Sıçanlarda Tibial Nöroma Transpozisyon Modelinde Cerrahi ve Davranışsal Test

Özet

Bu protokol, tibial sinirin lezyonunu ve ardından proksimal sinir ucunun subkutan pretibial veya lateral pozisyona doğru transpozisyonunu gerektiren tibial nöroma transpozisyon modelini tanımlar. Nöroma ağrısı ve plantar hiperaljezinin davranışsal testleri, Von Frey monofilamentleri kullanılarak ölçülür.

Özet

Tibial nöroma transpozisyonu (TNT), nöroma bölgesindeki (tibial sinir) allodininin, sağlam sural sinir tarafından innerve edilen arka pençenin plantar yüzeyindeki allodinyadan bağımsız olarak değerlendirilebildiği bir sıçan modelidir. Bu TNT modeli, klinikte halihazırda kullanılan bazı cerrahi tedavilerin potansiyel üstünlüğü gibi nöroma ağrısı için tedavileri test etmek veya yeni ilaçları ve bunların aynı hayvandaki her iki ağrı modalitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için uygundur. Bu modelde, tibial sinirde distal bir lezyon (nörotmesis) yapılır ve proksimal sinir ucu, 15 g'lık bir Von Frey monofilamenti ile nöroma bölgesinin değerlendirilmesini sağlamak için deri altından ve pretibiyal olarak transpoze edilir ve sabitlenir. Sural sinir üzerindeki allodiniyi değerlendirmek için, Von Frey monofilamentleri arka pençenin plantar lateral bölgesinde yukarı-aşağı yöntemle kullanılabilir. Tibial siniri kestikten sonra, ameliyattan sonraki 1 hafta içinde nöroma bölgesinde mekanik aşırı duyarlılık gelişir ve ameliyattan en az 12 hafta sonrasına kadar devam eder. Sural innerve plantar yüzeydeki allodinya, kontralateral ekstremite ile karşılaştırıldığında ameliyattan sonraki 3 hafta içinde gelişir. 12 haftada, kopmuş tibial sinirin proksimal ucunda, aksonların dağılması ve dönmesi ile gösterilen bir nöroma oluşur. TNT modeli cerrahi için çok sayıda kritik (mikro) cerrahi adımın izlenmesi gerekir ve terminal anestezi altında bazı cerrahi uygulamalar önerilmektedir. Korunmuş sinir hasarı modeli gibi diğer nöropatik ağrı modelleriyle karşılaştırıldığında, nöroma bölgesi üzerindeki allodinya, TNT modelinde sural sinir aşırı duyarlılığından bağımsız olarak test edilebilir. Bununla birlikte, nöroma bölgesi farelerde değil, sadece sıçanlarda test edilebilir. Bu protokolde verilen ipuçları ve talimatlar, ağrı üzerinde çalışan araştırma gruplarının TNT modelini tesislerinde başarıyla uygulamalarına yardımcı olabilir.

Giriş

Basit yırtılmalardan tüm ekstremite amputasyonuna kadar değişen her yaraya değişen derecelerde periferik sinir hasarı eşlik eder. Bu tür sinir hasarı, filizlenen sinir liflerinin düzensiz bir dolaşıklığı olan bir nörom oluşumuna neden olabilir. Nöromlar hastaların %8-30'unda ağrılı hale gelir ve yaşam kalitelerini ciddi şekilde etkiler^1,2,3,4,5. Ekstremite amputasyonundan sonra hastaların %50'sinde nöroma ağrısı gelişir^6,7,8. Bildirilen semptomlar arasında hassasiyet, spontan ağrı, allodini, hiperaljezi ve innerve bölgede mekanik veya termal aşırı duyarlılık bulunur⁹. 1 yıl içinde yeterince tedavi edilmediğinde, nöroma ağrısı kronik bir ağrı durumuna ilerleyebilir ve bu da yüksek toplumsal yüke ve buna bağlı tıbbi maliyetlere neden olabilir 10,11,12,13,14. Mevcut farmakolojik girişimlerin etkinliğinin zayıf olması nedeniyle, nöroma ağrısı tercihen ağrılı nöromun cerrahi olarak çıkarılması ve literatürde açıklandığı gibi sinirin çeşitli cerrahi tekniklerle tedavi edilmesi ile tedavi edilmektedir¹⁵. Tam ağrı kesicinin nadir olduğunu, ağrının genellikle zamanla kötüleştiğini ve hastaların% 40'ının ameliyattan fayda görmediğini ve yeni tedavilere ihtiyaç duyulduğunu belirtmek önemlidir ^1,16.

