer S. pneumoniae-Infektion im Nasen-Rachenraum. Streptococcus pneumoniae bilden Biofilme und besiedeln den Nasopharynx mit unterschiedlichen Wirkungsgraden^21,38. Um eine konsistente Infektion herzustellen, sind mindestens 5 × 10⁶ KBE der bisher getesteten Biofilm-gezüchteten Bakterienstämme erforderlich²³. Es wird empfohlen, jeden neuen Bakterienstamm vor einer Virusinfektion auf eine stabile Infektion des Nasen-Rachen-Raums zu testen. Für die virale Koinfektion haben frühere Studien ergeben, dass eine intranasale Infektion mit IAV für die Ausbreitung der Bakterien aus dem Nasopharynx erforderlich ist^21,22,23. In diesen früheren Studien wurden 500 PFU IAV für die intranasale Verabreichung verwendet, während in dieser Studie 200 PFU ausreichten, um die Bakterienzahl im Nasopharynx zu erhöhen. Die IAV-Infektion ist nicht auf die oberen Atemwege beschränkt und kann sich auf die Lunge ausbreiten^39,40, was entscheidend ist, um das Lungenmilieu für bakterielle Infektionen durchlässiger zu machen^15,16,41. Die Abgabe von IAV in die Lunge kann entweder durch intranasale Verabreichung oder intratracheale Implantation von anästhesierten Mäusen erfolgen. Frühere Arbeiten mit BALB/cByJ-Mäusen ergaben, dass die intranasale Verabreichung zu einer viralen Pneumonie führt²¹; Der Zugang des Inokulums zur Lunge nach intranasaler Inokulation ist bei C57BL/6-Mäusen jedoch eingeschränkter. Bei C57BL/6-Mäusen ist eine intratracheale Implantation für eine konsistente Abgabe des Virus erforderlich²³. In diesem Modell beschleunigt eine vorherige bakterielle Besiedlung das Auftreten von Krankheitssymptomen nach Virusinfektion²³. Da eine Virusinfektion selbst Krankheitssymptome mit potenzieller Variation der Kinetik verursachen kann, wird empfohlen, zunächst eine Reihe von Dosen für jeden neu getesteten Virusstamm zu testen und eine Dosis zu wählen, die eine beschleunigte Kinetik in koinfizierten Wirten zeigt.

Die Lunge liefert in diesem Modell einen weiteren wichtigen Messwert für die Bewertung von Krankheiten. Für die Abschätzung der Erregerlast und des Immunzelleinstroms kann eine Lunge derselben Maus verwendet werden. Da der Schweregrad der Infektion und der Entzündung jedoch zwischen den Lappen unterschiedlich sein können, wird empfohlen, für die verschiedenen Untersuchungen keine verschiedenen Lappen derselben Lunge zu verwenden. Vielmehr können alle Lappen in kleine Stücke zerkleinert, gut miteinander vermischt und dann für die verschiedenen Bewertungen gleichmäßig analysiert werden. In ähnlicher Weise kann der Nasopharynx für die Zählung von bakterieller KBE oder viraler PFU und der Immunantwort verwendet werden. Die Anzahl der Zellen, die aus den Waschungen und dem Gewebe gewonnen werden, ist jedoch zu gering, um eine Durchflusszytometrie durchzuführen, ohne die Proben von Mäusen innerhalb derselben Gruppe zusammenzufassen. Alternativ kann eine Entzündung im Nasen-Rachen-Raum histologisch beurteilt^{werden 23}.