Nöroma ağrısının standartlaştırılmış bir sıçan modeli, nöroma ağrısını yönlendiren mekanizmaları anlamada yardımcı olur ve yeni tedavilerin belirlenmesine veya klinikte kullanılanların değerlendirilmesine yardımcı olabilir. Tibial nöroma transpozisyonu (TNT) modeli ilk olarak Dorsi ve ark. tarafından 2008^{yılında tanımlanmıştır 17} ve farklı araştırma grupları tarafından kullanılmıştır^18,19,20. Bu yöntemin genel amacı, nöroma ağrısı için farklı tedavi tekniklerini test edebilmektir. Modelin, örneğin, korunmuş sinir hasarı (SNI) model^21'e göre avantajı, nöroma bölgesinde allodiniyi test etmesine izin vermesidir. Bunun nedeni, modelin tibial sinirin proksimal sinir ucunu, von Frey monofilamentleri ile araştırılabileceği deri altı pretibial bir pozisyona aktarmayı içermesidir. Dahası, allodinya, aynı hayvandaki nöroma ağrısından bağımsız olarak değerlendirilebilen sağlam sural sinir tarafından innerve edilen arka pençenin plantar yüzeyinde gelişir. Bu, ağrılı bir nöromun çıkarılmasından sonra kalıcı nöropatik ağrının bazen komşu sinirlerden kaynaklandığı hastalarda nöroma ağrısı semptomlarına benzer²². Dahası, nöroma ile kopmuş bir sinir üzerindeki allodinya, sağlam komşu sinir üzerindeki allodinyadan farklı bir ağrı modalitesidir. Bu nedenle, bu model, yeni tedavilerin hem nöroma bölgesinde bulunan allodini hem de arka pençenin plantar yüzeyinde test edilen daha yaygın nöropatik ağrı üzerindeki etkisinin değerlendirilmesini kolaylaştırır. TNT modelini oluşturmak için yapılan ameliyat zor olabileceğinden, bu makale modeli tesislerinde uygulayan araştırmacıları destekleme prosedürünü detaylandırmaktadır.

Protokol

Bu araştırma IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) ve AVD1150020198824 proje numaralı hayvan araştırmaları kılavuzuna uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Von Frey taban çizgisi ölçümleri

1. Ameliyattan önce, aşağıda bölüm 5 ve bölüm 6'da açıklanan Von Frey test prosedürüne göre temel ölçümleri yapın.

2. Anestezi ve hazırlık

NOT: Bu çalışma, 12 haftalık 15 erkek Sprague Dawley sıçanı üzerinde gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvanları %5 izofluran ile indüksiyon ile uyuşturun ve %2-3 izofluran ile anesteziyi sürdürün.
   NOT: %2 izofluran ile idame genellikle trakeal entübasyon veya mekanik ventilasyona gerek kalmadan yeterli anestezi ve spontan solunum ile sonuçlanır.
2. Ayağı cımbızla sıkıştırarak hayvanların reflekslerini kontrol edin. Devam etmeden önce hayvanın yanıt vermediğinden emin olun. Ameliyat alanını dizden ayak bileğine kadar elektrikli tıraş makinesi ile tıraş edin ve kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın. Karın bölgesine deri altından 0.5 mg / kg analjezik karprofen enjekte edin.
3. Anestezi uygulanan sıçanı başı sola veya sağa ve ameliyat edilecek bacağı cerrahın yanına gelecek şekilde sırt üstü yerleştirin. Alt arka ekstremiteyi ekzorotatee edin, böylece medial malleolus yukarı doğru bakar. Sıçanı 6x büyütmeli bir stereo cerrahi mikroskop altına yerleştirin.
4. Tıraş edilen bölgeyi üç alternatif iyot bazlı ovma ve ardından alkol ile dezenfekte edin. Bacağın üzerine operatif bir delik bulunan steril bir tabaka yerleştirin, böylece sadece ameliyat alanı görülebilir. Ameliyat sırasında bu steril koşulların korunduğundan emin olun.

3. Ameliyat

1. Ameliyat alanını yatay tutmak için ayak bileğinin altına küçük bir pamuklu çubuk yerleştirin. Dizin yerini belirleyin ve baldırın ortasından ayak bileğine kadar arka pençenin medial tarafında bir neşter kullanarak yavaşça 1-2 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın. Gerekirse, cildi açın ve kas katmanları görünene kadar mikro makasla daha fazla subkutis yapın.
2. Yüzeysel nörovasküler demeti iki veya üç beyaz ve kas katmanları üzerinde serbestçe hareket edebilen bazen küçük dalları olan daha kalın bir mor / kırmızı çizgi olarak tanımlayın. Bir elektrokoter kullanarak (bakınız Malzeme Tablosu), ameliyat alanındaki herhangi bir aktif kanamayı veya sızmayı pıhtılaştırın. Nörovasküler demetlere zarar vermemeye dikkat edin.
3. Fasyayı gastroknemius kasları arasında, yüzeysel nörovasküler demet 3.2'nin hemen arkasında açmak için açıkça disseke edin. Kasların fasyası arasında tibial sinir bulunabilir. Tibial sinir, nörovasküler demetteki yüzeysel sinirin yaklaşık üç katı büyüklüğündedir. Tibial kemiği ek bir dönüm noktası olarak kullanın (tibial sinir, tibial kemiğin hemen arkasında bulunur).
4. Tibial siniri ve bifurkasyonunu tanımlayın.
   NOT: Bifurkasyon genellikle sinir üzerinde uzunlamasına daha hafif bir çizgi ile görülebilir.
5. Tibial siniri çevreleyen vasküler demetlerden arındırılmış olarak dikkatlice diseke edin. Tibial siniri künt bir şekilde hareket ettirerek ve tibial siniri hareket ettirirken biraz gerilme gösteren maruz kalan dokuyu keserek diseksiyonu gerçekleştirin.
   NOT: Tibial sinir diseksiyondan sonra çapraz damarlara bağlanırsa, bu damarlar tüm tibial siniri açığa çıkarmak için pıhtılaşabilir. Tibial demetin kendisini pıhtılaştırmamaya dikkat edin.
6. Tibial siniri, çapraz bir kas tabakasının altında kaybolana kadar proksimal olarak açığa çıkarın. Bu noktada, tibial sinir arka pençeye diz doğru daha derine dalıyor gibi görünmektedir. Tibial siniri distal olarak ayak bileğine kadar maruz bırakın.
   NOT: Tibial sinir daha distal olarak maruz kaldığında, çapraz kollajen liflerinin miktarı (yani, sinir liflerinin yönüne dik olan lifler) artacaktır. Bu kollajen liflerinin, tibial sinirin transpoze edilmesi için yeterli uzunluğu sağlamak için kesilmesi gerekir.
   1. Tüm tibial sinir açığa çıktığında, sinirin dehidrasyonunu önlemek için kas katmanlarını geri yerleştirin. Sinir dehidrate olursa (yani, daha sert, donuk ve kırışmış hale gelirse) ve kas katmanlarıyla kaplamak yeterli olmazsa, nemlendirmek için tuzlu su damlaları ekleyin.