Ein entscheidendes Merkmal dieses Modells ist, dass es die klinische Erkrankung, die bei Patienten beobachtet wurde, rekapituliert. Beim Menschen führt eine sekundäre Pneumokokken-Pneumonie nach einer IAV-Infektion häufig zu offensichtlichen Krankheitsanzeichen wie Husten, Dyspnoe, Fieber und Muskelschmerzen, die zu Krankenhausaufenthalten, Atemversagen und sogar zum Tod führen können 8,15,42,43. Dieses Modell rekapituliert die schweren Anzeichen klinischer Erkrankungen, die beim Menschen in Bezug auf Atembeschwerden (die sich im Atemwert widerspiegeln) und allgemeines Unwohlsein (spiegelt sich in den Haltungs- und Bewegungswerten wider) der Mäuse sowie den Tod bei einigen der gesunden jungen Kontrollen beobachtet haben. Die verschlimmerten Krankheitssymptome bei koinfizierten Mäusen sind wahrscheinlich sowohl auf die bakterielle Ausbreitung in die Lunge als auch auf eine gestörte Virusclearance bei Mäusen mit Pneumokokken-Träger^{zurückzuführen 23}. Eine Einschränkung des Modells besteht darin, dass die Inzidenz klinischer Erkrankungen und bakterieller Ausbreitung aus dem Nasopharynx zwischen Mäusen variiert und vom Bakterienstamm, dem Wirtsalter und dem Genotyp^{beeinflusst wird 21,22,23}. Aus diesem Grund kann bei invasiven Stämmen das Fortschreiten von einer lokalisierten Infektion (ohne nachweisbare Bakteriämie) bis zum Tod innerhalb von 24 Stunden erfolgen. Um eine echte Beurteilung der systemischen Ausbreitung zu erhalten, sollte die Bakteriämie daher in kürzeren Intervallen (alle 6-12 Stunden) beobachtet werden. Ebenso kann sich der Krankheitsscore schnell ändern, insbesondere in den ersten 72 Stunden nach einer Koinfektion. Um die Krankheitssymptome genau zu verfolgen, ist es daher ratsam, die Mäuse dreimal täglich an den Tagen 1-3 nach der IAV-Infektion zu überwachen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Modell die Bewegung von S. pneumoniae von einem asymptomatischen Kolonisator des Nasopharynx zu einem Erreger repliziert, der bei einer IAV-Infektion eine pulmonale und systemische Erkrankung verursachen kann. In diesem Modell löst IAV den Übergang von S. pneumoniae aus, indem es das bakterielle Verhalten im Nasopharynx modifiziert, die bakterielle Ausbreitung in die Lunge erhöht und die antibakterielle Immunität verändert²³. In ähnlicher Weise stumpft die bakterielle Übertragung die antiviralen Immunantworten ab und beeinträchtigt die IAV-Clearance aus der Lunge²³. Dies macht dieses Modell ideal für die Analyse von Veränderungen in der Immunantwort bei einzelnen und polymikrobiellen Infektionen. Darüber hinaus ist der Krankheitsverlauf nach einer Koinfektion zum Teil vom Pneumokokkenstamm im Nasen-Rachen-Raum abhängig. Daher eignet sich das Modell, um die bakteriellen Faktoren zu analysieren, die für die asymptomatische Besiedlung im Vergleich zur pathogenen Transition von S. pneumoniae erforderlich sind. Schließlich reproduziert dieses Modell die Anfälligkeit des Alterns für Koinfektionen, und obwohl dies hier nicht getestet wurde, kann es leicht verwendet werden, um den Einfluss des Wirtshintergrunds auf den Krankheitsverlauf zu beurteilen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Aufteilung von Übertragung und Krankheit in verschiedene Schritte die Möglichkeit bietet, die genetischen Varianten sowohl der Erreger als auch des Wirts zu analysieren, was eine detaillierte Untersuchung der Interaktionen eines wichtigen Pathobionten mit dem Wirt in verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs ermöglicht. In Zukunft kann dieses Modell verwendet werden, um Behandlungsoptionen für gefährdete Wirte maßzuschneidern.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Aminobenzoic acid	Fisher	AAA1267318	Mix I stock