7. Künt bir mikrocerrahi aleti, tercihen bir mikro iğne tutucu kullanarak, deri altı tünel yapmak için pretibial cildi deri altı kas tabakasından diseke edin. Bunu yapmak için, cildi yukarı doğru tutun ve künt ucu cilde paralel olarak dokuya itin. Nöromun test edilmesi için alanın kolay erişilebilirliğini sağlamak için tünelin ucunun pretibiyal veya daha lateral olarak yerleştirildiğinden emin olun.
8. İzofluranı% 5'e yükseltin. Tibial sinire geri dönün ve onu açığa çıkarın (yani, adım 3.6'da açıklanan yere geri dönün). Tibial siniri (yani her iki plantar dalı) ayak bileğinin yakınındaki en distal seviyede kesin. İzofluranı% 2 -% 3'lük normal seviyeye düşürün.
9. Mikroskop büyütme işlemini 10x veya 16x olarak değiştirin. Tibial sinirin pinöryumunu adım 3.8'de yapılan kesime proksimal olarak tanımlayın veya tibial sinirin daha proksimal bifurkasyonu durumunda, adım 3.8'de kesiğe proksimal olan hem medial hem de lateral plantar dalların epineuriumunu tanımlayın.
   NOT: Epineurium, içindeki sinir liflerine kıyasla daha beyaz ve sıkıdır, bu da daha sarı ve yumuşaktır.
10. Dikkatlice 8-0 yerleştirin naylon sütür (bakınız Malzeme Tablosu) proksimal sinir ucunun epinöryumundan epinöryumu cımbızla dikkatlice tutarak ve iğneyi sinir ile epineurium arasına yaklaşık 0.5 mm'lik bir ısırıkla koyarak. Dikişi çekin ve adım 3.7'de yapılan deri altı tünelinin sonunda iğne ile deri altından bir ısırık alın. Siniri yanal olarak deri altı tüneline dönüştürecek bir düğüm yapın.
    NOT: Her iki plantar dal da ortak bir epineurium'u paylaşıyorsa, bir dikiş yeterli olmalıdır. Her iki plantar dalın da kendi epineurium'u varsa, her bir epineurium ayrı ayrı sabitlenmelidir. Sütürü deriden geçirmekten kaçının; sadece deri altından düzeltin.
11. Sabitlenmiş sinir ucuna hizalanmış koyu renkli (tercihen mavi veya siyah 4-0 sütür) daha kalın bir dikiş yerleştirin, cilde nüfuz etmeyin. Dikişin cildin dışından görülebildiğinden emin olun. Pençeyi ve kasları hareket ettirdikten sonra sinirin yerinde kalıp kalmadığını kontrol edin. Dikiş uçlarını 4-0'da 8-0'dan biraz daha uzun bir dikiş ucu ile kesin Dikiş.
12. Mikroskobun büyütme oranını tekrar 6x olarak değiştirin. 8-0'ı kullanarak cildi intraepidermal dikişlerle kapatın Dikiş atın ve pamuklu çubukla cildinizi% 0.9 NaCl ile nazikçe temizleyin.