96-well round bottom plates	Greiner Bio-One	650101
100 µm Filters	Fisher	07-201-432
Adenine	Fisher	AC147440250	Mix I stock
Avicel	Fisher	501785325	Microcyrstalline cellulose
BD Cytofix Fixation Buffer	Fisher	BDB554655	Fixation Buffer
BD Fortessa			Flow cytometer
BD Intramedic Polyethylene Tubing	Fisher	427410	Tubing for nasal lavage
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL)	Fisher	14-823-30
BD Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure	Fisher	02-675-185	Blood collection tubes
Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide	Fisher	AAJ6233703	Mix IV stock
Biotin	Fisher	AC230090010	Vitamin stock
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	#000644	Mice used in this study
Calcium Chloride Anhydrous	Fisher Chemical	C77-500	Mix I stock
CD103 BV 421	BD Bioscience	BDB562771	Clone: M290 DF 1:200
CD11b APC	Invitrogen	50-112-9622	Clone: M1/70, DF 1:300
CD11c PE	BD Bioscience	BDB565592	Clone: N418 DF 1:200
CD3 AF 488	BD Bioscience	OB153030	Clone: 145-2C11 DF 1:200
CD4 V450	BD Horizon	BDB560470	Clone: RM4.5 DF 1:300
CD45 APC eF-780	BD Bioscience	50-112-9642	Clone: 30-F11 DF 1:200
CD45 PE	Invitrogen	50-103-70	Clone: 30-F11 DF 1:200
CD8α BV 650	BD Horizon	BDB563234	Clone: 53-6.7 DF 1:200
Choline chloride	Fisher	AC110290500	Final supplement to CDM
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems	Fisher	09-761-107	Filter sterilzation apparatus
Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks	Fisher	10-126-9
Corning Costar Clear Multiple Well Plates	Fisher	07-201-590
Corning DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate	Fisher	MT10017CM
Cyanocobalamin	Fisher	AC405925000	Mix I stock
D39	National Collection of Type Culture (NCTC)	NCTC 7466	Streptococcus pneumoniae strain
D-Alanine	Fisher	AAA1023114	Mix I stock
D-Calcium pantothenate	Fisher	AC243301000	Vitamin stock
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Starter stock
Dnase	Worthington Biochemical	LS002147
Eagles Minimum Essential Medium	ATCC	30-2003
EDTA	VWR	BDH4616-500G
EF3030	Center for Disease Control and Prevention	Available via the isolate bank request	Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name
F480 PE Cy7	BD Bioscience	50-112-9713	Clone: BMB DF 1:200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher	14-432-22	50 mL round bottom tube
Falcon Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher	14-959-11B	15 mL round bottom tube
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL)	Fisher	14-959-5	FACS tubes
FBS	Thermofisher	10437-028
Ferric Nitrate Nonahydrate	Fisher	I110-100	Mix III stock
Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors	Fisher	08-951-5	Instruments used for harvest
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops	Fisher	22-363-602	Inoculating loops
Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps	Fisher	13-812-38	Forceps for harvest
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL	Fisher	05-408-137	Micocentrifuge tubes
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (10 mL)	Fisher	14-955-459
Folic Acid	Fisher	AC216630500	Vitamin stock
Gibco RPMI 1640 (ATCC)	Fisher	A1049101
Gibco DPBS, no calcium, no magnesium	Fisher	14190250
Gibco HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Fisher	14025134
Gibco MEM (Temin's modification) (2x), no phenol red	Fisher	11-935-046
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Fisher	15-140-122
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4%	Fisher	15-250-061
Gibco Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Fisher	25-200-056