4. Ameliyat sonrası tedavi

1. Sıçanı temiz bir kafese, bir kağıt havlunun altına rahat bir pozisyonda yerleştirin. Oda soğuksa, kafesin bir kısmının altına bir ısı yastığı yerleştirin (hayvanın gerektiğinde ısıdan kaçabilmesi gerektiğinden, kafesin sadece bir kısmının altına). Yiyecek ve suya kolay erişim sağlayın.
2. Sternal yatmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar ameliyat sonrası sıçanı gözetimsiz bırakmayın. Sıçan, ameliyattan sonra anesteziden tamamen iyileştiğinde diğer hayvanların şirketine iade edilebilir. Bu genellikle 1 saat sonra ve sıçan normal yürüyüş düzenini ve davranışını sergilediğinde.
3. Ameliyattan 24 saat ve 48 saat sonra, ameliyat sonrası ağrıyı tedavi etmek için deri altından (karın bölgesi) 0.5 mg / kg karprofen dozu uygulayın.

5. Von Frey, arka pençelerin plantar tarafının test edilmesini sağlar

NOT: Von Frey testi (adım 5 ve 6) ameliyattan önce (başlangıç ölçümü için) ve ameliyattan 3 gün sonra yapılır.

1. Test ortamına alışmayı sağlamak için sıçanları temel ölçümden 1 hafta önce veya ameliyattan 2 hafta önce örgü tel alt kafeslere yerleştirin.
2. Ameliyattan en az 1 hafta önce temel önlemlerle başlayın. Ayrı günlerde üç bağımsız taban çizgisi ölçümünün yapıldığından emin olun.
3. Sıçanların ağ kablolu alt kafeslerde sakin olduklarını doğrulayın. Arka pençenin plantar yüzeyine dik logaritmik bir ölçekle bir dizi Von Frey monofilamenti uygulayın.
   1. Sural siniri (aşırı duyarlılık) uyarmak için, monofilamenti saç sınırına yakın lateral tarafa uygulayın. Ayak tabanlarına dokunmaktan kaçının, çünkü bunlar daha hassastır.
   2. Tibial siniri (hiposensitivite) uyarmak için, monofilamenti arka pençenin plantar yüzeyinin ortasına uygulayın. Monofilament en medial bölgeye uygulanırsa, bu aynı zamanda femoral sinirin bir dalı olan safen siniri de uyarabilir (Şekil 1). Ayak tabanlarına dokunmaktan kaçının.
4. 4 g monofilament ile başlayın. Monofilamente yeterli kuvvet uygulayın, böylece saç bükülür ve 3 s boyunca tutulur ve ardından hayvanın monofilament üzerindeki tepkilerini kontrol edin. Olumlu bir yanıt ani pençe çekilmesi, ani çırpınma, ani pençe yalama veya seslendirmedir. Bazı durumlarda, sıçan hareket eder ve monofilamenti bulmaya / saldırmaya çalışır.
5. Yukarı-aşağı yöntemiyle uyarana verilen cevaba bağlı olarak bir sonraki monofilamenti seçin²³. Örneğin, sıçan yanıt verirse, 2 g monofilament ile bir sonraki uyarın; sıçan cevap vermezse, 6 g monofilament ile uyarın, vb. Toplamda, reaksiyona bağlı olarak 5-10 uyaran uygulayın.

6. Von Frey'in nöroma bölgesi testi

1. Hayvanları günlük olarak temel önlemlerden en az 5-7 gün önce veya ameliyattan 2 hafta önce tutun. Hayvanların adım 6.2'de açıklandığı gibi tutulduğundan emin olun, böylece pozisyonda rahat olurlar.
2. Sıçanları burunları dirsek kıvrımına doğru bakacak şekilde tutun. Sıçan sağ elde tutulursa, sol arka pençeleri sağ başparmak ve işaret parmağı arasında serbestçe asılmalıdır (ilk web alanı). Sıçan sol elde tutulursa, sağ arka pençeleri sol baş parmak ve işaret parmağı arasında serbestçe asılmalıdır.
3. Ameliyattan en az 1 hafta önce temel önlemlerle başlayın. Ayrı günlerde üç bağımsız taban çizgisi ölçümünün yapıldığından emin olun.
4. Sıçanların tutulurken sakin ve rahat olduklarından emin olun. Başlangıçta, 15 g monofilamenti yavaşça açıkta kalan arka pençenin pretibial yüzeyine yerleştirin. Ameliyattan sonra, 15 g monofilamenti görünür dikiş üzerine yerleştirin (örneğin, nöromun bulunduğu yere). Monofilamente yeterli kuvvet uygulayın, böylece saç bükülür ve 1 s boyunca tutulur.
   1. Her uyarana verilen tepkiyi kaydedin. Reaksiyon seçenekleri arasında reaksiyon yok, yavaş geri çekilme, hızlı geri çekilme ve seslendirme bulunur. Yanıtı, tepki vermemek için 0 puan ve yavaş geri çekilme, hızlı geri çekilme veya seslendirme için bir puan olarak kaydedin.
5. Monofilamentin beş uygulamasından oluşan beş kümeyi, her uygulama arasında 2-3 s ve beş küme arasında 2-3 dakika veya daha fazla olacak şekilde tekrarlayın. Toplamda, her bir arka pençe, kaydedilen yanıtlarla monofilamentin 25 uygulamasına sahip olmalıdır.

7. Histoloji ve hazırlık için numune geri kazanımı

NOT: Histolojik inceleme ilk ameliyattan 12 hafta sonra yapılır.

1. Anesteziyi indükleyin ve hayvanları adım 2.2, 2.3 ve 2.4'te açıklandığı gibi hazırlayın.
2. İlk ameliyatta yapılan yara izi üzerinde bir neşter kullanarak nazikçe 2-3 cm'lik bir kesi yapın, ancak sinir yüzeysel olarak yerleştirildiği için çok derin kesmemeye dikkat edin.
3. Nöromun pozisyonunu belirleyin, nöromu ve siniri çevreleyen skar dokusundan arındırılmış olarak dikkatlice inceleyin ve hasat edilen nöromu fiksatif içine yerleştirin. Nöroma morfolojisini değerlendirmek için, doku tercihen Tork ve ^ark.18 tarafından tarif edildiği gibi parafin veya epoksi reçinesine uzunlamasına gömülür.
4. Dokuyu topladıktan sonra, sıçanları terminal anestezi altında (% 5 izofluran) kardiyak delinme veya kafa kesme yoluyla ötenazi yapın.
   NOT: Sıçanları öldürmeden önce nöromanın toplanması tavsiye edilir, çünkü o zaman nöromayı çevreleyen dokusundan in vivo olarak ayırt etmek daha kolaydır.

Sonuçlar

Nöroma bölgesinde yapılan değerlendirme, 15 g von Frey monofilamentinin uygulanmasına karşı artan duyarlılık göstermiştir. Başlangıçta, sıçanlar tipik olarak 15 g'lık bir monofilamentin 25 uygulamasının% 10-15'ine (±% 13) yanıt verdi. TNT cerrahisinden 1 hafta sonra yanıt oranı %45-50'ye (%24± yükselmiştir. Kontralateral tarafta, ameliyat sonrası yanıt sayısı başlangıçtakilere benzerdi (Şekil 2A). Sıçanların yaklaşık% 20'si ağrılı bir nöroma gelişt...

Tartışmalar

Protokoldeki kritik adımlar
TNT modeli, tibial sinirin kesilmesini ve sural sinir üzerindeki plantar hiperaljeziye ek olarak, nöromun duyarlılık testini sağlamak için lateral ve subkutan olarak pretibial bir bölgeye transpoze edilmesini içerir. TNT modelinde, nöromun yerinin araştırmacılar tarafından görülebilmesi anahtardır. Bu nedenle, bir albino sıçan suşu tercih edilir, çünkü deri altı dikişler deriden kolayca görülebilir ve dikişin rengi tercihen koyu mavi veya siyah o...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aesthesio	Linton Instrumentation	514007 until 514015	0.6 g until 15 g monofilaments
Carprofen	Local Veterinary Pharmacy	n/a	The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution
Cotton swabs	Nobamed	974255
Electrocautery	Fine Science Tools	18010-00
Ethanol 70%	Interchema BV	400406
Ethilon 4.0	Johnson & Johnson	1854G	IMPORTANT: the color should be blue or black
Ethilon 8.0	Johnson & Johnson	BV130-5
Isoflo, isoflurane Zoetis	Dechra Veterinary Products	B506
Mesh bottom cages	StoeltingCo	57816 and 57824
Micro forceps	Fine Science Tools	11251-35
Micro needle holder	Fine Science Tools	12076-12
Micro scissors	Fine Science Tools	15019-10
Micro tweezers	Fine Science Tools	11254-20
NaCl 0.9%	Trademed	H7 1000-FRE
Needle holder	Fine Science Tools	12004-16
Ophthalmic ointment	Local Veterinary Pharmacy	n/a	The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment
Scalpel	Fine Science Tools	10003-12
Scissors	Fine Science Tools	14001-12
Stereo surgical microscope	Leica	A60 F
Sterile sheet with hole	Evercare OneMed	1555-01
Surgical blade nr.15	Fine Science Tools	10015-00
Tweezers	Fine Science Tools	11617-12