Glycerol (Certified ACS)	Fisher	G33-4
Glycine	Fisher	AA3643530	Amino acid stock
Guanine	Fisher	AAA1202414	Mix II stock
Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads	Fisher	50-112-9040
Iron (II) sulfate heptahydrate	Fisher	AAA1517836	Mix III stock
L-Alanine	Fisher	AAJ6027918	Amino acid stock
L-Arginine	Fisher	AAA1573814	Amino acid stock
L-Asparagine	Fisher	AAB2147322	Amino acid stock
L-Aspartic acid	Fisher	AAA1352022	Amino acid stock
L-Cysteine	Fisher	AAA1043518	Amino acid stock
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Fisher	AAA1038914	Final supplement to CDM
L-Cystine	Fisher	AAA1376218	Amino acid stock
L-Glutamic acid	Fisher	AC156211000	Amino acid stock
L-Glutamine	Fisher	O2956-100	Amino acid stock
L-Histidine	Fisher	AC166150250	Amino acid stock
LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Invitrogen	50-112-1524	Clone: N/A DF 1:500
L-Isoleucine	Fisher	AC166170250	Amino acid stock
L-Leucine	Fisher	BP385-100	Amino acid stock
L-Lysine	Fisher	AAJ6222514	Amino acid stock
L-Methionine	Fisher	AAA1031822	Amino acid stock
Low endotoxin BSA	Sigma Aldrich	A1470-10G
L-Phenylalanine	Fisher	AAA1323814	Amino acid stock
L-Proline	Fisher	AAA1019922	Amino acid stock
L-Serine	Fisher	AC132660250	Amino acid stock
L-Threonine	Fisher	AC138930250	Amino acid stock
L-Tryptophan	Fisher	AAA1023014	Amino acid stock
L-Valine	Fisher	AAA1272014	Amino acid stock
Ly6C BV 605	BD Bioscience	BDB563011	Clone: AL-21 DF 1:300
Ly6G AF 488	Biolegend	NC1102120	Clone: IA8, DF 1:300
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CCL-34	MDCK cell line for PFU analuysis
Magnesium Sulfate 7-Hydrate	Fisher	60-019-68	CDM starter stock
Manganese Sulfate	Fisher	M113-500	Mix I stock
MilQ water			Ultra-pure water
Mouse Fc Block	BD Bioscience	BDB553142	Clone: 2.4G2 DF 1:100
MWI VETERINARY PURALUBE VET OINTMENT	Fisher	NC1886507	Eye lubricant for infection
NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line	ATCC	CRL-1848	H292 lung epithelial cell line for biofilm growth
Niacinamide	Fisher	18-604-792	Vitamin stock
NK 1.1 AF 700	BD Bioscience	50-112-4692	Clone: PK136 DF 1:200
Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk	Fisher	50-200-5299	To remove oxygen from liquid cultures
Paraformaldehyde 4% in PBS	Thermoscientific	J19932-K2
Pivetal Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-8440	Isoflurane for anesthesia during infection
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Chemical	P288-500	Starter stock
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Chemical	P285-500	Starter stock
Pyridoxal hydrochloride	Fisher	AC352710250	Vitamin stock
Pyridoxamine dihydrochloride	Fisher	AAJ6267906	Mix I stock
Riboflavin	Fisher	AC132350250	Vitamin stock
Sodium Acetate	VWR	0530-500G	Starter stock
Sodium Azide	Fisher Bioreagents	BP922I-500	For FACS buffer
Sodium Bicarbonate	Fisher Chemical	S233-500	Starter stock and final supplement to CDM
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Chemical	S374-500	Starter stock
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher Chemical	S369-500	Starter stock
TCR APC	BD Bioscience	50-112-8889	Clone: GL-3 DF 1:200
TCRβ APC-Cy7	BD Pharmigen	BDB560656	Clone: H57-597 DF 1:200
Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin	Fisher	R01227	Blood agar plates with the antibiotic gentamicin
Thermo Scientific Trypsin, TPCK Treated	Fisher	PI20233
Thiamine hydrochloride	Fisher	AC148991000	Vitamin stock
TIGR4	ATCC	BAA-334	Streptococcus pneumoniae strain
Uracil	Fisher	AC157300250	Mix II stock
Worthington Biochemical Corporation Collagenase, Type 2, 1 g	Fisher	NC9693955